一种检测汞离子的新型罗丹明荧光探针及其制备方法

摘要

本发明涉及一种检测汞离子的新型罗丹明荧光探针及其制备方法，属于荧光探针及其制备方法技术领域。本发明公开了罗丹明荧光探针的结构。本发明还公开了罗丹明荧光探针的制备方法，将罗丹明B与水合肼在乙醇中回流反应生成罗丹明酰肼；然后与苯基乙二醛在乙醇中回流反应，经重结晶得到席夫碱；再经硼氢化钠还原生成荧光探针。本发明提供的荧光探针合成步骤简单、收率高，对汞离子的选择性好、响应时间快，可在生理环境条件下工作，具有应用于生物荧光成像的前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测汞离子的罗丹明荧光探针及其制备方法，属于荧光探针及其 制备方法技术领域。

背景技术

汞离子是一种典型的重金属离子，具有极强的毒性。汞离子一旦进入水环境，就会 被细菌类微生物转化为有机的甲基汞，并在生物体内(如鱼类)快速积累从而进入食物链。 甲基汞破坏人的神经系统，引起大脑受损、认知和运动紊乱等，震惊世界的水俣病就是有机 汞中毒的一种类型。因此，寻找能够快速、准确检测汞离子的方法具有重要意义。

罗丹明类荧光染料具有光稳定性好、长波长红光发射、量子产率高、水溶性好和适 用的pH范围较宽等优异的光物理和光化学性能，已成为构建荧光探针最理想的报告基团之 一。一些罗丹明类荧光探针及其在汞离子检测方面的应用已被报道，如CN104530064A和CN 104479671A，但如本发明所示的罗丹明荧光探针结构未见公开。本发明提供的罗丹明荧光 探针合成步骤简单、易于提纯、收率高，对汞离子的选择性好，可在生理环境条件下工作，具 有应用于生物荧光成像的前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种罗丹明B衍生物及其制备方法和在汞离子检测方面的应 用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种罗丹明B衍生物R，其结构如下所示：

本发明合成罗丹明B衍生物R的流程式

罗丹明B衍生物R的制备方法，按照以下步骤进行：

将罗丹明B酰肼和苯基乙二醛溶解在溶剂中，罗丹明B酰肼与苯基乙二醛的摩尔比 为1:1.2,加热回流至反应完全，冷却析出固体，过滤即得到席夫碱。将席夫碱溶于四氢呋喃 中，缓慢加入硼氢化钠，席夫碱与硼氢化钠的摩尔比为1:2,减压除去溶剂，重结晶得罗丹明 B衍生物R。

具体制备步骤包括：

(1)罗丹明B酰肼的制备

将罗丹明B和水合肼溶解在溶剂中，加热回流至反应完全，冷却加水析出固体，过 滤得浅粉色粗产品，干燥、重结晶得罗丹明B酰肼。

所述的溶剂为甲醇或乙醇，重结晶所用的溶剂为石油醚和乙酸乙酯。

(2)席夫碱的制备

将罗丹明B酰肼和苯基乙二醛溶解在溶剂中，罗丹明B酰肼与苯基乙二醛的摩尔比 为1:1.2,加热回流至反应完全，冷却析出固体，过滤即得到席夫碱。

所述的溶剂为甲醇或乙醇。

(3)罗丹明B衍生物R的制备

将席夫碱溶解于四氢呋喃中，缓慢加入硼氢化钠，室温搅拌2h，反应完全后除去溶 剂，重结晶得到罗丹明B衍生物R。

所述的席夫碱与硼氢化钠摩尔比为1:2,重结晶所用的溶剂为石油醚和乙酸乙酯。

罗丹明B衍生物R的应用：所述的罗丹明B衍生物R可作为荧光探针。所述的罗丹明B 衍生物R可作为荧光探针实现汞离子的检测。所述的罗丹明B衍生物R可作为荧光探针用于 活细胞内汞离子的检测。

本发明所具有的优点：本发明提供的罗丹明B衍生物R，合成步骤简单，反应时间 短，易于提纯，收率高。该化合物是汞离子的荧光增强型探针，对汞离子具有高度专一性，可 在生理环境条件下工作，具有应用于生物荧光成像的前景。

附图说明

图1为本发明实施例合成罗丹明B衍生物R的流程图。

图2为本发明实施例合成的席夫碱的核磁共振氢谱。

图3为本发明实施例合成的席夫碱的质谱图。

图4为本发明实施例合成的罗丹明B衍生物R的核磁共振氢谱。

图5为本发明实施例合成的罗丹明B衍生物R的质谱图。

图6为本发明实施例合成的罗丹明B衍生物R的单晶结构图。

图7为本发明实施例合成的罗丹明B衍生物R作为荧光探针的最佳醇/水比的测试。

图8为本发明实施例合成的罗丹明B衍生物R作为荧光探针的pH适用范围的测试。

图9为本发明实施例合成的罗丹明B衍生物R作为荧光探针对汞离子选择性的测 试。

图10为本发明实施例合成的罗丹明B衍生物R作为荧光探针对汞离子的荧光滴定 的测试。

图11为本发明实施例合成的罗丹明B衍生物R作为荧光探针对汞离子络合的工作 曲线图。

图12为本发明实施例合成的罗丹明B衍生物R作为荧光探针对汞离子在细胞体内 进行的荧光成像实验。(a)加入荧光探针R细胞孵育20min后在荧光显微镜下的成像图，(b) 加入汞离子后孵育20min细胞在荧光显微镜下的成像图，(b)图中的白色部分在彩图中为红 色荧光的细胞。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步的详细说明。

