miRNA-378在脂肪肝治疗中的应用

摘要

本发明公开了miRNA-378在脂肪肝治疗中的应用。具体地，本发明证实，肝脏中miR-378是调控胰岛素信号通路的核心元件。当小鼠肝脏过表达miR-378时，小鼠脂代谢稳态得到提升，主要表现为肝脏TG含量下降。其中，miR-378可以通过抑制胰岛素信号通路的关键蛋白p110α行使其功能。因此，在肝脏中通过过表达miR-378抑制p110α的表达可以成为一种新的治疗肝脏脂质蓄积的策略。

说明书

技术领域

本发明属于代谢性疾病治疗领域。具体地，涉及一种治疗脂肪肝的miRNA及其作用机制。

背景技术

肝脏是人体重要的代谢性器官，其可以感知来自激素、神经冲动以及营养代谢因子等多种信号并行使特定的功能。肝脏在调节机体糖脂平衡中有着十分重要的作用。而脂肪肝是由于机体脂代谢紊乱而导致肝细胞内甘油三酯(TG)蓄积过多而产生的病变。近年来，随着人们生活饮食结构的变化，脂肪肝的发病率逐年增加。长期的肝脏脂质沉积可能出现肝功能异常，严重者可导致肝纤维化、肝硬化，甚至引起肝功能衰竭。

目前，脂肪肝的治疗主要依靠降低血脂或生活方式的改变，如饮食控制、加强运动。但由于降血脂的同时还要同时达到抑制肝内脂肪的沉积，但某些降脂药甚至会加重肝功能障碍，而生活方式改变的主观性太强，患者依从性不够好。因此目前为止，还没有一种能够同时降低血脂的同时快速减少肝内脂肪堆积，从而治疗脂肪肝的有效方法。

因此，本领域迫切需要开发一种能够调整肝内脂肪代谢、抑制肝内脂肪沉积，从而治疗脂肪肝的方法。

发明内容

本发明提供了一种能够通过降低胰岛素代谢通路中特殊基因表达并降低肝内脂肪含量的miRNA-378，该miRNA能够有效地改善肝内脂肪蓄积，从而治疗脂肪肝。

本发明第一方面，提供了一种活性成分的用途，所述的活性成分选自下组：

(a).miRNA-378家族的微小RNA，所述miRNA-378家族的微小RNA包括：miRNA-378或经修饰的miRNA-378衍生物；或核心序列为5’CUGGACU3’、长度为18-26nt、功能与miRNA-378相同或基本相同的微小RNA或经修饰的miRNA衍生物；

(b).前体miRNA，所述的前体miRNA能在宿主内加工成(a)中所述的miRNA-378；

(c).多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主转录形成(b)中所述的前体miRNA，并加工形成(a)中所述的微小RNA；

(d).表达载体，所述表达载体含有(a)中所述的miRNA-378、或(b)中所述的前体miRNA、或(c)中所述的多核苷酸；

(e).(a)中所述的微小RNA的激动剂；

其中，所述的活性成分用于：

(i)制备抑制p110α基因或其蛋白表达和/或活性的药物组合物；和/或

(ii)制备治疗脂肪肝；和/或抑制肝内甘油三酯蓄积的药物组合物。

在另一优选例中，所述的药物组合物包括所述的活性成分和药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的miRNA-378还用于制备治疗p110α相关肿瘤。

在另一优选例中，所述的药物组合物还含有额外的p110α抑制剂。

在另一优选例中，(a)中所述的核心序列指微小RNA第2-8位的核苷酸序列；和/或所述的“功能与miRNA-378相同或基本相同”是指保留了miRNA-378的≥40％，且≤500％的抑制p110α基因或其蛋白表达和/或活性的功能。

在另一优选例中，所述的miRNA-378的序列如SEQIDNO.:1所示(ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC)

