一种适用于现场检测的可卡因快速定量检测方法

摘要

本发明公开一种适用于现场检测的可卡因快速定量检测方法，包括以下步骤：(1)制备纸基检测装置：选取纸张作为检测基底，以疏水壁垒在纸张表面圈定亲水检测区域，共价偶联水溶性上转换荧光纳米材料和适配体ACA-1；(2)选取金纳米颗粒并在其表面修饰适配体ACA-2，得到AuNPs-ACA-2溶液；(3)AuNPs-ACA-2溶液的浓度优化；(4)配制可卡因的标准溶液；(5)绘制可卡因检测标准曲线；(6)待测体液中可卡因浓度的测定。本发明解决了可卡因检测领域亟待解决的快速定量检测的问题，实现了体液样品中可卡因浓度的快速、定量、高灵敏检测，定量检测灵敏度可达0.05μM。

说明书

技术领域

本发明属于可卡因快速定量检测技术领域，具体涉及一种基于上转换荧光纳米材料的快 速、定量、高灵敏检测可卡因的纸基检测方法。

背景技术

毒品滥用是目前危害人类最严重的社会问题之一，可卡因是各类毒品中应用最广泛的一 种。可卡因滥用会对人体产生很大威胁，使得人类心率加快，呼吸急促，甚至出现震颤、痉 挛、惊厥等现象，对人类安全、社会稳定和世界和平构成巨大威胁。因此，研究新型、灵 敏、定量的可卡因检测方法对于禁毒、毒物检测、刑事鉴定等具有非常重要的实践意义和应 用价值。

目前已报道的传统可卡因检测方法有：光学分析法、电化学分析法、高效毛细管电泳 法、核磁共振光谱法等，这些传统检测方法存在检测灵敏度不够、操作复杂耗时、依赖精密 贵重仪器、需专业人员进行操作等缺点，常常不能满足研究分析和临床检测的要求。以单克 隆抗体为基础的现场快速检测毒品方法应用最为广泛，但该类方法存在一定的局限性，如抗 体自身缺陷、抗体制备工作量大、不同来源抗体的非特异性结合产生假阳性信号等。近年 来，以核酸适配体为基础的毒品现场快速检测方法得到一定发展，基于核酸适配体的检测方 法特异性好，灵敏度相对于抗体检测更高，但目大多数还局限于实验室研究阶段，不适宜用 于现场检测。

综上所述，本领域尚缺乏令人满意的适用于现场检测的可卡因快速定量检测方法，因 此，迫切需要研制开发具有灵敏、快速、准确、特异性好等优点的可卡因现场检测技术。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为克服现有技术的不足，提供种一种适用于现场检测的可卡 因快速定量检测方法，可以直接获得可卡因定量检测结果，无需二次检测。

本发明为解决上述技术问题提供的技术方案为：

一种适用于现场检测的可卡因快速定量检测方法，包括以下步骤：

(1)制备纸基检测装置：选取纸张作为检测基底，以非水溶性溶剂作为疏水壁垒在纸 张表面圈定亲水检测区域，将水溶性上转换荧光纳米材料和单链核酸适配体ACA-1共价偶 联在所述亲水检测区域，得到纸基检测装置；

(2)选取金纳米颗粒(AuNPs)并在其表面标记单链核酸适配体ACA-2，所得产物记作 AuNPs-ACA-2，将其分散于缓冲液中，得到AuNPs-ACA-2溶液；

(3)AuNPs-ACA-2溶液的浓度优化：分别在步骤(1)所述的纸基检测装置的亲水检 测区域中加入体积为V1固定浓度的可卡因溶液和体积为V2不同浓度的AuNPs-ACA-2溶 液，反应完成后除去未反应的AuNPs-ACA-2；将所得反应后的纸基检测装置干燥后用 980nm激光光源激发，于黑暗条件下拍摄亲水检测区域的荧光图像并用软件读取荧光图像中 绿光强度F；设定AuNPs-ACA-2溶液的浓度为0时，所得绿光强度空白样强度记为F₀，计 算不同浓度AuNPs-ACA-2溶液所对应的荧光猝灭效率(F₀-F)/F₀，得到荧光猝灭效率最大 时所对应的AuNPs-ACA-2溶液浓度C；