实施例1

荧光探针分子罗丹明B衍生物R的制备，具体路线图见下式。

本发明合成罗丹明B衍生物R的流程式

(1)罗丹明B酰肼的制备

在50mL圆底烧瓶中加入罗丹明B(4.79g，0.01mol,5mL80％水合肼，30mL乙醇，混 合溶液搅拌回流4-5h，冷却后加水析出固体，过滤得到粗产品，干燥后用乙酸乙酯/石油醚 重结晶得到浅粉色粉末固体，即罗丹明B酰肼，收率92％。

(2)席夫碱的制备

在25mL圆底烧瓶中加入罗丹明B酰肼(2.28g，0.005mol)，一水合苯基乙二醛 (1.02g，0.006mol)，无水甲醇30mL，搅拌回流3h后，过滤、干燥得席夫碱，收率95％。其核磁 共振氢谱(¹HNMR)图和质谱(ESI-MS)图分别见图2和图3。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ:8.40(s, 1H),7.89-8.04(m,3H),7.17-7.59(m,5H),6.28-6.54(m,6H),3.35(q,J＝6.8Hz,8H),1.18 (t,J＝6.8Hz,12H).ESI-MS(质荷比):[C₃₆H₃₆N₄O₃+H⁺]:理论值为573.28，实测值为573.58.

(3)罗丹明B衍生物R的制备

在25mL圆底烧瓶中加入席夫碱(0.57g，0.001mol)，10mL四氢呋喃，分批缓慢加入 硼氢化钠(0.08g，0.002mol)，常温搅拌2h，旋干溶剂，水洗，萃取，用乙酸乙酯石油醚重结晶 得罗丹明B衍生物R，收率82％。其¹HNMR谱图、质谱图和单晶结构图分别见图4、图5和图6。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:7.98(d,J＝6.8Hz1H),7.53-7.56(m,2H),7.11-7.21(m,6H),6.29- 6.66(m,6H),5.46(s，1H)，4.51-4.69(m,2H),3.36(q,J＝7.2Hz,8H),2.47-2.49(m,2H), 1.18(t,J＝7.2Hz,12H).ESI-MS(质荷比):[C₃₆H₄₀N₄O₃+H⁺]:理论值为577.31，实测值为 577.63.

实施例2

罗丹明B衍生物R的不同醇/水比的荧光光谱变化

取实施例1制备的罗丹明B衍生物R溶于乙醇中，制成100μM储备液。分别配制不同 比例的乙醇和水比例的10μM荧光探针溶液，依次加入0.5当量的汞离子，溶液的荧光强度变 化如图7所示。从图7可以看出，溶液的荧光强度随醇/水比的增大而逐渐增强，但当醇/水比 大于6：4的时，溶液荧光强度的增强趋于平缓。因此，醇/水比6：4为最佳测试条件。

实施例3

罗丹明B衍生物R在不同pH的荧光光谱变化

取实施例2配制的储备液分别配制不同pH的10μM荧光探针溶液，溶液的荧光强度 变化如图8所示。从图8可以看出，在pH＜6的范围内，随着酸性的增加，荧光强度明显增强； 在pH6-9范围内,荧光强度基本处于恒定，说明该探针可适用于生物环境条件下的测试。

实施例4

罗丹明B衍生物R荧光探针对汞离子的选择性

金属离子溶液的配制：所有的金属离子溶液都由它们的硝酸盐配制，避光保存备 用。

取实施例2配制的储备液配制成10μM的荧光探针缓冲溶液(pH＝7，10mM4-羟乙基 哌嗪乙磺酸的水溶液(HEPES))，分别加入等量的金属离子(Hg²⁺,Fe³⁺,Co²⁺,Mg²⁺,Zn²⁺,Al³⁺, Ni²⁺,Cr³⁺,Mn²⁺,Ca²⁺,Li⁺,Cd²⁺,Cu²⁺)；立即以520nm为激发光检测溶液的发射光谱变化，结果 见图9。从图9可以看出，其它金属离子对化合物R的荧光几乎没有影响，而汞离子溶液的加 入使化合物R的荧光显著增强。

实施例5

荧光探针R对不同浓度汞离子的荧光光谱变化

取实施例2配制的储备液配制成10μM的荧光探针缓冲溶液(pH＝7，10mMHEPES)， 加入不同当量(0-5.5eq)的Hg²⁺标准溶液，以520nm为激发光测量其荧光性质，荧光光谱图见 图10。从图10可以看出，探针在582nm处荧光强度最大；荧光探针R溶液的荧光峰值随着Hg²⁺加入当量的增加荧光逐渐增强，到达最大强度时，荧光强度增加了约100倍。图11的工作曲 线显示拐点在0.5，表明荧光探针R和汞离子为1：1的配比关系。

实施例6

荧光探针R对细胞内汞离子的荧光成像

我们将本发明的荧光探针R应用于人体胃癌细胞(MGC-803)中的汞离子进行荧光 成像应用。具体结果见图12。具体操作步骤如下：将20μM探针溶液加入到育有MGC-803细胞 的培养液中在二氧化碳培养箱中培养20min后用荧光显微镜进行成像。首先用绿光进行激 发观察未加入汞离子的荧光成像情况，此时观察不到荧光发射。然后，向体系中加入20μM汞 离子的水溶液，培养20min后用绿光进行激发可以观察到明显的红光发射，图12(b)图中的 白色部分在彩图中为红色荧光的细胞，说明此荧光探针可以对活细胞内的汞离子进行荧光 成像。