一种离体肝脏灌流系统和离体肝脏灌流方法

摘要

本发明公开了一种离体肝脏灌流系统和离体肝脏灌流方法。该系统包括：灌流液温控槽；离体肝保存槽；用于向所述离体肝脏的门静脉输送灌流液的门静脉灌流通路；用于向所述离体肝脏的肝动脉输送灌流液的肝动脉灌流通路；用于将从离体肝脏流出的灌流液回收至灌流液温控槽中的灌流液回流通路；与离体肝保存槽相连、且用于收集胆汁的胆汁收集器。本发明利用两个通路分别从门静脉和肝动脉处对离体肝脏的进行灌流，适用于离体肝脏保存过程中存在的损伤防护，可显著缓解肝脏再灌注损伤，具有较强的可靠稳定性及重复性；本发明可以在低温、亚低温、常温条件下对离体肝脏进行有效保存，改变了现有技术需要在低温保存、不能满足边缘供肝保存要求的局限性。

说明书

技术领域

本发明属于肝移植技术领域，具体涉及一种离体肝脏灌流系统和离体肝脏灌流方法。

背景技术

肝移植是治疗终末期肝病最有效的方法，随着外科技术、新型免疫抑制剂及影像技术的不断发展，肝移植术后受者生存率不断提高。虽然心脏死亡器官捐献(Donationaftercardiacdeath，DCD)、劈离式供肝等应用扩大了供肝来源，但相对不断增加的肝移植等候名单，供肝来源仍然严重不足(O’MahonyCA,GossJA.Thefutureoflivertransplantation.TexHeartInstJ,2013,39(6):874-875.)。

目前临床供肝保存主要采用传统的静态冷保存(Staticcoldstorage，SCS)方法(GuibertEE,PetrenkoAY,BalabanCL,etal.Organperservation:currentconceptsandnewstrategiesforthenextdecade.TransfusMedHemother,2011,38(2):125-142.)，该方法具有操作简单、使用安全、价格便宜及保存效果较好等优点，但是该技术也存在诸如保存安全时限短，冷保存损伤等问题。这些应用缺陷严重限制了肝移植的供肝来源。

如何进一步扩大供肝池，降低边缘供肝如脂肪肝、老年肝移植风险，都受到缺乏完善器官保存技术这一瓶颈的制约。自1967年，Bezler教授首次提出机械灌注(Machineperfusion，MP)的概念(BelzerFO,AshbyBS,DunphyJE.24-hourand72-hourpreservationofcaninekidneys.Lancet,1967,2(7515):536-538.)。现已证实，MP相对于SCS能更好地保存离体肝脏，可将血管内红细胞及无氧代谢产物冲出(MonbaliuD,VekemansK,DeVosR,etal.Hemodynamic,biochemical,andmorphologicalcharacteristicsduringpreservationofnormalporcineliversbyhypothermicmachineperfusion.TransplantProc,2007,39(8):2652-2658.)，减少细胞损伤(SchlegelA,RougemontO,GrafR,etal.Protectivemechanismsofend-ischemiccoldmachineperfusioninDCDlivergrafts.JHepatol,2012,58(2):278-286.)，维持血管张力(TaylorMJ,BaicuSC.Currentstateofhypothermicmachineperfusionpreservationoforgans；theclinicalperspective.Cryobiology,2009,60(3Suppl):S20-S35.)，便于实时监测肝脏功能(ObaraH,MastsunoN,EnosawaS,etal.Pretransplantscreeningandevaluationoflivergraftviabilityusingmachineperfusionpreservationinporcinetransplantation.TransplantProc,2012,44(4):959-961.)。MP技术为扩展保存时限和扩大供肝池，甚至挽救非标准供肝提供了新的技术手段及策略。

目前，国际上正致力于供肝MP的研究开发，但其灌注系统均未市场化，还未实现临床应用；国内研究仍处于起步阶段。而缺乏适宜的多功能离体灌流系统装置，是对其进行系统深入的前临床基础研究的瓶颈。