(4)配制可卡因的标准溶液：用体液配制不同浓度的可卡因溶液，即为可卡因标准溶 液；

(5)绘制可卡因检测标准曲线：分别在步骤(1)所述的纸基检测装置的亲水检测区域 中加入体积为V1的可卡因标准溶液和体积为V2浓度为C的AuNPs-ACA-2溶液，反应完 成后除去未反应的AuNPs-ACA-2；将所得反应后的纸基检测装置干燥后用980nm激光光源 激发，于黑暗条件下拍摄亲水检测区域的荧光图像并用软件读取荧光图像中绿光强度F’； 设定可卡因标准溶液的浓度为0时，所得绿光强度空白样强度记为F₀’，以荧光猝灭效率 (F₀’-F’)/F₀’为纵坐标，以可卡因标准溶液浓度的对数值为横坐标绘制标准曲线；

(6)待测体液中可卡因浓度的测定：分别在步骤(1)所述的纸基检测装置的亲水检测 区域中加入体积为V1的待测体液和体积为V2浓度为C的AuNPs-ACA-2溶液，反应完成 后除去未反应的AuNPs-ACA-2；将所得反应后的纸基检测装置干燥后用980nm激光光源激 发，于黑暗条件下拍摄亲水检测区域的荧光图像并用软件读取荧光图像中绿光强度Fx；计 算荧光猝灭效率(F₀’-Fx)/F₀’，代入标准曲线得到待测体液中的可卡因浓度。

按上述方案，所述的亲水检测区域的形状优选圆形，内径优选2-6mm。

按上述方案，所述的水溶性上转换荧光纳米材料形貌为球形，粒径在30-100nm，表面 修饰有氨基。其中，所述上转换荧光纳米材料的基质为上转换荧光纳米材料NaYF₄、 NaGdF₄等，氨基修饰可以采用聚乙烯亚胺、氨基乙基膦酸等作为改性剂，以实现水溶性。

按上述方案，步骤(1)中共价偶联时，水溶性上转换荧光纳米材料配制成浓度为0.2- 0.8mg/ml的溶液，单链核酸适配体ACA-1配制成浓度为0.5-4μM的溶液，两者加入量均为 1.3-12μL，总体积为V1和V2的总和；或者配制成两者的混合溶液，适量调整加入量。

按上述方案，所述的金纳米颗粒形貌为球形，粒径在10-30nm，表面修饰有柠檬酸根。

按上述方案，所述的单链核酸ACA-1和单链核酸ACA-2，其序列分别为：5’-NH₂- TTTTTCAAGAACTGAGGG-3’和5’-SH-TTTTTACAGCAGGGTGAAGTAACTTCTTG-3’。

按上述方案，所述的纸张需为亲水性纸张，包括打印纸、普通滤纸、纤维素滤纸、硝酸 纤维素膜等，优选为纤维素滤纸。

按上述方案，步骤(1)中的非水溶性溶剂选自疏水性油墨、石蜡、光刻胶、烷基烯酮 二聚体等。

按上述方案，步骤(2)中所述的缓冲液pH范围在7.0-7.5，可以选择含100mMNaCl 的20mMTris-HCl缓冲溶液；步骤(3)中缓冲液与步骤(2)相同。

按上述方案，步骤(3)中的可卡因溶液的配制步骤为将可卡因标准品中溶剂完全挥发 后加入缓冲液(该缓冲液可以选择：含100mMNaCl的20mMTris-HCl，pH为7.4的缓冲 液)，冰浴超声30min得到可卡因储备液，再用相同缓冲液将储备液稀释至特定浓度。该可 卡因溶液的特定浓度可以设定为10μM，AuNPs-ACA-2溶液的浓度范围通常为0-0.305μM。

按上述方案，步骤(3)中用缓冲液洗涤以除去未反应的AuNPs-ACA-2。该缓冲液为含 100mMNaCl的20mMTris-HCl缓冲液，且其中聚乙二醇(PEG)的体积百分含量为1％- 2％，吐温20(Tween20)的体积百分含量为0.01％-0.05％，该缓冲液的pH范围为7.0-7.5； 所述的洗涤具体步骤为：先将纸基检测装置倒置，使亲水检测区域朝下，从上方加入5- 10μL洗涤缓冲液，并在下方垫吸水纸促进溶液流动，重复洗涤3-5次。

按上述方案，所述步骤(4)中可卡因标准溶液的浓度范围为0-50μM。

按上述方案，所述步骤(3)和步骤(5)、(6)中的体积V1和体积V2与亲水检测区域 直径的平方成正比。当亲水检测区域为内径2-6mm圆形时，体积V1和体积V2均优选1.3- 12μL。

