非哺乳类RAS转基因动物模型

摘要

提供了包含RAS转基因的非哺乳类转基因动物，例如，蝇。还提供了使用本发明的转基因非哺乳类动物来鉴定具有关于细胞增殖疾病(例如肿瘤疾病)的活性的化合物的方法。

说明书

相关申请的交叉引用

根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求于2013年8月20日提交的美国临时专利申请序列号61/867,979的申请日的优先权，该申请的公开内容通过引用并入本文。

介绍

RAS(大鼠肉瘤)蛋白是在调节细胞分化、增殖和生存中发挥作用的低分子量的GTP结合/GTP酶家族(Wennerberg等,“TheRASsuperfamilyataglance”,J.CellSci.(2005)118:843-846；Adjei,“BlockingoncogenicRASsignalingforcancertherapy”,JNatl.Cancer.Inst.(2001)93:1062-1074)。RAS家族具有三个主要成员：hRAS、nRAS和kRAS。所有成员促进癌症形成和进展(Karnoub等,“RASoncogenes:splitpersonalities”,Nat.Rev.Mol.CellBiol.(2008)9:517-531)。图1提供了对于RAS系统提出的信号传导通路。应注意的是，通过激活酪氨酸激酶的信号传导的启动与多种膜结合生长因子相关。几乎所有这些生长因子(例如，EGF)对于肿瘤的生长很重要。

在约30％的人癌症中发现了RAS的突变。图2中提供了人kRAS的序列，其中标记了主要突变位点。已证明不存在RAS突变时，人肿瘤中RAS活性的增加是基因扩增或上游激活增加的结果(Friday等，“K-RASasatargetforcancertherapy”,Biochim.Biophys.Acta(2005)1756:127-144)。RAS基因的影响残基G12的单点突变(G12V)以及影响残基G13的单点突变(G13D)通过位阻消除了GAP诱导的GTP水解，而Q61L突变干扰GTP水解所需的水分子的协调性(Pylayeva-Gupta等,“RASoncogenes:Weavingatumorigenicweb”,Nat.Rev.,Cancer(2011)11:761-774)。这些突变使得蛋白质具有组成型活性，并且活性GTP结合RAS的持续导致持续激活其下游效应子途径。

kRAS是最频繁突变的RAS亚型，并且在癌症中最频繁发现突变的蛋白质之一。例如，其在90％的胰腺癌、45％的结直肠癌和35％的肺腺癌中突变(Downward,“TargetingRASsignallingpathwaysincancertherapy”,Nat.Rev.Cancer(2003)3:11-22)。kRAS突变与致瘤性增加和不良预后相关。另外，在体外和体内两种情况下抑制活化的RAS使恶性细胞回归良性表型并伴随着肿瘤退化(Podsypanina等,“OncogenecooperationintumormaintenanceandtumorrecurrenceinmousemammarytumorsinducedbyMycandmutantkRAS”,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2008)105:5242-5247；Chin等,“EssentialroleforoncogenicRASintumourmaintenance”,Nature1999；400:468-472)。

由于RAS蛋白(包括kRAS)经常参与癌症的发作和进展，kRAS是多种癌症的有吸引力的治疗靶标。致瘤性RAS信号传导的有效抑制即使到现在也被认为是癌症研究的“圣杯(HolyGrail)”(Spiegel等,“Small-moleculemodulationofRassignaling.NatChemBiol.(2014)10:613-22)。尽管作为癌症治疗剂的组成型活性kRAS蛋白的小分子抑制剂的开发是理想的，但是对于靶向突变kRAS的GTP结合口袋(GTPbindingpocket)的药物的25年的研究未能产生成功的分子(Vasan等,“ARASRenaissance:EmergingTargetedTherapiesforkRAS-MutatedNon-SmallCellLungCancer”,ClinCancerRes.(2014)20:3921-3930)。迄今，没有特异性靶向突变kRAS的有效疗法可用。靶向kRAS的组成型活性分子开关非常困难，因为GDP或GTP的作用是稳定RAS蛋白的无活性或活性状态(Gysin等,“TherapeuticstrategiesfortargetingRASproteins”,GenesCancer(2011)2:359-372)。这种情况不同于蛋白激酶，在后者中磷酰基从ATP转移到底物是一个快速的酶促过程。另外，由于kRAS和GTP之间的pM亲和力以及细胞内GTP的微摩尔浓度，不太可能发现竞争性抑制剂。此外，kRAS激活和信号传导通过与鸟苷酸交换因子(GEF)、GTP酶活性蛋白(GAP)和多种kRAS效应蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)实现(Sun等,“DiscoveryofsmallmoleculesthatbindtoK-RASandinhibitSOS-mediatedactivation”,Angew.Chem.,Int.Ed.(2012)51:6140-6143)。由于所涉及表面平凡的拓扑结构，对于靶向PPI来说是一个挑战(Fletcher等,“Targetingprotein-proteininteractionsbyrationaldesign:mimicryofproteinsurfaces”,J.R.Soc.Interface(2006)3:215-233)。考虑到kRAS系统的复杂性，使用多种直接乃至几乎完全间接的方法来靶向异常kRAS信号传导的尝试的失败是毫无意外的。

在RAS蛋白翻译后，其必须经历图3中所示的一系列翻译后修饰(Ghobrial等,“InhibitorsoftheRASoncogeneastherapeutictargets”,Hematol.Oncol.Clin.NorthAm.(2002)16:1065-1088；Adjei,“FarnesyltransfeRASeinhibitors”,CancerChemother.Biol.ResponseModif.(2001)19:149-164；Cho等,“ChemistryandbiologyofRASfarnesyltransfeRASe”,Arch.Pharm.Res.(2002)25:759-769)。最初，kRAS中末端半胱氨酸的硫醇基通过法尼基转移酶(FTase)法尼化(Casey等,“p21RASismodifiedbyafarnesylisoprenoid”,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1989)86:8323-8327；Cox等,“FarnesyltransfeRASeinhibitorsandcancertreatment:targetingsimplyRAS？”,Biochim.Biophys.Acta(1997)1333:F51-F71；Hancock等,“AllRASproteinsarepolyisoprenylatedbutonlysomearepalmitoylated”Cell(1989)57,1167-1177；Hancock等,“ApolybasicdomainorpalmitoylationisrequiredinadditiontotheCAAXmotiftolocalizep21RAStotheplasmamembrane”,Cell(1990)63:133-139)。接着，CAAX(C＝半胱氨酸；A＝异亮氨酸；X＝丝氨酸或甲硫氨酸)(Boyartchuk等,“ModulationofRASanda-factorfunctionbycarboxyl-terminalproteolysis”,Science(1997)275:1796-1800；Otto等,“Cloningandcharacterizationofamammalianprenylprotein-specificprotease”,J.Biol.Chem.(1999)274:8379-8382)蛋白酶RAS转化酶1(RCE1)切割末端AAX氨基酸，并且半胱氨酸的羰基通过异戊烯半胱氨酸羰基甲基转移酶I(isoprenylcysteinecarboxylmethyltransferaseI，ICMTI)甲基化(Clarke等,“PosttranslationalmodificationoftheHa-RASoncogeneprotein:evidenceforathirdclassofproteincarboxylmethyltransfeRASes”,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85:4643-4647；Hrycyna等,“TheSaccharomycescerevisiaeSTE14geneencodesamethyltransfeRASethatmediatesC-terminalmethylationofa-factorandRASproteins”,EMBOJ.(1991)10:1699-1709；Dai等,“MammalianprenylcysteinecarboxylmethyltransfeRASeisintheendoplasmicreticulum”,J.Biol.Chem.(1998)273:15030-15034)。最后，棕榈酰基转移酶(PTase)转移棕榈酰基到位于紧接hRAS、nRAS和kRAS的C末端的下游半胱氨酸残基上。RAS蛋白然后与细胞膜通过其法尼基和棕榈酰基以及带正电的C末端赖氨酸残基形成稳定相互作用。