发明内容

本发明提供了一种离体肝脏灌流系统，解决了现有静态冷保存技术不能满足边缘供肝保存要求的问题。

一种离体肝脏灌流系统，包括：

用于盛装灌流液的灌流液温控槽；

用于放置离体肝脏的离体肝保存槽；

连接在灌流液温控槽和离体肝保存槽之间、且用于向所述离体肝脏的门静脉输送灌流液的门静脉灌流通路；

连接在灌流液温控槽和离体肝保存槽之间、且用于向所述离体肝脏的肝动脉输送灌流液的肝动脉灌流通路；

连接在灌流液温控槽和离体肝保存槽之间、且用于将从离体肝脏流出的灌流液回收至灌流液温控槽中的灌流液回流通路；

与所述离体肝保存槽相连、且用于收集胆汁的胆汁收集器。

本发明的离体肝脏灌流系统模拟了肝脏在活体内的生存环境，利用门静脉灌流通路和肝动脉灌流通路这两个通路分别从门静脉和肝动脉处对离体肝脏的进行灌流，适用于离体肝脏保存过程中存在的损伤防护，可显著缓解肝脏再灌注损伤，有效保证了离体肝脏的生命活性；通过收集从离体肝脏流出的灌流液进行活性检测、或直接测定灌流液的生物活性变化或生化反应，可以进行药理学研究或新型灌流液的开发研究，具有较强的可靠稳定性及重复性。

本发明的离体肝脏灌流系统可以在低温(4～6℃)、亚低温(20～25℃)、常温(36～37℃，即体温)条件下对离体肝脏进行有效保存，改变了现有技术需要在低温条件下保存离体肝脏的局限性。

本发明的离体肝脏灌流系统中设置有灌流液回流通路，如此可对灌流液进行回收利用，提高灌流液的利用率。

本发明的离体肝脏灌流系统中设置有胆汁收集器，收集胆汁进行动态监测可以实时反映肝脏的代谢功能，利于临床医师对离体供肝进行质量评价。

作为优选，所述门静脉灌流通路包括连接在灌流液温控槽和离体肝保存槽之间的门静脉进液管，所述门静脉进液管上设有：

与所述灌流液温控槽相连、用于除去灌流液中的气泡的第一除泡模块；

与所述第一除泡模块相连、用于驱使灌流液进入门静脉进液管的门静脉微泵；

与所述门静脉微泵相连、用于监测门静脉进液管内灌流液压力和流速的第一监测模块；

用于联通门静脉进液管和离体肝脏门静脉的第一联接件；

所述离体肝脏灌流系统还包括用于接收所述第一监测模块输出的信号、并根据该信号调节门静脉进液管内灌流液压力和流速的第一控制模块。

在门静脉微泵的作用下，灌流液温控槽中的灌流液进入门静脉进液管，经第一除泡模块除泡后从第一静脉留置针处进入离体肝脏门静脉；在灌流液到达第一静脉留置针前，第一监测模块检测灌流液的压力和流速，并将检测到的信息发送给第一控制模块，第一控制模块将检测值与预设值作对比，并通过控制门静脉微泵的工作频率实时调节检测值与预设值相一致。