按上述方案，所述步骤(3)和步骤(5)、(6)中的反应温度为20-37℃，反应时间为反 应20-60min。

按上述方案，所述步骤(3)和步骤(5)、(6)中可以采用手机拍摄亲水检测区域荧光 图像，用手机自带RGB软件读取荧光图像中绿光强度。

按上述方案，所述的体液具体包括血液、唾液、泪液、尿液、汗液等。

本发明的原理是：将荧光共振能量转移和可卡因适配体的特异性识别功能相结合，实现 可卡因定量检测。本发明将可卡因适配体分成两条独立的DNA链(ACA-1和ACA-2)，二者 在不存在可卡因时没有相互作用，而在可卡因存在时生成适配体的二级结构。本发明将作为 荧光供体的上转换荧光纳米材料和ACA-1共价固定在纸张检测区域，作为荧光受体的金纳 米颗粒表面修饰ACA-2，当待测体液中含有可卡因时，ACA-1和ACA-2与可卡因反应形成 适配体二级结构(图1)，将AuNPs固定在纸张表面，使得上转换荧光纳米材料和AuNPS 之间的距离拉近，在荧光共振能量转移距离范围内(1-10nm)，AuNPs可以有效猝灭上转换 荧光纳米材料的荧光，荧光猝灭效率与可卡因浓度存在相关性，将反应完的纸基检测装置置 于检测器件(图2)中用手机拍摄荧光图片，荧光图片颜色与可卡因浓度间存在相关性，本 发明利用此原理实现可卡因的定量检测。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明可直接根据绿光强度用肉眼进行定量判断，同时还可以利用手机作为信号收 集装置，直接获得可卡因定量检测结果，无需二次检测，并且现场检测灵敏度可与实验室检 测方法相当，远高于现有的现场检测方法；

2、本发明将特异性识别可卡因的核酸适配体合理设计成两段序列，避免适配体本身二 级结构的干扰，降低背景信号，提高分析检测灵敏度；

3、本发明将上转换荧光共振能量与适配体特异性识别能力相结合，通过优化上转换荧 光纳米材料与适配体的相对浓度，有效提高体系的荧光猝灭效率，有效提高了检测灵敏度， 定性检测灵敏度可达0.05μM，定量检测灵敏度可达0.5μM。

4、本发明利用上转换荧光纳米材料近红外光激发、可见光发射的优势，直接在复杂体 液样品中进行检测，无需前期预处理步骤，操作简单，更加适用于现场检测。

附图说明

图1是一种适用于现场检测的可卡因快速定量检测方法的检测原理图。

图2是一种适用于现场检测的可卡因快速定量检测方法的检测器件模型。

图3是实施例1中AuNPs-ACA-2浓度与荧光猝灭效率关系图。

图4是实施例1中唾液中可卡因浓度和荧光猝灭效率关系图。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明 作进一步的详细说明。

1、下述实施例中，所述的水溶性上转换荧光纳米材料(NaYF₄：Yb，Er，其中Y， Yb，Er摩尔比为80:18:2，记作UCPs)具体制备方法为：选用表面修饰有油酸的球形上转 换荧光纳米材料NaYF₄：Yb，Er(记作OA-UCPs)，将其分散在氯仿中，得到浓度为 1μmol/L的OA-UCPs氯仿溶液；将30ml一缩二乙二醇和600mg聚乙烯亚胺加入到100mL 三口瓶中，体系抽真空后在磁力搅拌和氩气保护下加热至110℃，将1mLOA-UCPs氯仿溶 液逐滴加入后反应1h，然后升温至240℃继续反应6h，待体系冷却至室温后向烧瓶中加入 等体积乙醇，离心得到沉淀，将沉淀用乙醇和水离心洗涤3次后分散于纯水中，即得到上转 换荧光纳米材料，记作PEI-UCPs。该上转换荧光纳米材料形貌为球形，粒径在30-100nm， 表面修饰有氨基。