kRAS的翻译后下游修饰提供了多个可能的药物靶标：法尼基转移酶抑制剂(FTase)(Appels等,“DevelopmentoffarnesyltransfeRASeinhibitors:areview”,Oncologist(2005)10:565-578)、CAAX内肽酶(Wright等,“Thematicreviewseries:lipidposttranslationalmodifications.CAAXmodificationandmembranetargetingofRAS”,J.LipidRes.(2006)47:883-891；Manandhar等,“ChemicalinhibitionofCaaXproteaseactivitydisruptsyeastRASlocalization”,Yeast(2010)27:327-343)、甲基转移酶(Winter-Vann等,“Asmall-moleculeinhibitorofisoprenylcysteinecarboxylmethyltransfeRASewithantitumoractivityincancercells”,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2005)102:4336-4341)或棕榈酰基转移酶。FTase抑制剂作为kRAS活性的调节物已经进行了最广泛研究。FTAse抑制剂(Sebti等,“FarnesyltransferaseandgeranylgeranyltransferaseIinhibitorsandcancertherapy:lessonsfrommechanismandbench-to-bedsidetranslationalstudies”,Oncogene(2000)9:6584-6593；Cox等,“Farnesyltransferaseinhibitors:promisesandrealities”,Curr.Opin.Pharmacol.(2002)2:388-393)分为两类：CAAX肽模拟物，包括FTI-276(Sun等,“BothfarnesyltransferaseandgeranylgeranyltransferaseIinhibitorsarerequiredforinhibitionofoncogenicK-Rasprenylationbuteachaloneissufficienttosuppresshumantumorgrowthinnudemousexenografts”,Oncogene(1998)16:1467-1473)、FTI-277(Lerner等,“RasCAAXpeptidomimeticFTI-277selectivelyblocksoncogenicRassignalingbyinducingcytoplasmicaccumulationofinactiveRas-Rafcomplexes”,J.Biol.Chem.(1995)270:26802-26806)、L-744832(Song等,“K-Ras-independenteffectsofthefarnesyltransferaseinhibitorL-744,832oncyclinB1/Cdc2kinaseactivity,G2/Mcellcycleprogressionandapoptosisinhumanpancreaticductaladenocarcinomacells”,Neoplasia(2000)2:261-272)、B956(Nagasu等,“InhibitionofhumantumorxenograftgrowthbytreatmentwiththefarnesyltransferaseinhibitorB956”,CancerRes.(1995)55,5310-5314)和FTI-2153(Crespo等,“Thefarnesyltransferaseinhibitor,FTI-2153,blocksbipolarspindleformationandchromosomealignmentandcausesprometaphaseaccumulationduringmitosisofhumanlungcancercells”,J.Biol.Chem.(2001)276:16161-16167)；以及非肽模拟物，其包括替吡法尼(tipifarnib)(Beaupre等.“R115777inducesRas-independentapoptosisofmyelomacellsviamultipleintrinsicpathways.”,Mol.CancerTher.(2004)3:179-186)、洛那法尼(lonafarnib)(Wang等,“Thefarnesylproteintransferaseinhibitorlonafarnib(SCH66336)isaninhibitorofmultidrugresistanceproteins1and2”,Chemotherapy(2003)49:303-308)和BMS-214662(Rose等.“PreclinicalantitumoractivityofBMS-214662.；ahighlyapoptoticandnovelfarnesyltransferaseinhibitor”,CancerRes.(2001)61,7507-7517)。最近的许多出版物描述了其临床前效力(Haluska等,“Farnesyltransferaseinhibitorsasanticanceragents”,Eur.J.Cancer(2002)38,1685-1700；Sebti,“Blockedpathways:FTIsshutdownoncogenesignals”,Oncologist(2003)8(增刊3):30-38)。但是，这些试剂似乎均未朝向批准市售前进。

用于kRAS抑制的上游靶标包括酪氨酸激酶(Sawyers.,“Rationaltherapeuticinterventionincancer:kinasesasdrugtargets”,Curr.Opin.Genet.Dev.(2002)12:111-115)、GRB2/GEF相互作用(Quilliam等,“Membrane-targetingpotentiatesguaninenucleotideexchangefactorCDC25andSOS1activationofRAStransformingactivity”,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1994)；91:8512-8516)和GEF(Shields等,“UnderstandingRAS:“itain’tover’tilit’sover”.”,TrendsCellBiol.(2000)10；147-154)。

RAS蛋白在无活性GDP结合形式和活性GTP结合形式之间循环。该激活状态由GEF和GAP调节(图3)(Reuther等,“TheRASbranchofsmallGTPases:RASfamilymembersdon’tfallfarfromthetree”,Curr.Opin.CellBiol.(2000)12:157-165；Takai等,“SmallGTP-bindingproteins.Physiol.Rev.(2001)81:153-208；Cullen等.“IntegrationofcalciumandRASsignaling”,Nat.Rev.Mol.CellBiol.(2002)；3:339-348；Heldin,“Dimerizationofcellsurfacereceptorsinsignaltransduction”,Cell(1995)80:213-223；Lemmon等,“Regulationofsignaltransductionandsignaldiversitybyreceptoroligomerization”,TrendsBiochem.Sci.(1994)19:459-463；Weiss等,“NovelmechanismsofRTKsignalgeneration”,Curr.Opin.Genet.Dev.(1997)7:80-86)。当生长因子与酪氨酸激酶受体结合时，其形成活性同二聚体，后者经历自磷酸化。这导致接头蛋白SHC与生长因子受体结合2(growthfactorreceptorbound2，GRB2)结合。GRB2然后与GEF通过其SH3结构域缔和。GEF将结合的GDP交换成GTP，从而激活RAS蛋白并且启动信号传导级联。为了终止信号传导，GAP刺激RAS蛋白固有的GTP酶活性，引起GTP水解成GDP，导致RAS蛋白失活。