设置第一联接件便于加强门静脉进液管与离体肝脏门静脉之间的固定联接，防止门静脉进液管在灌流过程中滑落。

作为优选，所述第一联接件为螺旋形管或静脉留置针。螺旋形管适用于体积较大的离体肝脏，因其门静脉和肝动脉较粗；而静脉留置针则适用于体积较小的离体肝脏。

作为优选，所述门静脉进液管上还设有处于第一监测模块下游的第一采样管。设置第一采样管便于及时、随时对门静脉进液管中的灌流液进行采样检测，保证灌流液的品质。

作为优选，所述第一除泡模块可以选用气液分离器、排气阀等。

本发明中，除了与离体肝脏的连接位置不一样外，肝动脉灌流通路的结构组成与门静脉灌流通路的组成相一致。

作为优选，所述肝动脉灌流通路包括连接在灌流液温控槽和离体肝保存槽之间的肝动脉进液管，所述肝动脉进液管上设有：

与所述灌流液温控槽相连、用于除去灌流液中的气泡的第二除泡模块；

与所述第二除泡模块相连、用于驱使灌流液进入肝动脉进液管的肝动脉微泵；

与所述肝动脉微泵相连、用于监测肝动脉进液管内灌流液压力和流速的第二监测模块；

用于联通门静脉进液管和离体肝脏肝动脉的第二联接件；

所述离体肝脏灌流系统还包括用于接收所述第二监测模块输出的信号、并根据该信号调节肝动脉进液管内灌流液压力和流速的第二控制模块。

同样地，所述第二联接件为螺旋形管或静脉留置针。

同样地，肝动脉进液管上也设有处于第二监测模块下游的第二采样管。

本发明中，所述离体肝脏灌流系统还包括与所述灌流液温控槽相连、用于向灌流液中充氧的氧合模块。氧合模块可使灌流液充分携氧，为离体肝脏提供氧气。

作为优选，所述氧合模块可以选用中空纤维膜式氧合器、板式氧合器等。

作为优选，所述灌流液回流通路包括联通离体肝保存槽和灌流液温控槽的灌流液回收管，该灌流液回收管上设有回流微泵；所述灌流液回收管的进液端带有联通灌流液回收管和离体肝脏肝静脉的第三联接件。

同样地，所述第三联接件为螺旋形管或静脉留置针。

同时，作为优选，所述灌流液回收管上设有第三采样管。第三采样管用于采集从离体肝脏中流出的灌流液，便于检测经内循环后灌流液中各生化指标的含量，以便及时了解离体肝脏的健康情况。

本发明还提供了一种离体肝脏灌流方法，该离体肝脏灌流方法是使用本发明的离体肝脏灌流系统实现的，包括：

(1)将离体肝脏置入离体肝保存槽中，将灌流液温控槽内的灌流液温度调节至4～6℃、20～25℃或36～37℃；

(2)接通门静脉灌流通路、肝动脉灌流通路和灌流液回流通路，使门静脉灌流通路内灌流液流速维持在40～200ml/min，灌流液压力维持在4～10mmHg；使肝动脉灌流通路内灌流液流速维持在10～100ml/min，灌流液压力维持在20～30mmHg；

(3)灌流过程中，采用胆汁收集器收集胆汁。

具体地，所述离体肝脏灌流方法包括：

(1)将离体肝脏置入离体肝保存槽中，将灌流液温控槽内的灌流液温度调节至4～6℃、20～25℃或37℃，温度调节过程中，氧合模块持续向灌流液温控槽中充氧；

(2)开启门静脉微泵、第一除泡模块和第一监测模块，开启肝动脉微泵、第二除泡模块和第二监测模块，使灌流液分别进入门静脉进液管和肝动脉进液管；

第一监测模块、第二监测模块分别监测门静脉进液管和肝动脉进液管内灌流液的压力和流速，根据第一监测模块的监测数据，第一控制模块实时控制门静脉进液管内灌流液流速在40～200ml/min，灌流液压力在4～10mmHg；根据第二监测模块的监测数据，第二控制模块实时控制肝动脉进液管内灌流液流速在10～100ml/min，灌流液压力在20～30mmHg；

优选地，第一控制模块实时控制门静脉进液管内灌流液压力在80～150ml/min，灌流液压力在6～8mmHg；

第二控制模块实时控制肝动脉进液管内灌流液压力在40～80ml/min，灌流液压力在20～25mmHg；

(3)灌流开始时即开启回流微泵，使灌流液从门静脉和肝动脉进入离体肝脏、并在离体肝脏内循环后从肝静脉流出、进入灌流液回收管，灌流液经离体肝脏回流至灌流液温控槽内，循环使用；

(4)灌流过程中，采用胆汁收集器收集胆汁。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明的离体肝脏灌流系统模拟了肝脏在活体内的生存环境，利用门静脉灌流通路和肝动脉灌流通路这两个通路分别从门静脉和肝动脉处对离体肝脏的进行灌流，适用于离体肝脏保存过程中存在的损伤防护，可显著缓解肝脏再灌注损伤，有效保证了离体肝脏的生命活性；通过收集从离体肝脏流出的灌流液进行活性检测、或直接测定灌流液的生物活性变化或生化反应，可以进行药理学研究或新型灌流液的开发研究，具有较强的可靠稳定性及重复性；

