一种橡胶树红根病接种方法

摘要

本发明涉及生物技术领域，公开了一种橡胶树红根病接种方法，通过在试管内的培养基上培养橡胶树红根病病原菌，以处于指数期的菌丝体作为接种体，将橡胶树无菌组培苗的根部插入培养有接种体的试管内，其部分根部位于培养基表面下，培养至橡胶树无菌组培苗感染橡胶树红根病。本发明所述的橡胶树红根病接种方法，可以直接在试管中观测红根病病原菌的侵染状况以及植株的发病状况，解决了菌株易受污染、接种成功率波动大、难以直接观察发病情况的问题，有利于促进橡胶树种质资源抗红根病鉴定技术，加快优良抗病砧木及防治药剂的筛选等研究。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是指一种橡胶树红根病接种方法。

背景技术

橡胶树红根病是巴西橡胶树(Heveabrasiliensis)在我国危害面积最广、影 响最大的根部传染性病害，病原菌为橡胶灵芝菌Ganodermapseudoferreum (Wakef)Over.etSteinm。病原菌从橡胶树根系侵入，破坏根系吸收水分和养分的 机能，降低输导功能，造成橡胶树根系坏死，枝叶枯落，最终整株死亡，给橡 胶产业带来巨大的经济损失。橡胶树红根病病原菌寄主范围广，能侵染柑桔、 荔枝、茶树等十多种作物，同时根病病原菌在土壤里的潜伏期很长，直径3cm 病根的病原菌在土中能存活2年，碰到合适的寄主后年平均蔓延量高达1.83米。 目前红根病在我国各植胶区普遍发生，病区几乎分布于每个植胶农场，发病严 重的林段发病率达到40％，而未进行预防处理的幼树区能高达60％，若没有及 时处理死亡率为100％，给橡胶产业带来巨大损失。

国内外研究表明，因病菌侵染势和环境条件的原因，在活的橡胶树根上进 行人工接种病菌很难成功。目前报道有效的接种方法有：橡胶树木屑根段接种 法、橡胶木屑菌棒接种法、橡胶树病根根段接种法和玉米粒培养基接种法等方 法，这些方法虽然能够成功接种，但在实施过程中容易受污染，成功率波动较 大且难以直接观察发病情况。随着橡胶树基因工程的发展，橡胶树组培苗的成 功培育给橡胶树红根病的接种鉴定提供了新的途径。

发明内容

本发明提出一种橡胶树红根病接种方法，接种成功率大大提高，便于直接 观察发病情况。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种橡胶树红根病接种方法，包括以下步骤：

(1)取橡胶树红根病病原菌菌株接种于培养基上，在黑暗条件下培养，取 处于指数期的菌丝体作为接种体；

(2)取橡胶树无菌组培苗，将橡胶树无菌组培苗的根部插入培养有接种体 的试管内，橡胶树无菌组培苗的部分根部位于培养基表面下，置于光照-黑暗交 替条件下培养，至橡胶树无菌组培苗感染橡胶树红根病。

进一步，步骤(1)中，所述病原菌菌株培养条件为25-30℃，培养5-7d。

进一步，步骤(1)中，所述培养基的组成为：每1L培养基中含有橡胶树嫩 根汁20-25g，玉米粉20-25g，葡萄糖15-20g，琼脂12-15g，利福平50-100mg，水 余量。

进一步，步骤(2)中，所述橡胶树无菌组培苗为长出一篷叶的幼苗。

进一步，步骤(2)中，所述橡胶树无菌组培苗为通过胚状体繁殖的。

进一步，步骤(2)中，所述橡胶树无菌组培苗高度为10-13cm。

进一步，步骤(2)中，所述橡胶树无菌组培苗根部位于培养基表面下1-2cm。

进一步，步骤(2)中，橡胶树无菌组培苗的培养条件为，25-30℃温度下， 6-10h光照-14-18h黑暗交替培养，相对湿度为80-90％。

本发明的有益效果：

本发明所述的一种橡胶树红根病接种方法，病原菌从组培苗根部侵入，蔓 延至茎杆，可以直接在试管中观测红根病病原菌的侵染状况以及植株的生长状 况。通过实验，发现试管中橡胶树红根病病原菌菌丝蔓延速度为2mm/d左右； 侵染后叶片以及子叶生长缓慢至停止生长，叶片枯萎凋落，直至整株死亡。本 发明所述的橡胶树红根病病原菌接种的方法，通过直接在试管中进行接种实验， 解决了在土壤接种时，菌株易受污染、接种成功率波动大、难以直接观察发病 情况的问题，有利于促进橡胶树品种根病抗性鉴定、加快优良抗病砧木及防治 药剂的筛选等研究。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施 例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述 中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付 出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为橡胶灵芝菌菌株接种结果；

图中，A为弱致病力菌株，B为中等致病力菌株，C为强致病力菌株，D为 组培苗死亡时症状；

图2为海南省11个橡胶灵芝菌菌株接种组培苗后的致病力差异图；

图3为云南省10个橡胶灵芝菌菌株接种组培苗后的致病力差异图；

图4为橡胶灵芝菌的担孢子；

图5为纯化培养的橡胶灵芝菌；

图6为橡胶树无菌组培苗接种橡胶灵芝菌发病过程图；

图中，A：接种1天；B：接种2天；C：接种10天；D：接种25天；E： 接种35天；F：接种50天。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清 楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是 全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造 性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种橡胶树红根病接种方法，包括以下步骤：