虽然众所周知难以调节蛋白质-蛋白质相互作用如RAS/GEF，但是已经鉴定了多种RAS-GEF。大部分研究工作集中于kRAS与特定GEF——sonofsevenless(SOS)的相互作用。与kRAS/SOS接触表面相邻的口袋能够与小分子结合(Maurer等.,“Small-moleculeligandsbindtoadistinctpocketinRASandinhibitSOS-mediatednucleotideexchangeactivity”,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2012)109:5299-5304)，并且基于NMR的片段筛选最近鉴定了同与kRAS/SOS接触表面相邻的口袋结合并且随后干扰kRAS/SOS相互作用的小分子。但是，未报道来自该方法的药物候选物。

kRAS可以与许多下游效应蛋白相互作用，以改变细胞存活和增殖(图4)(Schlessinger,“Cellsignalingbyreceptortyrosinekinases”,Cell(2000)103:211-225；Repasky等,“Renewingtheconspiracytheorydebate:doesRaffunctionalonetomediateRASoncogenesis？”,TrendsCellBiol(2004)14:639-647)。主要包括RAF蛋白激酶、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、RAS相关蛋白Ral的鸟苷酸交换因子(RalGDS)和磷脂酶Cε(PLCε)。RAF启动丝裂原活化蛋白(MAP)激酶级联，其激活细胞外信号调节激酶(ERK)。这种活性激酶具有多个靶标，包括转录因子ELK1，其调节细胞周期进展基因的表达(Leevers等,“RequirementforRASinRafactivationisovercomebytargetingRaftotheplasmamembrane”,Nature(1994)369:411-414；Marais等,“RASrecruitsRaf-1totheplasmamembraneforactivationbytyrosinephosphorylation”,EMBOJ.(1995)14:3136-3145；Finney等,“RAS-Rafcomplexes:analysesofcomplexesformedinvivo”,MethodsEnzymol.(1995)255,310-323；Johnson等,“IdentificationofkeyresiduesintheA-Rafkinaseimportantforphosphoinositidelipidbindingspecificity”,Biochemistry(2005)44:3432-3440；Ghosh等,“FunctionalanalysisofaphosphatidicacidbindingdomaininhumanRaf-1kinase:mutationsinthephosphatidatebindingdomainleadtotailandtrunkabnormalitiesindevelopingzebrafishembryos”,J.Biol.Chem.(2003)278:45690-45696)。PI3K途径激活AKT并且导致促存活基因的转录、细胞骨架重塑和多种转录因子途径(最显著的NF-κB)的激活(Rodriguez-Viciana等,“Phosphatidylinositol-3-OHkinaseasadirecttargetofRAS”,Nature(1994)370:527-532；Pacold等,“CrystalstructureandfunctionalanalysisofRASbindingtoitseffectorphosphoinositide3-kinaseγ”,Cell(2000)103:931-943)。RAL1结合蛋白的激活导致参与细胞生长、增殖和分化的FOX转录因子被抑制(DeRuiter等,“RegulationoftheForkheadtranscriptionfactorAFXbyRal-dependentphosphorylationofthreonines447and451”,Mol.Cell.Biol.(2001)21:8225-8235)。RalGDS还可以通过JNK途径进行信号传导以刺激促存活基因和细胞周期进展基因的转录(González-García等,“RalGDSisrequiredfortumorformationinamodelofskincarcinogenesis”,CancerCell(2005)7,219-226；Hofer等,“ActivatedRASinteractswiththeRalguaninenucleotidedissociationstimulator”,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1994)91:11089-11093)。PLCε的激活导致蛋白激酶C(PKC)激活以及来自细胞内储库的钙的动员。

kRAS的这些下游效应子代表了当前在制药工业中研究的一些最重要的癌症靶标。kRAS的这些下游靶标的重要性提供了kRAS在癌症进展和传播中的重要性的进一步证据。

除了kRAS在促进癌症中的显著作用外，这种GTP酶还在影响抑制EGF途径的主要类型抗癌药物的效力中具有关键作用。如之前提到的，kRAS是控制细胞增殖、分化和存活的EGFR下游信号传导级联中的主要效应分子。kRAS从EGFR受体向主要信号传导系统如MAPK和PI3K-AKT系统传递生长信号。突变的kRAS允许EGFR系统绕过存在于EGF系统中的天然控制，并且锁定在促生长模式连续工作(野生型kRAS是自失活的，而致癌性kRAS不是自失活的)。与该机制一致，突变kRAS的存在预示着缺少对用于治疗结直肠癌和许多其他癌症的抗EGF单克隆抗体药物如帕尼单抗或西妥昔单抗的响应。事实上，当前预测结直肠癌患者是否响应于这些常用EGFR抑制药物之一的最可靠方法是测试编码kRAS的基因中的“活化”突变。在这点上，作为缺乏对抗EGF治疗剂的响应的预测，G12V突变似乎比G13D突变更有效。(Chen等,“AssociationbetweenkRAScodon13mutationsandclinicalresponsetoanti-EGFRtreatmentinpatientswithmetastaticcolorectalcancer:resultsfromameta-analysis”,CancerChemotherPharmacol.(2013)71:265-72；MaoC等,“kRASp.G13Dmutationandcodon12mutationsarenotcreatedequalinpredictingclinicaloutcomesofcetuximabinmetastaticcolorectalcancer:asystematicreviewandmeta-analysis”,Cancer.(2013)119:714-721)。

在2009年，FDA将治疗转移性结直肠癌的帕尼单抗和西妥昔单抗的标签更新为包括关于利用这些具有kRAS突变的试剂失活的信息。因此，靶向造成使这些药物失活的突变形式的kRAS而不影响其正常形式的药物应恢复抗EGF药物的活性。

概述

提供了包含RAS转基因的非哺乳类转基因动物，例如蝇。还提供了使用本发明的转基因非哺乳类动物来鉴定具有关于细胞增殖疾病(例如，肿瘤疾病)的活性的化合物的方法。

附图简述

图1.RAS的信号传导途径。与活化的生长因子受体缔合的酪氨酸激酶经历自磷酸化并且与接头蛋白SHC和GRB2相互作用。这些蛋白质与多种GEF缔合，后者将GDP交换成GTP，从而激活RAS蛋白。GAP刺激RAS蛋白的固有GTP酶活性，引起GTP水解成GDP，从而使蛋白质失活。

图2.标记了主要突变位点的人kRAS的序列。

图3.RAS蛋白的翻译后加工。法尼基转移酶(FTase)催化法尼基向新合成的RAS蛋白的末端半胱氨酸转移。接下来，通过内肽酶RAS转化酶1(RCE1)切割三个C末端氨基酸。通过异戊烯半胱氨酸羧甲基转移酶1(ICMTI)实现末端半胱氨酸残基的羧甲基化。最后，棕榈酰基转移酶(PTase)将棕榈酰基转移到HRAS、NRAS和kRAS-4A同种型的C末端半胱氨酸残基上。

图4.RAS的下游信号传导。RAS与多种下游效应子相互作用。主要包括RAF蛋白激酶、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、RAS相关蛋白Ral的鸟苷酸交换因子(RalGDS)和磷脂酶Cε(PLCε)。

图5.示出了使用根据本发明实施方案的基因修饰蝇的药物筛选方案的图。

图6.12V人kras基因。

图7.示出了BglII和XhoI位点的位置的pUAST图。

图8.对照(仅GAL4)蝇、kRAS突变(G12V)蝇以及利用溶解在DMSO中的deltarasin类似物从kRAS/kRAS×MS1096GAL4突变F1表型中拯救的蝇的图片。

发明详述

提供了包含RAS转基因的非哺乳类转基因动物，例如蝇。还提供了使用本发明转基因非哺乳类动物来鉴定具有关于细胞增殖疾病(例如，肿瘤疾病)的活性的化合物的方法。

在非常详细描述本发明之前，应理解的是，本发明不限于描述的特定实施方案，其本身无疑可以变化。还应理解的是，本文中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不是旨在限制，因为本发明的范围将仅由所附权利要求限制。

当提供值的范围时，应理解的是，该范围的上限和下限之间的每一个介入的值(除非上下文另外明确指出，否则为下限单位的十分之一)以及该指出的范围中的任何其他指出的或介入的值均涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包含在较小范围内，并且也涵盖在本发明内，符合指出的范围中的任何特定排除限。当指出的范围包含一个或全部两个界限时，排除一个或全部两个这些包含的界限的范围也包括在本发明内。