当然，只要是水溶性的上转换荧光纳米材料均能适用于本发明。

2、下述实施例中，所述金纳米颗粒的制备及其表面标记按如下方法进行：

(1)采用柠檬酸三钠还原氯金酸法制备金纳米颗粒：将氯金酸先配成质量分数为2％的 水溶液，取2mL于圆底烧瓶中并加入50mL高纯水加热至沸腾，在剧烈搅拌下加入5mL 38.8mM的柠檬酸三钠水溶液，继续加热煮沸15min，淡黄色的氯金酸水溶液变成酒红色； 待体系自然冷却至室温后用0.22μm滤膜过滤后，即得到浓度为3.7μmol/L的金纳米颗粒水 溶液，置于4℃冰箱中备用。该金纳米颗粒形貌为球形，粒径在10-30nm，表面修饰有柠檬 酸根。

(2)表面标记：将1nmol单链核酸适配体ACA-2与5nmol三(2-羧乙基)膦(TCEP) 混合后室温反应1h以打开ACA-2的二硫键；反应完后溶液与1.5mL3.7μmol/L金纳米颗粒 溶液混合并在室温反应16h，然后用2mol/LNaCl溶液逐步调节溶液盐浓度为0.1mol/L，并 置于室温再次反应24h；反应完后所得产物用高纯水离心洗涤三次，然后分散于Tris-HCl缓 冲液中保存备用，即为AuNPs-ACA-2溶液。其中缓冲液的组成为含100mMNaCl的20mM Tris-HCl缓冲液，pH范围为7.0-7.5。

3、本发明中，制备纸基检测装置：选取纸张作为检测基底，以非水溶性溶剂作为疏水 壁垒在纸张表面圈定亲水检测区域，将水溶性上转换荧光纳米材料和单链核酸适配体ACA- 1共价偶联在所述亲水检测区域，即可得到纸基检测装置。

(1)以下实施例中所述的纸张基底按如下方法制备：在电脑上绘制检测区域图案并用 普通打印机在纸张表面打印出来；将与亲水检测区域图案形状相同的塑料模板覆盖在纸张基 底表面，用油性笔沿检测区域图案边缘绘制油墨线，绘制完后置于室温静置使疏水油墨线中 的溶剂完全挥发，残留在纸张内部的树脂、有机物等形成疏水壁垒。

(2)以下实施例中将水溶性上转换荧光纳米材料和单链核酸ACA-1共价偶联在纸张表 面按如下方法制备：配制NaIO₄浓度为26mM、LiCl浓度为47mM的混合水溶液，将0.5g (确实以质量计)纸张基底浸泡在75mL混合水溶液中于55℃反应1h；然后将浸泡所得纸 张基底水洗2次后置于烘箱中烘干，随后在每个亲水检测区域中加入2.6-24μL(这里的体 积是V1和V2的总和)PEI-UCPs和ACA-1的混合溶液(该混合溶液中，PEI-UCPs浓度为 0.5mg/ml，ACA-1浓度为0.5-4μM，氰基硼氢化钠NaCNBH₃浓度为200mM，溶剂为 100mMHEPES缓冲，溶液pH为7.2)，并于室温反应30min；反应完后纸张基底用体积分 数为0.02％的吐温20(Tween20)溶液浸泡洗涤5min，水洗两次后干燥，即为纸基检测装 置，保存备用。

实施例1

一种适用于现场检测的可卡因快速定量检测方法，包括以下步骤：

(1)如前所述制备纸基检测装置，其中纸张选用纤维素滤纸，圆形的亲水检测区域内 径为3mm，在每个亲水检测区域中加入6μLPEI-UCPs和ACA-1的混合溶液，其中水溶性 上转换荧光纳米材料PEI-UCPs浓度为0.5mg/mL和单链核酸ACA-1浓度为2μM；

(2)如前所述配制AuNPs-ACA-2溶液；

(3)AuNPs-ACA-2溶液的浓度优化：分别在步骤(1)所述的纸基检测装置的亲水检 测区域中加入3μL10μM的可卡因溶液和3μL不同浓度的AuNPs-ACA-2溶液(浓度分别为 0,0.07,0.105,0.14,0.175,0.21,0.28,0.315μM)，在25℃条件下反应40min，用6μL洗涤缓冲 液洗涤5次除去未反应的AuNPs-ACA-2；将所得反应后的纸基检测装置干燥后用980nm激 光光源激发，于黑暗条件下用手机拍摄亲水检测区域的荧光图像并用手机自带RGB软件读 取荧光图像中绿光强度F；设定AuNPs-ACA-2溶液的浓度为0时，所得绿光强度空白样强 度记为F₀，计算不同浓度AuNPs-ACA-2溶液所对应的荧光猝灭效率(F₀-F)/F₀，得到荧光 猝灭效率最大(54.4％)时所对应的AuNPs-ACA-2溶液浓度C为0.28μM；