(1)取分离纯化的橡胶树红根病病原菌橡胶灵芝菌菌株的菌丝转接于试管 内的培养基上，在25℃黑暗条件下培养培养5d，取处于指数期的菌丝体作为接 种体；所述培养基的组成为：每1L培养基中含有20g橡胶树嫩根汁、25g玉米粉、 15g葡萄糖、15g琼脂粉、50mg利福平、水余量；

(2)选择通过胚状体繁殖的橡胶树无菌组培苗热研7-33-97，待橡胶树无菌 组培苗长出一篷叶，高度为10cm时，将橡胶树无菌组培苗的根部插入培养有接 种体的试管内，其根部位于培养基表面下约1cm，置于25℃下，6h光照-18h黑暗 交替条件下培养，相对湿度为80％，至橡胶树无菌组培苗感染橡胶树红根病。

实施例2

一种橡胶树红根病接种方法，包括以下步骤：

(1)取分离纯化的橡胶树红根病病原菌橡胶灵芝菌菌株的菌丝转接于试管 内的培养基上，在27℃黑暗条件下培养培养6d，以处于指数期的菌丝体作为接 种体；所述培养基的组成为：每1L培养基中含有22g橡胶树嫩根汁、22g玉米粉、 17g葡萄糖、13g琼脂粉、70mg利福平、水余量；

(2)选择通过胚状体繁殖的橡胶树无菌组培苗热研7-33-97，待橡胶树无菌 组培苗长出一篷叶，高度为12cm时，将橡胶树无菌组培苗的根部插入培养有接 种体的试管内，其根部位于培养基表面下约1.5cm，置于27℃下，8h光照-16h黑 暗交替条件下培养，相对湿度为85％，至橡胶树无菌组培苗感染橡胶树红根病。

实施例3

一种橡胶树红根病接种方法，包括以下步骤：

(1)取分离纯化的橡胶树红根病病原菌橡胶灵芝菌菌株的菌丝转接于试管 内的培养基上，在30℃黑暗条件下培养培养7d，以处于指数期的菌丝体作为接 种体；所述培养基的组成为：每1L培养基中含有25g橡胶树嫩根汁、20g玉米粉、 20g葡萄糖、12g琼脂粉、100mg利福平、水余量；

(2)选择通过胚状体繁殖的橡胶树无菌组培苗热研7-33-97，待橡胶树无菌 组培苗长出一篷叶，高度为13cm时，将橡胶树无菌组培苗的根部插入培养有接 种体的试管内，其根部位于培养基表面下约2cm，置于30℃下，10h光照-14h黑 暗交替条件下培养，相对湿度为90％，至橡胶树无菌组培苗感染橡胶树红根病。

本发明所述的接种方法对橡胶树红根病病原菌接种结果分析

将分离纯化的21个橡胶灵芝菌菌株随机分作3组，取其菌丝分别按照本发明 3个实施例中提供的接种方法进行接种培养，记录侵染速度和致死天数，每个处 理设三个重复，结果取平均值。运用SPSS软件(版本13.0)对21个橡胶灵芝菌 菌株的侵染速度和致死天数进行Pearson相关系数检验。其结果如表1所示。

侵染速度S＝菌丝体在组培苗根部蔓延的距离(mm)/时间(d)；

致死天数D＝菌丝体从接种日到组培苗死亡日所需的时间(d)。

表1橡胶灵芝菌菌株接种结果分析

如表1所示，21个橡胶灵芝菌菌株接种后，菌丝体从组培苗根部侵入，蔓延 至茎杆，菌丝平均侵染速度为2.14mm/d；侵染后叶片停止生长，叶片开始黄化、 萎蔫、脱落；根部形成白色菌膜，直至整株死亡，平均致死天数为63.6d。选取 21个橡胶灵芝菌菌株的侵染速度和致死天数，进行Pearson相关系数检验。检验 结果显示，菌株的侵染速度和致死天数呈极显著负相关，相关系数为-0.84， P<0.001。

表2G.pseudoferreum菌株致病性分析

对21个橡胶灵芝菌G.pseudoferreum菌株接种热研7-33-97无菌组培苗根部的 致病性测定结果显示，它们均在接种后开始发病，结合软件对其进行显著性差 异分析，菌株的侵染速度和致死天数呈极显著负相关，根据致病性分析结果将 我国海南、云南两省份的橡胶树红根病菌株划分为：强致病力菌株(S≥2.5mm/d)、 中等致病力菌株(2.5mm/d＞S＞1.5mm/d)和弱致病力菌株(S≤1.5mm/d)，如 图1所示。如表2所示，按次划分标准，本研究分离的21个G.pseudoferreum菌株 中，强致病力菌株6个，其中海南省2个，云南省4个；中等致病力菌株12个，其 中海南省7个，云南省5个；弱致病力菌株3个，其中海南省2个，云南省1个。

对海南不同植胶点的11个菌株和云南不同植胶点的10个菌株进行致病力分 析，从分析结果可以看出各点致病力分化相对较大，致病力最强的菌株来自云 南勐罕，致病力最弱的菌株来自海南儋州。致病力强弱与地区间有一定的关系， 海南省的白沙、保亭，云南省的河口、勐腊、勐罕分离的菌株致病力较强，如 图2、图3所示。

以上数据显示，通过采用本发明所述的接种方法，由于整个实验过程在试管 中进行，便于控制实验条件，橡胶树红根病接种成功率高且结果稳定，不易受 到污染，易于观察发病情况，有利于确定病原菌的致病力，对于橡胶树种质资 源红根病抗性鉴定以及优良抗病砧木和防治药剂的筛选等研究具有重要的意 义。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发 明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发 明的保护范围之内。