某些范围在本文中通过前面带有术语“约”的数值表述。术语“约”在本文中用于为其后面的精确数字以及紧接或近似于该术语后面的数字的数字提供字面支持。在确定一个数字是否接近或近似于特别叙述的数字时，接近或近似的未叙述数字应该为在其所存在的语境中提供特别叙述的数字的基本等效果的数字。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员的通常理解相同的含义。虽然在本发明的实践和测试中可以使用与本文描述的那些类似或等效的任何方法和材料，但是现在描述代表性示例性方法和材料。

本说明书引用的所有出版物和专利均通过引用并入本文，如同每个单独出版物或专利均被明确和单独地指出通过引用并入，并且通过引用并入本文以公开和描述与出版物引用的那些相关的方法和/或材料。对于任何出版物的引用是为了其在申请日之前的公开内容，并且不应解释为承认本发明没有资格凭借在先发明而先于该出版物。另外，提供的出版物的日期可能不同于实际公开日，后者可能需要单独确认。

应注意，如本文以及所附权利要求中所使用，单数形式的“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数指示物，除非上下文另外明确指出。还应注意，权利要求可能拟定为排除了任何任选的要素。因此，该陈述旨在用作使用与权利要求要素的叙述联用的此类排他性术语如“唯”、“仅”等或使用“负性”限制的前提基础。

在阅读本公开内容后，对本领域技术人员将显而易见的是，本文描述和示例的每一个单独实施方案具有离散元件和特征，其可以容易地与任意其它若干个实施方案的特征分离或组合而不脱离本发明的范围和精神。任何叙述的方法可以以所叙述事件的顺序或者任意其他逻辑上可行的顺序实施。

转基因动物模型

如上文概括的，本发明的方面包括非哺乳类RAS转基因动物。许多不同类型的非哺乳类多细胞生物体可用于本发明方法，其中这些类型的生物体包括昆虫、两栖类、鱼等。具体的感兴趣的生物体包括但不限于：爪蟾(Xenopus)、斑马鱼(Zebrafish)、隐杆线虫(Caenerhabditis)、果蝇(Drosophila)等。在某些实施方案中感兴趣的是无脊椎动物，例如节肢动物门的成员，包括昆虫纲的成员。在某些实施方案中感兴趣的是蝇。在一些情况下，蝇是果蝇(Drosophilidae)科的成员，例如黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)。本发明中使用的多细胞生物体可以处于其生命中的任何年龄段，例如，幼体阶段、成体阶段等。

感兴趣的转基因动物的一些方面是动物具有稳定整合的RAS转基因。术语“转基因”在本文中用于描述已经被或将要被人为插入到细胞基因组中的遗传物质。因为感兴趣的动物的整合的转基因是RAS转基因，转基因包括编码RAS蛋白的ras核酸编码序列。在一些情况下，RAS蛋白是hRAS、nRAS或kRAS。在一些情况下，编码的RAS蛋白是哺乳动物RAS蛋白，例如小鼠或人RAS蛋白。

在一些情况下，转基因编码野生型RAS蛋白的变体，其中感兴趣的变体包括同源物、突变体等。在一些情况下，编码的RAS蛋白是RAS同源物。所谓同源物意指与野生型RAS蛋白(例如，具有图2中提供的序列的人kRAS)相比具有至少10％或更多，例如20％或更多，并且包括30％或更多，例如35％或更多，40％或更多，并且包括60％或更多的氨基酸序列同一性的蛋白质，如使用D.G.Higgins和P.M.Sharp,"FastandSensitivemultipleSequenceAlignmentsonaMicrocomputer,"(1989)CABIOS,5:151-153中描述的MegAlign,DNAstar(1998)clustal算法(使用的参数为ktuple1,缺口罚分3,窗口5以及diagonalsaved5)确定的。在一些实施方案中，感兴趣的同源物具有更高的序列同一性，例如65％、70％、75％、80％、85％、90％或更高。还感兴趣的是与野生型蛋白质基本相同的蛋白质，其中所谓基本相同意味着该蛋白质与野生型蛋白质的序列具有60％或更多，例如65％或更多，并且包括70％或更多的氨基酸序列同一性，其中在一些情况下，同一性可以更高，例如75％、80％、85％、90％、95％或更高。

RAS转基因还可以编码突变RAS蛋白。突变体可以保持野生型(例如，天然存在的)蛋白质的生物学特性，或者可以具有不同于野生型蛋白质的生物学特性。突变体可以变化，并且可以包括单氨基酸改变、一个或更多个氨基酸(其可以连续或不连续)的插入或缺失，N末端截短、C末端截短等。

在一些情况下，转基因编码包括一个或更多个氨基酸取代突变的突变人kRAS蛋白。感兴趣的取代突变包括G12突变、G13突变和Q61突变。例如，突变蛋白可以包括G12X突变，其中X是G以外的任意氨基酸。具体的取代突变包括但不限于：G12V、G13D和Q61L。

在一些情况下，转基因动物中的RAS转基因表现为动物成体阶段中显著的非致死性表型。所谓非致死性意味着成体是活的并且在至少足够观察表型的时间段例如1天或更久、5天或更久、10天或更久等表现出表型。所谓可观察的表型意味着在动物的成体阶段表型可以在视觉上观察到，以及可以在任何解剖特征中观察到。例如，对于蝇，解剖学特征包括眼、翅、腿等。当解剖学特征是眼时，感兴趣的可观察的表型包括但不限于粗糙边缘、存在/缺失、颜色、形状、粗糙边缘等。当解剖学特征是翅时，感兴趣的可观察的表型包括但不限于：褶皱翅、不完全翅(翅缺失一个或更多个部分)等。

RAS转基因可以广泛表达或者以组织特异性方式表达，即其中转基因在动物的一个或更多个组织中表达，而不是动物的所有组织中表达。例如，转基因可以仅在翅组织、仅在眼组织等中表达等。此外，转基因可以在动物的整个生命阶段表达，或者在一个或更多个阶段表达，而不是在动物的整个生命阶段表达。

需要时，可以将转基因以将其表达在空间上控制在期望的细胞类型的方式稳定整合到动物的基因组中。特别地，可以将本发明转基因在提供于感兴趣的特定组织(例如，翅组织)中表达的启动子的控制下稳定整合到动物的基因组中。转基因可以在提供这种需要的空间表达模式的任何便利的启动子的控制下，其中启动子可以是动物内源性的或外源性的。

可以以提供通过启动子直接或间接表达激活的方式，即以提供通过启动子的基因表达的顺式或反式激活的方式，将转基因整合到蝇基因组中。换言之，转基因的表达可以通过启动子直接介导，或者通过一种或更多种反式激活剂介导。当转基因在启动子的直接控制下时，即，启动子以顺式方式调控转基因的表达时，转基因在足够接近启动子的位点并且在具有启动子的框内被稳定整合到蝇的基因组中，以使得发生通过启动子的顺式调控。

在其中转基因的表达由内源启动子直接介导的另一个实施方案中，启动子通过一种或更多种反式激活剂，通常一种反式激活剂(即，其表达由启动子直接控制并且以足以开启转基因的表达的方式与转基因的区域结合的试剂)来控制转基因的表达。可以使用任何便利的反式激活剂，其中在某些实施方案中使用GAL4反式激活因子系统。