(4)配制可卡因的标准溶液：用唾液稀释可卡因原液，配制不同浓度的可卡因溶液， 即为可卡因标准溶液，浓度分别为0,0.05,0.1,0.5,1,5,10,50μM；

(5)绘制可卡因检测标准曲线：分别在步骤(1)所述的纸基检测装置的亲水检测区域 中加入3μL的可卡因标准溶液和3μL浓度0.28μM的AuNPs-ACA-2溶液，在25℃条件下反 应40min，用6μL洗涤缓冲液洗涤5次除去未反应的AuNPs-ACA-2；将所得反应后的纸基 检测装置干燥后用980nm激光光源激发，于黑暗条件下用手机拍摄亲水检测区域的荧光图 像并用手机自带RGB软件读取荧光图像中绿光强度F’；设定可卡因标准溶液的浓度为0 时，所得绿光强度空白样强度记为F₀’，以荧光猝灭效率(F₀’-F’)/F₀’为纵坐标，以可 卡因标准溶液浓度的对数值为横坐标绘制标准曲线，标准曲线方程为Y＝0.18X+0.60；

(6)待测唾液中可卡因浓度的测定：分别在步骤(1)所述的纸基检测装置的亲水检测 区域中加入3μL的待测体液和3μL浓度0.28μM的AuNPs-ACA-2溶液，在25℃条件下反应 40min，用6μL洗涤缓冲液洗涤5次除去未反应的AuNPs-ACA-2；将所得反应后的纸基检测 装置干燥后用980nm激光光源激发，于黑暗条件下用手机拍摄亲水检测区域的荧光图像并 用手机自带RGB软件读取荧光图像中绿光强度Fx；计算荧光猝灭效率(F₀’-Fx)/F₀’， 代入标准曲线得到待测体液中的可卡因浓度为0.463μM。

已知待测体液中可卡因浓度为0.5μM，本发明的检测结果准确率可以达到92.6％，三次 重复测量的标准偏差为11％，检测结果的准确性和重复性良好。

由图3可知：本发明建立的检测方法中AuNPs-ACA-2的浓度在一定范围内影响荧光猝 灭效率，AuNPs-ACA-2浓度越大，荧光猝灭效率越高。

由图4可知：本发明建立的检测方法能够在一定浓度范围内实现可卡因检测，可卡因浓 度越大，荧光图像的绿光荧光强度越弱，荧光猝灭效率与可卡因浓度对数值呈现良好的线性 关系，表明该检测方法可以实现对唾液可卡因的定性检测和定量检测，其灵敏度分别可达 0.05μM和0.5μM。

由表1可知：对于不同浓度的唾液可卡因样品，本发明建立的检测方法检测结果的准确 率在88.8％-103.2％，多次检测结果间的相对标准偏差小于15％，表明本发明建立的检测方 法具有良好的准确性和稳定性。

表1唾液样品中可卡因检测加标回收实验

样品编号 加入浓度(μM) 测试浓度(μM) 回收率(％) 相对标准偏差(％) 1 0.05 0.0516 103.2 14.6 2 0.5 0.463 92.6 11.0 3 2 1.775 88.8 8.8

实施例2

一种适用于现场检测的可卡因快速定量检测方法，包括以下步骤：

(1)如前所述制备纸基检测装置，其中纸张选用纤维素滤纸，圆形的亲水检测区域内 径为2mm，在每个亲水检测区域中加入2.6μLPEI-UCPs和ACA-1的混合溶液，其中水溶性 上转换荧光纳米材料浓度为0.5mg/mL和单链核酸ACA-1浓度为0.5μM；

(2)如前所述配制AuNPs-ACA-2溶液；

(3)AuNPs-ACA-2溶液的浓度优化：分别在步骤(1)所述的纸基检测装置的亲水检 测区域中加入1.3μL10μM的可卡因溶液和1.3μL不同浓度的AuNPs-ACA-2溶液(浓度分别 为0,0.07,0.105,0.14,0.175,0.21,0.28,0.315μM)，在20℃条件下反应20min，用3μL洗涤缓 冲液洗涤3次除去未反应的AuNPs-ACA-2；将所得反应后的纸基检测装置干燥后用980nm 激光光源激发，于黑暗条件下用手机拍摄亲水检测区域的荧光图像并用手机自带RGB软件 读取荧光图像中绿光强度F；设定AuNPs-ACA-2溶液的浓度为0时，所得绿光强度空白样 强度记为F₀，计算不同浓度AuNPs-ACA-2溶液所对应的荧光猝灭效率(F₀-F)/F₀，得到荧 光猝灭效率最大时所对应的AuNPs-ACA-2溶液浓度C为0.14μM；