(2)本发明的离体肝脏灌流系统可以在低温、亚低温、常温条件下对离体肝脏进行有效保存，改变了现有技术需要在低温条件下保存离体肝脏的局限性；

(3)本发明的离体肝脏灌流系统中设置有灌流液回流通路，如此可对灌流液进行回收利用，提高灌流液的利用率；

(4)本发明的离体肝脏灌流系统中设置有胆汁收集器，便于动态监测肝脏代谢功能。

附图说明

图1为本发明一种离体肝脏灌流系统的结构示意图；

图2A为4℃下采用生理盐水作为灌流液或保护液时、灌流或保护过程中灌流液或保护液中ALT浓度的比较图；

其中，ALT(U/L)表示谷丙转氨酶的浓度(U/L)，ALT0、ALT1、ALT3、ALT6分别表示在灌流过程中的0小时、1小时、3小时、6小时采集的灌流液样品，salineSCS表示采用生理盐水作为保存液对离体肝脏进行静态保存，salineMP表示实施例2采用生理盐水作为灌流液对离体肝脏进行灌流，下同；

图2B为4℃下采用生理盐水作为灌流液或保护液时、灌流或保护过程中灌流液或保护液中AST浓度的比较图；

其中，AST(U/L)表示谷草转氨酶的浓度(U/L)，AST0、AST1、AST3、AST6分别表示在灌流过程中的0小时、1小时、3小时、6小时采集的灌流液样品，下同；

图2C为4℃下采用生理盐水作为灌流液或保护液时、灌流或保护过程中灌流液或保护液中LDH浓度的比较图；

其中，AST(U/L)表示乳酸脱氢酶的浓度(U/L)，LDH0、LDH1、LDH3、LDH6分别表示在灌流过程中的0小时、1小时、3小时、6小时采集的灌流液样品，下同；

图3A为4℃下采用UW液作为灌流液或保护液时、灌流或保护过程中灌流液或保护液中ALT浓度的比较图；

其中，UWSCS表示采用生理盐水作为保存液对离体肝脏进行静态保存，UWMP表示实施例2采用生理盐水作为灌流液对离体肝脏进行灌流，下同；

图3B为4℃下采用UW液作为灌流液或保护液时、灌流或保护过程中灌流液或保护液中AST浓度的比较图；

图3C为4℃下采用UW液作为灌流液或保护液时、灌流或保护过程中灌流液或保护液中LDH浓度的比较图；

图4A为4℃下采用HTK液作为灌流液或保护液时、灌流或保护过程中灌流液或保护液中ALT浓度的比较图；

其中，HTKSCS表示采用生理盐水作为保存液对离体肝脏进行静态保存，HTKMP表示实施例2采用生理盐水作为灌流液对离体肝脏进行灌流，下同；

图4B为4℃下采用HTK液作为灌流液或保护液时、灌流或保护过程中灌流液或保护液中AST浓度的比较图；

图4C为4℃下采用HTK液作为灌流液或保护液时、灌流或保护过程中灌流液或保护液中LDH浓度的比较图；

图5A为4℃下实施例2和对比例1采用生理盐水作为灌流液或保护液后肝脏组织中MDA的含量；

MDA(nmol/mgprot)表示丙二醛的浓度(nmol/mgprot)，SCS表示对离体肝脏进行静态保存，MP表示采用实施例1的灌流系统对离体肝脏进行灌流，下同；