在其中转基因蝇包含GAL4靶向表达系统的这些实施方案中，以一定方式将GAL4编码序列整合到动物的基因组中，以使得其与提供以合适的空间和时间表达的内源启动子可操作地连接。这样的蝇的实例是从布鲁明顿果蝇品系中心(BloomingtonStockCenter)获得的蝇品系MS1096(Bloomington,Indiana，库存编号8860)。MS1096在果蝇翅中表达GAL4，因此仅驱动果蝇翅中UAS响应性kRAS转基因的表达。转基因稳定整合到基因组的不同位置，通常基因组的随机位置，其中转基因与上游激活序列(即，UAS序列)可操作地连接，GAL4与该UAS序列结合并且开启转基因的表达。具有UAS:GAL4反式激活系统的转基因蝇是本领域技术人员已知的，并且描述在Brand和Perrimon,Development(1993)118:401-415以及Phelps和Brand,Methods(April1998)14:367-379中。

本发明转基因蝇可以以使用任何便利的方案制备，所述方案以足以提供转基因的期望表达的方式(例如，以普遍或组织特异性(例如，翅特异性)方式)提供转基因在蝇基因组中的稳定整合。可以使用许多不同策略来获得具有必要表达模式的转基因整合。通常，产生本发明转基因蝇的方法涉及将转基因稳定整合到蝇基因组中。稳定整合通过首先将转基因引入到蝇的细胞(例如蝇胚胎中)来实现。转基因通常存在于合适的载体(例如质粒)上。可以使用任何便利的方案实现转基因的引入，其中合适的方案包括：电穿孔、显微注射、囊泡递送，例如脂质体递送媒介物等。在将转基因引入到细胞中后，转基因稳定整合到细胞基因组中。稳定整合可以是位点特异性的或随机的，但通常是随机的。

当整合是随机的时，可以利用转座酶来整合转基因。在此类实施方案中，将转基因在载体中引入到细胞中，所述载体包括必需的末端31个碱基对的反向重复。当待整合转基因的细胞不包含内源转座酶时，还向细胞引入编码转座酶载体，例如包含转座酶基因的辅助质粒，如pTURBO(如在Steller和Pirrotta,“PTransposonsControlledbytheHeatShockPromoter,”Mol.Cell.Biol.(1986)6:1640-1649中公开)。将转基因随机整合到目标黑腹果蝇细胞的基因组中的方法公开在美国专利号4,670,388和6,475,798中，其公开内容通过引用并入本文。

在其中转基因以随机方式稳定整合到蝇基因组中的那些实施方案中，还提供了在蝇发育期间的合适时间选择性表达转基因的方法。换言之，提供了获得转基因的靶向表达的方法。为了获得随机整合的转基因的期望的靶向表达，可以使用转基因上游的特定启动子的整合，作为P因子载体中的单个单位。或者，可以使用调节转基因的表达的反式激活因子。特别感兴趣的是上文的Brand和Perrimon中描述的GAL4系统，例如，上文描述的。

在某些实施方案中，如下来产生转基因蝇：(1)产生两个不同的转基因蝇品系：(a)第一品系，其以组织特异性方式表达GAL4，例如在翅组织中，如上文所述的；以及(b)第二品系，其中转基因稳定整合到细胞基因组中并且与UAS结构域融合；(2)使两个品系杂交；以及(3)筛选具有期望表型(即自发出现赘生肿瘤)的后代。上述步骤中的每一步均是本领域技术人员熟知的。参见，例如Brand和Perrimon,Development(1993)118:401-415；以及Phelps和Brand,Methods(April1998)14:367-379。还参见下文的实验部分。在另一个实施方案中，将对于G12V基因型所描述的方法用于产生表达其他常见kRAS突变体G13D和Q61L的kRAS突变蝇。除了包含单突变的蝇外，在一些实施方案中，使用具有多突变的蝇，例如G12V和G13DV，G12V和Q61L，G13DV和Q61L，甚至包含全部三个突变的蝇。

上述策略用于获得包含以一定方式稳定整合到基因组的转基因的受精卵，以使得转基因以正确的空间和时间方式表达，使卵得到表现出期望表型(例如，褶皱翅表型)的成蝇。可使受精卵在产生瘤表型的条件下成熟。

可以通过改变使动物成熟的条件来调节动物的表型。例如，可以使用温度调节本发明动物表型的性质。

应用

本发明动物可用于多种应用，包括作为鉴定用于治疗细胞增殖病症的治疗性化合物的筛选工具(例如，作为用于人肿瘤疾病病症的动物模型)。通过使用本发明转基因动物，例如蝇(或根据特定筛选试验由其得到的细胞)，可以鉴定具有关于肿瘤疾病的活性的化合物。如果化合物调节或影响疾病的至少一种参数或症状，例如减少异常细胞分裂或与其相关的并发症，则化合物具有关于肿瘤疾病的活性，其中根据疾病和症状的性质，调节活性可以是降低或增强症状的量级。因此，本发明筛选方法可用于鉴定调节肿瘤疾病进展的化合物(例如，通过与参与肿瘤疾病进展的蛋白质或肽结合、调节、增强或抑制所述蛋白质或肽的活性)，和/或改善、减轻或甚至移除疾病的表型症状的化合物，其中这样的活性可以是或不是关于疾病的潜在机制的活性的结果。还可能感兴趣的是筛选以确定对肿瘤病症没有作用的药物。本发明的测定可以鉴定化合物，所述化合物最终:(1)具有关于肿瘤病症的积极影响并因此是治疗剂，例如阻止或逆转肿瘤病症或者改善或减轻此类病症的症状的药剂；或(2)具有关于肿瘤疾病的不利影响并因此应避免作为治疗剂。

在本发明的筛选方法中，通常向动物(例如，蝇)经口施用一定量的候选药剂。在经口施用后，测定候选药剂对于可观察的表型(例如，褶皱翅)的影响，通常通过与对照(即，未施用候选药剂的转基因蝇)比较。通过确定与对照蝇相比试验蝇中肿瘤病症的一种或更多种表型特征是加重还是改善来确定候选药剂的影响，其中监测的特征包括褶皱翅等。可以如下来向蝇经口施用候选药剂：将药剂混合到蝇的营养培养基(例如，具有额外的营养剂的水、水溶液等)中，将培养基放置到蝇(幼虫或成蝇)的面前以使得蝇进食培养基。需要时，具有不同药剂浓度的多个测定混合物可以平行进行，以获得对于多个候选药剂浓度的不同响应。便利地，这些浓度中的一个作为阴性对照，即，没有化合物。在某些实施方案中，使用高通量筛选方案，其中使用大量蝇平行测试大量候选药剂。所谓“大量”意指多个，其中多个意指10至50个或更多，例如100个或更多，并且包括1000个或更多，其中数目可以是10,000个或50,000个或更多，并且在一些情况下，5000个或更少。

在某些实施方案中，感兴趣的是在高通量毒性筛选测定中使用本发明蝇，例如美国专利号6,855,504和6,365,129中所述的，其公开内容通过引用并入本文。在此类高通量筛选测定中，如果有话，同时测定多种不同的化合物组合物，通常10种或更多种不同的化合物组合物的活性。通过将多种中的每一种化合物组合物与具有表型的本发明转基因动物群接触并且确定化合组合物对动物的影响来测定其活性。这样的HTS方法可用于寻找用于治疗细胞增殖性疾病(例如，肿瘤疾病)的药剂，仅将治疗疾病并且充分无毒以允许动物存活的那些化合物鉴定为阳性用于进一步研究。