(4)配制可卡因的标准溶液：用人血清稀释可卡因原液，配制不同浓度的可卡因溶 液，即为可卡因标准溶液，浓度分别为0,0.05,0.1,0.5,1,5,10,50μM；

(5)绘制可卡因检测标准曲线：分别在步骤(1)所述的纸基检测装置的亲水检测区域 中加入1.3μL的可卡因标准溶液和1.3μL浓度0.14μM的AuNPs-ACA-2溶液，在20℃条件 下反应20min，用3μL洗涤缓冲液洗涤3次除去未反应的AuNPs-ACA-2；将所得反应后的 纸基检测装置干燥后用980nm激光光源激发，于黑暗条件下用手机拍摄亲水检测区域的荧 光图像并用手机自带RGB软件读取荧光图像中绿光强度F’；设定可卡因标准溶液的浓度 为0时，所得绿光强度空白样强度记为F₀’，以荧光猝灭效率(F₀’-F’)/F₀’为纵坐标， 以可卡因标准溶液浓度的对数值为横坐标绘制标准曲线，标准曲线方程为Y＝0.11X+0.43；

(6)待测血清中可卡因浓度的测定：分别在步骤(1)所述的纸基检测装置的亲水检测 区域中加入1.3μL的待测体液和1.3μL浓度0.14μM的AuNPs-ACA-2溶液，在20℃条件下 反应20min，用3μL洗涤缓冲液洗涤3次除去未反应的AuNPs-ACA-2；将所得反应后的纸 基检测装置干燥后用980nm激光光源激发，于黑暗条件下用手机拍摄亲水检测区域的荧光 图像并用手机自带RGB软件读取荧光图像中绿光强度Fx；计算荧光猝灭效率(F₀’-Fx) /F₀’，代入标准曲线得到待测体液中的可卡因浓度为0.185μM。

已知待测血清中可卡因浓度为0.2μM，本发明的检测结果准确率可以达到92.5％，三次 重复测量的标准偏差为9.8％，检测结果的准确性和重复性良好。

实施例3

一种适用于现场检测的可卡因快速定量检测方法，包括以下步骤：

(1)如前所述制备纸基检测装置，其中纸张选用纤维素滤纸，圆形的亲水检测区域内 径为6mm，在每个亲水检测区域中加入24μLPEI-UCPs和ACA-1的混合溶液，其中水溶性 上转换荧光纳米材料浓度为0.5mg/mL和单链核酸ACA-1浓度为4μM；

(2)如前所述配制AuNPs-ACA-2溶液；

(3)AuNPs-ACA-2溶液的浓度优化：分别在步骤(1)所述的纸基检测装置的亲水检 测区域中加入12μL10μM的可卡因溶液和12μL不同浓度的AuNPs-ACA-2溶液(浓度分别 为0,0.07,0.105,0.14,0.175,0.21,0.28,0.315μM)，在37℃条件下反应40min，用24μL洗涤 缓冲液洗涤3次除去未反应的AuNPs-ACA-2；将所得反应后的纸基检测装置干燥后用 980nm激光光源激发，于黑暗条件下用手机拍摄亲水检测区域的荧光图像并用手机自带 RGB软件读取荧光图像中绿光强度F；设定AuNPs-ACA-2溶液的浓度为0时，所得绿光强 度空白样强度记为F₀，计算不同浓度AuNPs-ACA-2溶液所对应的荧光猝灭效率(F₀-F) /F₀，得到荧光猝灭效率最大时所对应的AuNPs-ACA-2溶液浓度C为0.315μM；

(4)配制可卡因的标准溶液：用泪液稀释可卡因原液，配制不同浓度的可卡因溶液， 即为可卡因标准溶液，浓度分别为0,0.05,0.1,0.5,1,5,10,50μM；