图5B为4℃下实施例2和对比例1采用生理盐水作为灌流液或保护液后肝脏组织中MPO的含量；

MPO(u/g)表示髓过氧化物酶的浓度(u/g)，下同；

图5C为4℃下实施例3和对比例2采用生理盐水作为灌流液或保护液后肝脏组织中MDA的含量；

图5D为4℃下实施例3和对比例2采用生理盐水作为灌流液或保护液后肝脏组织中MPO的含量；

图5E为4℃下实施例4和对比例3采用生理盐水作为灌流液或保护液后肝脏组织中MDA的含量；

图6A为20℃下采用HTK液作为灌流液或保护液时、灌流或保护过程中灌流液或保护液中ALT浓度的比较图；

图6B为20℃下采用HTK液作为灌流液或保护液时、灌流或保护过程中灌流液或保护液中AST浓度的比较图；

图6C为20℃下采用HTK液作为灌流液或保护液时、灌流或保护过程中灌流液或保护液中LDH浓度的比较图；

图6D为20℃下实施例5和对比例4采用HTK液作为灌流液或保护液后肝脏组织中MPO的含量；

其中，MPO(U/g组织湿重)表示髓过氧化物酶的浓度(U/g组织湿重)，下同；

图7A为37℃下采用HTK液作为灌流液或保护液时、灌流或保护过程中灌流液或保护液中ALT浓度的比较图；

图7B为37℃下采用HTK液作为灌流液或保护液时、灌流或保护过程中灌流液或保护液中AST浓度的比较图；

图7C为37℃下采用HTK液作为灌流液或保护液时、灌流或保护过程中灌流液或保护液中LDH浓度的比较图；

图7D为37℃下实施例6和对比例5采用HTK液作为灌流液或保护液后肝脏组织中MPO的含量。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步的详细说明。

实施例1离体肝脏灌流系统

如图1所示，本实施例一种离体肝脏灌流系统，包括用于盛装灌流液的灌流液温控槽1和用于放置离体肝脏的离体肝保存槽2，灌流液温控槽1和离体肝保存槽2之间设有门静脉灌流通路、肝动脉灌流通路和灌流液回流通路。

其中，灌流液温控槽1包括水浴槽3以及安装在水浴槽3内、用于盛装灌流液的内槽4。

由图1可见，内槽4上开设有进气口，氧合模块5通过该进气口与内槽4相连，氧合模块5用于向灌流液中充氧，以便灌流液能够为离体肝脏提供足够的氧气。

氧合模块5可以选用中空纤维膜式氧合器、板式氧合器等。

内槽4上还开设有第一出液口6和第二出液口7，离体肝保存槽2上则相应设有第一进液口8和第二进液口9；门静脉灌流通路即设置在第一出液口6和第一进液口8之间，肝动脉灌流通路即设置在第二出液口7和第二进液口9之间。

其中，门静脉灌流通路包括联通第一出液口6和第一进液口8的门静脉进液管10，门静脉进液管10上依次安装有第一除泡模块11、门静脉微泵12、第一流量计13、第一压力计14和第一采样管15；门静脉进液管10的出液端延伸入离体肝保存槽2中，并带有用于联通门静脉进液管10和离体肝脏门静脉的第一联接件(图中省略)。

显然地，本实施例中的门静脉进液管10是由几根短管顺次连接而成的，在相邻两根短管的连接处安装了上述的第一除泡模块11、门静脉微泵12、第一流量计13和第一压力计14；第一采样管15则是在门静脉进液管10上开设了采样口然后在采样口处安装上的，第一采样管15上带有阀门。

第一除泡模块11用于除去灌流液中的气泡，门静脉微泵12用于驱使灌流液进入门静脉进液管10，第一流量计13和第一压力计14分别用于监测门静脉进液管10内灌流液的压力和流速。

本实施例还设有第一控制模块，第一控制模块用于接收第一流量计13和第一压力计14输出的信号、并根据该信号通过控制门静脉微泵12的工作频率，进而调节门静脉进液管10内灌流液压力和流速。

相同地，肝动脉灌流通路包括联通第二出液口7和第二进液口9的肝动脉进液管16，肝动脉进液管16上依次安装有第二除泡模块17、肝动脉微泵18、第二流量计19、第二压力计20和第二采样管21，肝动脉进液管16的出液端延伸入离体肝保存槽2中，并带有用于联通肝动脉进液管16和离体肝脏肝动脉的第二联接件(图中省略)。

肝动脉灌流通路中，肝动脉进液管16的布管方式、其他模块的结构及各模块在肝动脉进液管16上的安装方式均与上述门静脉灌流通路相一致，肝动脉进液管16上各模块所起到的作用也与门静脉灌流通路中的相应模块一致。

第一除泡模块11、第二除泡模块17可以选用气液分离器、排气阀等；门静脉微泵12、肝动脉微泵18采用蠕动泵；根据离体肝脏的体积大小(或门静脉、肝动脉的粗细)，第一联接件、第二联接件可以采用螺旋形管或静脉留置针。

离体肝保存槽2上开设有第三出液口22，内槽4上开设有与之相应的回流口23，灌流液回流通路即设置在第三出液口22和回流口23之间。

本实施例中，灌流液回流通路包括联通第三出液口22和回流口23的灌流液回收管24，灌流液回收管24的进液端延伸入离体肝保存槽2中、并带有用于联通灌流液回收管24和离体肝脏肝静脉的第三联接件(图中省略)，灌流液回收管24上设有第三采样管25和回流微泵26。