本发明方法可用于筛选多种不同的潜在治疗性候选药剂。候选药剂包括多种化学类型，但是其通常是有机分子，包括分子量为50或更多以及2,500-2000道尔顿或更少的小有机化合物。候选药剂包含用于与蛋白质相互作用的结构(特备是氢键)所必需的官能团，并且通常包括至少胺基、羰基、羟基或羧基，优选是所述化学官能团中的至少两种。候选药剂通常包含被一个活更多个上述官能团取代的环状碳或杂环结构和/或芳香族或多环芳香族结构。候选药剂通常还发现于生物分子，包括但不限于：肽、糖、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶，其衍生物、结构类似物或组合。

候选药剂从多种来源获得，包括合成或天然化合物文库。例如，多种方法可用于随机和直接合成多种有机化合物和生物分子，包括随机寡核苷酸和寡肽的表达。或者，细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物文库是可用的或容易产生的。或者，天然或合成产生的文库和化合物容易通过常规化学、物理和生物化学方法修饰，并且可用于产生组合文库。可以对已知的药理学药剂进行定向或随机化学修饰，例如酰化、烷基化、酯化、酰胺化等以产生结构类似物。还可以使用方法如合理药物设计或计算机建模来产生新的潜在治疗剂。

筛选可以针对已知的药理学活性化合物及其化学类似物，或者具有未知特性的新药剂，例如通过合理药物设计产生的那些。可基于其至少改善(如果未完全减轻或消除)本发明的成体转基因蝇的上述一种或更多种肿瘤表型，如肿瘤生长、肿瘤转移等的能力来鉴定具有关于肿瘤病症的治疗活性的候选药剂。

在某些实施方案中，感兴趣的是使用本发明筛选方法来鉴定表现出低宿主毒性并且对于作为抗肿瘤剂依然有效的癌症治疗剂。常规化学治疗和放射治疗以相同方式影响正常细胞和肿瘤细胞。由于这些治疗的主要机制仅影响分裂细胞，正常细胞的耐受性高，并且由于大部分正常细胞不分裂，所以对副作用耐受，但是副作用依然非常严重。本发明筛选方法使副作用具有高度严格性，因为幼虫发育成活蝇需要大量细胞分裂。因此，通过本发明筛选方法选择的抗转移瘤化合物对于杀伤或抑制肿瘤形成/生长/转移是高度特异性的，否则的话发育的蝇将会死亡。换言之，本发明方法代表了一种用于选择对正常发育和分裂细胞还具有低毒性的抗肿瘤药物候选物的灵敏的系统。

上述筛选方法可以是评估候选治疗剂在治疗哺乳动物宿主(例如，人)中的肿瘤疾病的效力(以及安全性)的多步筛选方法的一部分。在本发明的多步筛选方法中，在本发明转基因动物模型中筛选后，将候选化合物或化合物文库在第二体内模型(例如，小鼠模型)中进行筛选。在本发明的非哺乳类转基因动物中初始筛选后，然后将阳性化合物在非人哺乳动物模型(包括转基因非人哺乳动物模型)中进行筛选。肿瘤疾病的转基因小鼠模型及其用于筛选测定的方法描述在美国专利号5,917,124、5,907,078、5,849,996、5,709,844、5,550,316和4,736,866中，其公开内容通过引用并入本文。另外，可以使用预体内筛选步骤，其中首先对化合物作为治疗肿瘤病症的治疗剂的潜力进行体外筛选测定。可以使用任何便利的体外筛选测定，其中多种合适的体外筛选测定是本领域技术人员已知的。

图5中示出了使用根据本发明实施方案的转基因蝇的筛选方案的一个实例。应注意，筛选依赖于在引入疾病或不利病症相关基因后在蝇中产生表型。然后使基因操作的蝇暴露于化学物质或其他因子的文库以寻找表型的逆转。然后在更常规的基于细胞培养的测定中测试阻止表型的化学物质或其他因子(“命中(hit)”)，并且如果在细胞培养中是活性的，进一步在所研究的特定疾病的啮齿类动物模型中检测命中。通常对在细胞培养和啮齿类动物模型中也具有活性的命中还进行额外的结构修饰以改善这些模型中命中的性能。在蝇中筛选有希望得到针对有希望的治疗靶标的更好的药物候选物。

本发明还提供了用于治疗肿瘤病症的治疗剂及其药物制剂。本发明的治疗剂是使用上文所述的筛选方法鉴定的表现出关于肿瘤疾病的有益活性的那些药剂(或已知对被认定调节肿瘤病症表型的基因的表达具有影响的药剂，其中鉴定使用本发明非转基因动物)。除了直接治疗肿瘤病症外，如本文所述鉴定的治疗剂还可以与其他药剂(例如，抗EGF治疗效力)组合使用(Webster等,“kRAStestingandepidermalgrowthfactorreceptorinhibitortreatmentforcolorectalcancerincommunitysettings”,CancerEpidemiolBiomarkersPrev(2013)22:91-101)以使得此类药剂更有效。还可以通过分析测量来指导来自本发明治疗剂的使用，以确定与施用治疗的患者相关的突变kRAS的表型(Anderson,“LaboratorymethodsforKRASmutationanalysis”,ExpertRevMolDiagn.(2011)11:635-642)。

还提供了本发明治疗剂的药物组合物。在本发明的药物组合物或制剂中，上述的药剂被通过与合适的药学上可接受的载体或稀释剂组合配制成药物组合物，并且可以配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂，例如片剂、胶囊、粉剂、颗粒、软膏剂、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂和气雾剂。在药物剂型中，药剂可以以其药学上可接受的盐的形式施用，或者其还可以单独使用或者与其他药学活性化合物适当地联合和组合使用。以下方法和赋形剂仅是示例性的而绝不是限制性的。

对于经口制剂，药剂可以单独使用或与合适的添加剂组合以制备片剂、粉剂、颗粒或胶囊，例如，与常规添加剂，如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉；与粘合剂，例如结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶；与崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠；与润滑剂，例如滑石或硬脂酸镁；并且需要时，与稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂和调味剂组合。

药剂可以通过在水或非水溶剂中溶解、悬浮或乳化来配制成制剂，所述溶剂例如植物油或其他类似油、合成脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸的酯或丙二醇；并且如果需要，具有常规添加剂，例如增溶剂、等张剂、助悬剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。

药剂可用于气雾剂制剂以通过吸入施用。本发明化合物还可以配制到加压的可接受推进剂中，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等。

此外，药剂可以通过与多种基质如乳化基质或水溶性基质混合来制备成栓剂。本发明的化合物可以通过栓剂经直肠施用。栓剂可以包含在体温下熔化而在室温下为固体的媒介物，例如可可油、碳蜡和聚乙二醇。

可以提供用于经口或直肠施用的单位剂型，例如糖浆剂、酏剂和悬浮剂，其中每一个剂量单位(例如一满匙、片剂或栓剂)含有预定量的含一种或更多种抑制剂的组合物。同样地，用于注射或静脉内施用的单位剂型可以包含在作为无菌水、生理盐水或其他药学上可接受的载体中的溶液的组合物中的抑制剂。