(5)绘制可卡因检测标准曲线：分别在步骤(1)所述的纸基检测装置的亲水检测区域 中加入12μL的可卡因标准溶液和12μL浓度0.315μM的AuNPs-ACA-2溶液，在37℃条件 下反应40min，用24μL洗涤缓冲液洗涤3次除去未反应的AuNPs-ACA-2；将所得反应后的 纸基检测装置干燥后用980nm激光光源激发，于黑暗条件下用手机拍摄亲水检测区域的荧 光图像并用手机自带RGB软件读取荧光图像中绿光强度F’；设定可卡因标准溶液的浓度 为0时，所得绿光强度空白样强度记为F₀’，以荧光猝灭效率(F₀’-F’)/F₀’为纵坐标， 以可卡因标准溶液浓度的对数值为横坐标绘制标准曲线，标准曲线方程为Y＝0.21X+0.55；

(6)待测泪液中可卡因浓度的测定：分别在步骤(1)所述的纸基检测装置的亲水检测 区域中加入12μL的待测体液和12μL浓度0.315μM的AuNPs-ACA-2溶液，在37℃条件下 反应40min，用24μL洗涤缓冲液洗涤3次除去未反应的AuNPs-ACA-2；将所得反应后的纸 基检测装置干燥后用980nm激光光源激发，于黑暗条件下用手机拍摄亲水检测区域的荧光 图像并用手机自带RGB软件读取荧光图像中绿光强度Fx；计算荧光猝灭效率(F₀’-Fx) /F₀’，代入标准曲线得到待测体液中的可卡因浓度为11.025μM。

已知待测泪液中可卡因浓度为10μM，本发明的检测结果准确率可以达到110.25％，三 次重复测量的标准偏差为8.3％，检测结果的准确性和重复性良好。

实施例4

一种适用于现场检测的可卡因快速定量检测方法，包括以下步骤：

(1)如前所述制备纸基检测装置，其中纸张选用纤维素滤纸，圆形的亲水检测区域内 径为4mm，，在每个亲水检测区域中加入10μLPEI-UCPs和ACA-1的混合溶液，其中水溶 性上转换荧光纳米材料浓度为0.5mg/mL和单链核酸ACA-1浓度为1μM；

(2)如前所述配制AuNPs-ACA-2溶液；

(3)AuNPs-ACA-2溶液的浓度优化：分别在步骤(1)所述的纸基检测装置的亲水检 测区域中加入5μL10μM的可卡因溶液和5μL不同浓度的AuNPs-ACA-2溶液(浓度分别为 0,0.07,0.105,0.14,0.175,0.21,0.28,0.315μM)，在30℃条件下反应60min，用10μL洗涤缓 冲液洗涤5次除去未反应的AuNPs-ACA-2；将所得反应后的纸基检测装置干燥后用980nm 激光光源激发，于黑暗条件下用手机拍摄亲水检测区域的荧光图像并用手机自带RGB软件 读取荧光图像中绿光强度F；设定AuNPs-ACA-2溶液的浓度为0时，所得绿光强度空白样 强度记为F₀，计算不同浓度AuNPs-ACA-2溶液所对应的荧光猝灭效率(F₀-F)/F₀，得到荧 光猝灭效率最大时所对应的AuNPs-ACA-2溶液浓度C为0.28μM；

(4)配制可卡因的标准溶液：用尿液稀释可卡因原液，配制不同浓度的可卡因溶液， 即为可卡因标准溶液，浓度分别为0,0.05,0.1,0.5,1,5,10,50μM；

(5)绘制可卡因检测标准曲线：分别在步骤(1)所述的纸基检测装置的亲水检测区域 中加入5μL的可卡因标准溶液和5μL浓度0.28μM的AuNPs-ACA-2溶液，在30℃条件下反 应60min，用10μL洗涤缓冲液洗涤5次除去未反应的AuNPs-ACA-2；将所得反应后的纸基 检测装置干燥后用980nm激光光源激发，于黑暗条件下用手机拍摄亲水检测区域的荧光图 像并用手机自带RGB软件读取荧光图像中绿光强度F’；设定可卡因标准溶液的浓度为0 时，所得绿光强度空白样强度记为F₀’，以荧光猝灭效率(F₀’-F’)/F₀’为纵坐标，以可 卡因标准溶液浓度的对数值为横坐标绘制标准曲线，标准曲线方程为Y＝0.15X+0.57；