本实施例中，根据肝静脉的粗细，第三联接件可以采用螺旋形管或静脉留置针；回流微泵26也采用蠕动泵；第三采样管25也是在灌流液回收管24上开设了采样口然后在采样口处安装上的，第三采样管25上也带有阀门。

如图1所示，离体肝保存槽2还设有胆汁出口27，该胆汁出口27处安装有胆汁收集管28，胆汁收集管28的进液端延伸入离体肝保存槽2中，并带有与胆囊相连的第四联接件(图中省略)，胆汁收集管28的出液端则与胆汁收集槽29相连。

本实施例中，第四联接件也可以根据不同情况采用螺旋形管或静脉留置针。

实施例2采用生理盐水作为灌流液进行离体肝脏灌流

本实施例以家猪为例，检验实施例1的离体肝脏灌流系统对家猪离体肝脏的保存效果。

麻醉家猪，十字切口入腹并消毒，分离并游离腹主动脉、下腔静脉、门静脉，置管后用肝素化生理盐水和肾宝液对门静脉和腹主动脉进行灌流；剪开胆囊，胆总管处离断，打开膈肌，入胸腔离断胸腹主动脉，离断胃肝周韧带，取下供肝；修肝后利用实施例1的离体肝脏灌流系统进行体外保存。

利用实施例1的离体肝脏灌流系统对家猪离体肝脏进行灌流的方法，包括：

(1)将离体肝脏置入离体肝保存槽中，将灌流液(本实施例为生理盐水，Saline)温控槽内的灌流液温度调节至4℃，温度调节过程中，氧合模块持续向灌流液温控槽中充氧；

(2)开启门静脉微泵、第一除泡模块、第一流量计和第一压力计，开启肝动脉微泵、第二除泡模块、第二流量计和第二压力计，使灌流液分别进入门静脉进液管和肝动脉进液管；

第一流量计和第二流量计分别监测门静脉进液管和肝动脉进液管内灌流液的流速，第一压力计和第二压力计分别监测门静脉进液管和肝动脉进液管内灌流液的压力；

根据第一流量计和第一压力计的监测数据，第一控制模块实时控制门静脉进液管内灌流液压力在80～150ml/min，灌流液压力在6～8mmHg；根据第二流量计和第二压力计的监测数据，第二控制模块实时控制肝动脉进液管内灌流液压力在40～80ml/min，灌流液压力在20～25mmHg；

(3)灌流开始时即开启回流微泵，使灌流液在离体肝脏内循环后从肝静脉流出、进入灌流液回收管，灌流液经灌流液净化模块净化回流至灌流液温控槽内，循环使用；

(4)灌流过程中，采用胆汁收集管和胆汁收集槽收集胆囊分泌的胆汁。

对比例1传统的静态冷保存方法

采用与实施例2相同的方法获取家猪离体肝脏，将家猪离体肝脏置入生理盐水中，于4℃下保存。

检测例1

实施例2连续灌流6小时(对比例1静态保存6小时)，并在灌流过程的0小时、1小时、3小时、6小时分别从第三采样管处采集2mL灌流液，检测灌流液中ALT、AST、LDH等生化指标；比较实施例2和对比例1对离体肝脏的保护功效，比较结果见图2A、图2B、图2C。

由图2A、图2B、图2C可见，本实施例的离体肝脏灌流方法在灌流过程中，灌流液中ALT、AST和LDH这三个生化指标均比传统的静态冷保存方法要低(仅约为对比例1的51.4％、42.8％、57.1％)，表明本发明的离体肝脏灌流系统及方法能有效保持离体肝脏的功能活性，显著缓解肝脏再灌注损伤。