如本文使用的术语“单位剂型”是指适合作为单一剂量用于人和动物受试者的物理离散单位，每个单位包含与药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂结合的按足以产生期望效果的量计算的预定量的本发明化合物。本发明的新单位剂型的规格取决于所使用的特定化合物和待实现的效果，以及与宿主中的每种化合物相关的药效学。

药学上可接受的赋形剂如媒介物、佐剂、载体或稀释剂是公众容易获得的。此外，药学上可接受的辅助物质如pH调节剂和缓冲剂、紧张性调节剂、稳定剂、润湿剂等是公众容易获得的。

当药剂是多肽、多核苷酸、其类似物或模拟物(如使用上文所述的突变筛选试验方案鉴定的)时，可以将其通过任何数目的途径引入到组织或宿主细胞中，包括病毒注射、显微注射或囊泡融合。对于肌肉内施用可以使用喷射注射，例如Furth等(1992),AnalBiochem205:365-368中描述的。DNA可以涂覆到金微粒上，并且通过颗粒轰击装置或“基因枪”皮内递送(参见，例如Tang等(1992),Nature356:152-154)，其中用DNA涂覆金微粒，然后轰击到皮肤细胞中。

本领域技术人员将容易理解，剂量水平可以根据特定化合物、症状的严重性以及受试者对副作用的易感性而改变。本领域技术人员容易通过多种手段确定给定化合物的优选剂量。

提供了具有通常为经口或可注射剂量的单位剂量的活性剂的试剂盒。在这样的试剂盒中，除了含有单位剂量的容器外，还有描述药物在治疗目标病理性病症中的使用和伴随的益处的信息包装说明书。优选的化合物和单位剂量是上文描述的那些。

还提供了使用本发明活性剂治疗细胞增殖疾病病症，特别是肿瘤疾病病症的方法。在本发明方法中，向待治疗宿主施用有效量的本发明的活性剂。所谓“有效量”意指足以产生期望结果的剂量，其中期望结果通常是改善或减轻(如果未完全中止的话)被治疗的细胞增殖疾病的一种或多种症状。可以通过多种方式实现药剂的施用，包括经口、颊、直肠、胃肠外、腹膜内、皮内、经皮、气管内等。多种宿主可根据本发明方法治疗。通常，这样的宿主是“哺乳类”或“哺乳动物”，其中这些术语用于广义地描述哺乳纲的生物体，包括食肉动物目(例如，狗和猫)、啮齿目(例如，小鼠、豚鼠和大鼠)以及灵长目(例如，人、黑猩猩和猴)。在许多实施方案中，宿主是人。

通过举例说明的方式而绝不是限制的方式提供了以下实施例。

实验

实施例1-插入到pUAST载体中的突变人kRAS的合成

为了制备这种载体，用BglII和XhoI消化来自Genecopia(Rockville,MD)的人kras-12V基因，并且将来自kras-12V穿梭载体的BglII-XhoI片段插入到pUAST载体中。

BglII和XhoI酶购自NewEnglandBioLabs(NEB/Ipswich,MA)，目录号分别为R0143和R0146。pUAST载体由斯坦福大学(PaloAlto,CA)的MicheleCalos博士馈赠。将来自Genecopia的质粒和pUAST载体分别用来自NEB的酶在编号3.1的NEB缓冲液中于37℃消化4小时。将消化产物在水平1％琼脂糖凝胶上分离，并且使用目录号A281的Promega(Fitchburg,WI)凝胶纯化试剂盒纯化。对于pUAST和kras片段，分离的DNA的大小分别为8893bp和582bp。

使用来自NEB的T4DNA连接酶在同样来自NEB的T4DNA连接酶缓冲液中连接DNA片段。将连接的混合物转化到大肠杆菌(E.Coli)中并且在LB-AMP平板上铺板。将氨苄青霉素抗性菌落挑选到2mLLB中并且进行Promega(Fitchburg,WI)小量制备物(试剂盒编号A1330)。在Sequetech(MountainView,CA)上分析来自小量制备物的分离株以确认正确kRAS-12V序列在pUAST载体中的插入。

将pUAST中kras-12V的DNA发送到BestGene(Chino,CA)用于胚胎注射以及选择kRAS蝇。

实施例2.突变kRAS/Cyo蝇的产生

将实施例1中描述的pUAST-12Vkras质粒发送到BestGene,Inc.(Chino,CA)用于转化到蝇基因组中。果蝇背景为w¹¹¹⁸。BestGeneInc.的人员回收了具有分别插入在第一、第二和第三染色体上的突变kras的转基因成蝇。将每一个单独转基因品系发送到Tosk作为平衡储备。

注射了约200个胚胎并且饲养到成虫(称为第0代，即，G0蝇)。约140个G0幼虫孵化，并且约120个成虫化蛹。使这些G0成虫中约100个与5×w¹¹¹⁸蝇杂交，即1×G0雄性与5×w¹¹¹⁸雌性(virgins)杂交，并且1×G0雌性与5×w¹¹¹⁸雄性杂交(约100个杂交小瓶)。上述杂交中约80个可繁殖并且产生G1蝇。80个杂交中的每一个在其单个小瓶中产生约300个单独G1蝇。

检查每个小瓶的G1转化子创始者(G1transformantfounders)。如果发现，将G1转化子创始者(G2)再次杂交(这是转化系)。如果同一小瓶中有第二转化子(“G1同科”)，将其保持为备份以防止初始G1转化子死亡。重复该过程直到完成所有杂交，或者发现第十个G1转化子。

利用以下平衡株对每个创始者进行三次独立杂交：(1)具有附接的X的FM7i/XX,(2)CyO/Sco和(3)TM3tb/TM6Bsb。所得G3成虫自交(红眼并且具有适当的平衡表型)。仅保持每个初始创始者成功平衡的一个杂交。另外，从初始kRAS/CyO储备中分离kRAS/kRAS蝇，繁殖并且用于随后kRAS/kRAS×MS1096以产生表达突变表型的后代。实施例3.突变kRAS/kRAS×MS1096蝇的产生

UASkRAS蝇中的pUAST构建体具有UAS增强子元件。GAL4转录因子与UAS元件的结合诱导UAS下游基因的表达。使在特定组织中表达GAL4的果蝇成虫与在表达GAL4的相同组织中诱导强的kRAS表达的pUAST-kRAS转化子杂交。

MS1096购自Bloomington,Indiana的果蝇储备中心(储备号8860)。MS1096在果蝇翅中表达GAL4，因此仅在果蝇翅中驱动致癌kRAS的表达。

将约25只雄性突变kRAS蝇和约25只MS1096雌性放置在配备有塞子(VWR,目录号89140-960)的250mL聚苯乙烯烧瓶(VWR,Radnor,PA,目录号16004-084)中。烧瓶的底部装有约10g使用公开的方案¹制备的葡萄琼脂。使用镊子将50个胚胎转移到配备有塞子(VWR,目录号89168-886)的玻璃小瓶(VWR,目录号89092-720)中。小瓶底部装有约1/2茶匙的来自CarolinaBiologicalSupply(Burlington,NC)的蓝色蝇食，目录号173216。

14天后，检查蝇的有缺陷的翅。图8中示出了具有突变kRAS表型的翅的典型实例。翅是褶皱/kringled并且无功能的。

实施例4.筛选逆转突变kRAS/kRAS×MS1096蝇的翅表型的药物

使雄性突变kRAS/kRAS蝇与雌性MS1096/GAL4蝇在具有葡萄琼脂板地板的蝇舍(flycondo)²中繁殖过夜。使用含有蒸馏水中的0.7％NaCl、0.03％TritonX-100的喷射瓶从葡萄琼脂板上轻轻逐出所得胚胎。对胚胎计数然后溶解在含有14.4％蔗糖、0.7％NaCl和0.05％Triton的溶液中，以得到15个胚胎/10μL溶液的浓度。