(6)待测尿液中可卡因浓度的测定：分别在步骤(1)所述的纸基检测装置的亲水检测 区域中加入5μL的待测体液和5μL浓度0.28μM的AuNPs-ACA-2溶液，在30℃条件下反应 60min，用10μL洗涤缓冲液洗涤5次除去未反应的AuNPs-ACA-2；将所得反应后的纸基检 测装置干燥后用980nm激光光源激发，于黑暗条件下用手机拍摄亲水检测区域的荧光图像 并用手机自带RGB软件读取荧光图像中绿光强度Fx；计算荧光猝灭效率(F₀’-Fx) /F₀’，代入标准曲线得到待测体液中的可卡因浓度为26.783μM。

已知待测尿液中可卡因浓度为25μM，本发明的检测结果准确率可以达到107.13％，三 次重复测量的标准偏差为6.9％，检测结果的准确性和重复性良好。

实施例5

一种适用于现场检测的可卡因快速定量检测方法，包括以下步骤：

(1)如前所述制备纸基检测装置，其中纸张选用纤维素滤纸，圆形的亲水检测区域内 径为5mm，，在每个亲水检测区域中加入16μLPEI-UCPs和ACA-1的混合溶液，其中水溶 性上转换荧光纳米材料浓度为0.5mg/mL和单链核酸ACA-1浓度为2μM；

(2)如前所述配制AuNPs-ACA-2溶液；

(3)AuNPs-ACA-2溶液的浓度优化：分别在步骤(1)所述的纸基检测装置的亲水检 测区域中加入8μL10μM的可卡因溶液和8μL不同浓度的AuNPs-ACA-2溶液(浓度分别为 0,0.07,0.105,0.14,0.175,0.21,0.28,0.315μM)，在37℃条件下反应40min，用16μL洗涤缓 冲液洗涤5次除去未反应的AuNPs-ACA-2；将所得反应后的纸基检测装置干燥后用980nm 激光光源激发，于黑暗条件下用手机拍摄亲水检测区域的荧光图像并用手机自带RGB软件 读取荧光图像中绿光强度F；设定AuNPs-ACA-2溶液的浓度为0时，所得绿光强度空白样 强度记为F₀，计算不同浓度AuNPs-ACA-2溶液所对应的荧光猝灭效率(F₀-F)/F₀，得到荧 光猝灭效率最大时所对应的AuNPs-ACA-2溶液浓度C为0.21μM；

(4)配制可卡因的标准溶液：用汗液稀释可卡因原液，配制不同浓度的可卡因溶液， 即为可卡因标准溶液，浓度分别为0,0.05,0.1,0.5,1,5,10,50μM；

(5)绘制可卡因检测标准曲线：分别在步骤(1)所述的纸基检测装置的亲水检测区域 中加入8μL的可卡因标准溶液和8μL浓度0.21μM的AuNPs-ACA-2溶液，在37℃条件下反 应40min，用16μL洗涤缓冲液洗涤5次除去未反应的AuNPs-ACA-2；将所得反应后的纸基 检测装置干燥后用980nm激光光源激发，于黑暗条件下用手机拍摄亲水检测区域的荧光图 像并用手机自带RGB软件读取荧光图像中绿光强度F’；设定可卡因标准溶液的浓度为0 时，所得绿光强度空白样强度记为F₀’，以荧光猝灭效率(F₀’-F’)/F₀’为纵坐标，以可 卡因标准溶液浓度的对数值为横坐标绘制标准曲线，标准曲线方程为Y＝0.169X+0.63；

(6)待测汗液中可卡因浓度的测定：分别在步骤(1)所述的纸基检测装置的亲水检测 区域中加入8μL的待测体液和8μL浓度0.21μM的AuNPs-ACA-2溶液，在37℃条件下反应 40min，用16μL洗涤缓冲液洗涤5次除去未反应的AuNPs-ACA-2；将所得反应后的纸基检 测装置干燥后用980nm激光光源激发，于黑暗条件下用手机拍摄亲水检测区域的荧光图像 并用手机自带RGB软件读取荧光图像中绿光强度Fx；计算荧光猝灭效率(F₀’-Fx) /F₀’，代入标准曲线得到待测体液中的可卡因浓度为0.046μM。

已知待测体液中可卡因浓度为0.05μM，本发明的检测结果准确率可以达到92％，三次 重复测量的标准偏差为12.8％，检测结果的准确性和重复性良好。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在 不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干改进和变换，这些都属于本发明的保护范 围。