实施例3采用UW作为灌流液进行离体肝脏灌流

采用与实施例2相同的方法对家猪离体肝脏进行灌流，但采用UW液作为灌流液。

对比例2

采用与实施例2相同的方法获取家猪离体肝脏，将家猪离体肝脏置入UW液中，于4℃下保存。

检测例2

采用与检测例1相同的方法，比较实施例3和对比例2的保存方法对离体肝脏的保护功效，比较结果见图3A、图3B、图3C。

由图3A、图3B、图3C可见，采用UW液作为灌流液时，本发明的离体肝脏灌流系统和灌流方法，在灌流的初始阶段，灌流液中ALT、AST和LDH这三个生化指标虽然比传统的静态冷保存方法要高，但随着灌流时间延长，灌流液中的各指标逐渐下降、比传统的静态冷保存方法要低。表明本发明的离体肝脏灌流系统和灌流方法比传统的静态冷保存方法更适用于对离体肝脏进行较长时间的保存。

实施例4采用HTK作为灌流液进行离体肝脏灌流

采用与实施例2相同的方法对家猪离体肝脏进行灌流，但采用HTK液作为灌流液。

对比例3

采用与实施例2相同的方法获取家猪离体肝脏，将家猪离体肝脏置入HTK液中，于4℃下保存。

检测例3

采用与检测例1相同的方法，比较实施例4和对比例3的保存方法对离体肝脏的保护功效，比较结果见图4A、图4B、图4C。

由图4A、图4B、图4C可见，采用HTK液作为灌流液时，本发明的离体肝脏灌流系统和灌流方法，在灌流的初始阶段，灌流液中ALT、AST和LDH这三个生化指标虽然比传统的静态冷保存方法要高，但随着灌流时间延长，传统的静态冷保存方法ALT、AST和LDH这三个生化指标急剧升高。表明本发明的离体肝脏灌流系统和灌流方法比传统的静态冷保存方法更适用于对离体肝脏进行较长时间的保存。

检测例4

实施例2、实施例3、实施例4分别灌流6小时，然后切除部分肝脏组织，分别检测肝脏组织中MDA(丙二醛)和MPO(髓过氧化物酶)的含量；对比例1、对比例2、对比例3静态保存6小时，然后切除部分肝脏组织，分别检测肝脏组织中MDA和MPO的含量；检测结果分别见图5A、图5B、图5C、图5D和图5E。

由图5A和图5B可见，利用实施例1的灌流系统、采用Saline对离体肝脏进行灌流后，经离体肝脏内循环后肝脏组织中MDA和MPO的含量比相应静态保存液要低(分别仅约为对比例1的39.3％、72.2％)。

由图5C和图5D可见，利用实施例1的灌流系统、采用UW液对离体肝脏进行灌流后，经离体肝脏内循环后肝脏组织中MDA和MPO的含量比相应静态保存液要低(分别仅约为对比例2的38.7％、76.5％)。

由5E可见，利用实施例1的灌流系统、采用HTK液对离体肝脏进行灌流后，经离体肝脏内循环后肝脏组织中MDA的含量比相应静态保存液要低(仅约为对比例3的42.9％)。

以上检测结果均表明无论采用何种灌流液，本发明的离体肝脏灌流系统和灌流方法都能显著抑制氧化损伤及中性粒细胞浸润。

实施例5在亚低温条件下进行灌流

采用与实施例2相同的方法对家猪离体肝脏进行灌流，但将灌流液温控槽内的灌流液(HTK液)温度调节至20℃。

对比例4

采用与实施例2相同的方法获取家猪离体肝脏，将家猪离体肝脏置入HTK液中，于20℃下保存。

检测例5

采用与检测例1相同的方法，比较实施例5和对比例4的保存方法对离体肝脏的保护功效，比较结果见图6A、图6B、图6C。

采用与检测例4相同的方法，检测经实施例5和对比例4保存后肝脏组织中MPO的含量，比较结果见图6D。

由图6A、图6B、图6C可见，在20℃下采用HTK液作为灌流液时，本发明的离体肝脏灌流系统和灌流方法，在整个灌流过程中，灌流液中ALT、AST和LDH这三个生化指标均比对比例4要低(分别仅为对比例4的约28.6％、25％、18.8％)。

由图6D可见，在20℃下采用HTK液作为灌流液时，经本发明的离体肝脏灌流系统和灌流方法保存的离体肝脏组织中MPO的含量远远低于对比例4(仅约为对比例4的7％)。

上述检测结果表明本发明的离体肝脏灌流系统和灌流方法在亚低温条件下也能有效保存离体肝脏，保存效果大大优于传统的静态保存方法。