将具有针对RAS信号传导活性的deltarasin类似物——试验物质1-苄基-2-苯基-1H-苯并[d]咪唑¹溶解在DMSO中以得到10mM的浓度。在Tosk设备中合成deltarasin类似物抑制剂。将4μL这种溶液、100μL胚胎溶液(150个胚胎)、1/2茶匙蓝色蝇食(NorthCarolina,目录号173216)和4ml水在小瓶(VWR,目录号89092-720)中组合并且盖上盖子(VWR,目录号89168-886)。使用上文提供的食谱，混合物中试验物质的最终浓度为10μM。

将小瓶在25℃孵育器中放置14天，然后检查具有褶皱/圆形翅的蝇的百分比。以下的图8中提供了通过用试验物质处理拯救的蝇的典型结果。虽然依然没有功能，蝇的翅具有显著更少的褶皱/kringled。筛选抗kRAS活性的化学物质的目标在利用deltarasin类似物从褶皱/kringled翅表型拯救的kRAS突变蝇中实现。

从上述结果可以看到，还在本发明突变动物中证明了具有抗肿瘤活性的已知化合物的抗肿瘤活性。上述结果证实了要求保护的突变动物作为具有抗肿瘤活性的药剂的筛选工具

下表1比较了来自对照蝇、kRAS突变蝇和通过用试验物质处理拯救的蝇的翅的典型外观。

从上述的结果和讨论很明显的是，本发明提供了用于评估用于治疗细胞增殖疾病的潜在治疗剂的有价值的筛选工具。使用本发明转基因蝇筛选潜在治疗性候选物的优点包括：本发明的蝇适合于高通量筛选方案，维持本发明蝇简单并且成本低，本发明蝇能够鉴定潜在的经口活性治疗剂，本发明蝇繁殖迅速，以及本发明蝇能够产生大量后代。因此，本发明填充了现有筛选工具库的空白，因为本发明提供了用于进行体内高通量筛选测定的方法。进一步的显著优点是能够使用本发明蝇鉴定对正常分裂细胞表现出低毒性或无毒性但是对异常分裂细胞依然表现显著毒性的化合物。因此，本发明筛选方法提供了用于鉴定对正常细胞表现出低毒性或无毒性的有效抗肿瘤剂的手段。因此，本发明对本领域具有显著贡献。

尽管具有所附条款，本公开内容还通过以下条款限定：

1.一种非哺乳类突变动物，其中所述动物包含RAS转基因。

2.根据条款1所述的非哺乳类突变动物，其中所述RAS转基因是kRAS转基因。

3.根据条款2所述的非哺乳类突变动物，其中所述kRAS转基因是人kRAS转基因。

4.根据条款3所述的非哺乳类突变动物，其中还所述人kRAS转基因包含取代突变。

5.根据条款1所述的非哺乳类突变动物，其中所述动物是无脊椎动物。

6.根据条款5所述的非哺乳类突变动物，其中所述无脊椎动物是昆虫。

7.根据条款6所述的非哺乳类突变动物，其中所述昆虫是蝇。

8.根据条款8所述的非哺乳类突变动物，其中所述蝇是果蝇科的成员。

9.根据条款8所述的非哺乳类突变动物，其中所述蝇是黑腹果蝇。

10.根据条款1所述的非哺乳类突变动物，其中所述转基因广泛表达。

11.根据条款1所述的非哺乳类突变动物，其中所述转基因以组织特异性方式表达。

12.根据条款11所述的非哺乳类突变动物，其中所述转基因在翅组织中表达。

13.根据条款1所述的非哺乳类突变动物，其中所述转基因以发育特异性方式表达。

14.一种转基因黑腹果蝇，其包含以足以表现出非致死性成虫表型的组织和发育特异性方式表达的kRAS转基因。

15.根据条款14所述的转基因黑腹果蝇，其中所述非致死性成虫表型包括褶皱翅。

16.根据条款14所述的转基因黑腹果蝇，其中所述kRAS转基因编码突变kRAS蛋白。

17.根据条款16所述的转基因黑腹果蝇，其中所述突变kRAS蛋白包含点突变。

18.根据条款17所述的转基因黑腹果蝇，其中所述点突变包括G12突变。

19.根据条款17所述的转基因黑腹果蝇，其中所述点突变选自G12V、G13D和Q61L。

20.一种筛选具有关于细胞增殖疾病的活性的化合物的方法，所述方法包括：

向根据条款1至19中任一项所述的非哺乳类转基因动物施用所述化合物；以及

观察所述化合物对所述非哺乳类转基因动物的影响。

21.根据条款20所述的方法，其中向所述非哺乳类转基因动物经口施用所述化合物。

22.根据条款21所述的方法，其中在营养培养基中施用所述化合物。

23.根据条款21所述的方法，其中在经口施用所述化合物时所述非哺乳类转基因动物处于幼体发育阶段。

24.根据条款23所述的方法，其中在观察到所述化合物对所述动物的影响时，所述非哺乳类转基因动物处于成体发育阶段。

25.根据条款20所述的方法，其中所述细胞增殖疾病是肿瘤疾病。

26.根据条款25所述的方法，其中所述肿瘤疾病由kRAS突变介导。

27.根据条款20至26中任一项所述的方法，其中所述方法包括：

以足以确保每一种动物仅进食多种化合物中的单一种化合物的方式，向多种非哺乳类转基因动物饲喂多种化合物；以及

观察所述化合物对所述多种动物的影响。

28.根据条款20至27中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在随后的活性测定中进一步评估观察到具有活性的化合物。

29.根据条款28所述的方法，其中所述随后的活性测定是体外测定。

30.根据条款28所述的方法，其中所述随后的活性测定是体内测定。

尽管为了清楚地理解而通过例证和示例的方式相当详细地描述了前述发明，但是根据本发明的教导将对本领域技术人员显而易见的是，可以对其进行某些改变和修改而不脱离所附权利要求的精神或范围。

因此，前文仅说明了本发明的原理。应理解的是，本领域技术人员将能够设计出各种结构，尽管未明确描述或示出，但是这些结构体现了本发明的原理，并且包含在本发明的精神和范围内。另外，本文引用的所有实例和条件性语言主要旨在帮助读者理解本发明的原理以及由本发明人为了推动本领域发展所贡献的理念，并且应解释为不限于此类明确引用的实例和条件。另外，本文中叙述本发明及其特定实例的原理、方面和实施方案的所有陈述旨在涵盖其结构和功能等同物。此外，意图是此类等同物包括目前已知的等同物和未来开发的等同物，即开发的发挥相同功能的任何元件，而不论其结构如何。因此，本发明的范围并未旨在限制于本文示出和描述的示例性实施方案。相反地，本发明的范围和精神由所附权利要求体现。

¹苏利文·W，阿施博纳·M，霍利，SR，《果蝇实验指南(DrosophilaProtocols)2000》，冷泉港实验室出版社，第554页

²苏利文·W，阿施博纳·M，霍利，SR，《果蝇实验指南2000》，冷泉港实验室出版社，第541-551页。