在另一优选例中，所述的miRNA-378来源于哺乳动物，优选地，来源于人、大鼠、或小鼠。

在另一优选例中，所述的药物组合物还包括任选的降脂药。

在另一优选例中，所述的降脂药包括(但不限于)：HMG—CoA还原酶抑制剂(他汀类药物)、烟酸及其衍生物、普罗布考以及贝特类等。

在另一优选例中，所述的经修饰的miRNA衍生物，其修饰选自下组的一种或多种修饰形式：核苷酸的糖基修饰、核苷酸之间连接方式的修饰、胆固醇修饰、锁核苷酸修饰、肽段修饰、脂类修饰、卤素修饰、烃基修饰、和核酸修饰。

在另一优选例中，所述的核苷酸的糖基修饰包括2-O-甲基的糖基修饰、2-O-甲氧乙酯的糖基修饰、2-O-烷基的糖基修饰、2-氟代的糖基修饰、糖环修饰、锁核苷酸修饰；和/或

所述的核苷酸之间连接方式的修饰包括硫代磷酸修饰、磷酸烷基化修饰；和/或

所述的核酸修饰包括“TT”修饰。

在另一优选例中，(a)中所述经修饰的miRNA衍生物是具有式I所示结构的化合物单体或其多聚体：

(X)n-(Y)m

式I，

在式I中，

各X为(a)中所述的微小RNA；

各Y独立地为促进微小RNA施药稳定性的修饰物；

Y连接于X的左侧、右侧或中间；

n为1-100的(较佳地1-20)正整数(较佳地n为1、2、3、4或5)；

m为1-1000的(较佳地1-200)正整数；

各“-”表示接头、化学键、或共价键。

在另一优选例中，所述的接头是长度为1-10个碱基的核酸序列。

在另一优选例中，所述的Y包括(但不限于)胆固醇、类固醇、甾醇、醇、有机酸、脂肪酸、酯、单糖、多糖、氨基酸、多肽、单核苷酸、多核苷酸。

在另一优选例中，(b)所述的前体miRNA的核苷酸序列如SEQIDNO.:2所示(前体序列)。

5’-AGGGCUCCUGACUCCAGGUCCUGUGUGUUACCUAGAAAUAGCACUGGACUUGGAGUCAGAAGGCCU-3’

在另一优选例中，(c)中所述的多核苷酸具有式II所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向

式II，

式II中，

Seq正向为能在宿主中被加工成所述的微小RNA核苷酸序列；

Seq反向为与Seq正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；

X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补；

并且式II所示的结构在转入宿主细胞后，形成式III所示的二级结构：

式III，

式III中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述，

||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。

在另一优选例中，(d)中所述的表达载体包括：病毒载体和非病毒载体。

在另一优选例中，(e)中所述miRNA-378的激动剂选自下组：促进miRNA-378表达的物质、提高miRNA-378活性的物质。

在另一优选例中，所述的药学上可接受的载体选自下组：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。

本发明第二方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有活性成分，和药学上可接受的载体，其中，所述的活性成分选自：

(a).miRNA-378家族的微小RNA，所述miRNA-378家族的微小RNA包括：miRNA-378或经修饰的miRNA-378衍生物；或核心序列为5’CUGGACU3’、长度为18-26nt、功能与miRNA-378相同或基本相同的微小RNA或经修饰的miRNA衍生物；

(b).前体miRNA，所述的前体miRNA能在宿主内加工成(a)中所述的miRNA-378；

(c).多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主转录形成(b)中所述的前体miRNA，并加工形成(a)中所述的微小RNA；

(d).表达载体，所述表达载体含有(a)中所述的miRNA-378、或(b)中所述的前体miRNA、或(c)中所述的多核苷酸。

本发明第三方面，提供了一种筛选促进miRNA-378候选化合物的方法，包括步骤：

(a)将加入候选化合物的细胞培养体系作为实验组；将不加入候选化合物的细胞培养体系作为对照组；

(b)测试实验组和对照组中p110α蛋白的表达量和/或活性；

其中，当测试组中p110α蛋白的表达量和/或活性显著高于对照组，则表明该候选化合物为促进miRNA-378的物质。

在另一优选例中，所述的细胞为肝细胞。

在另一优选例中，步骤(b)中还包括：

进一步测试所获得化合物对实验组或对照组中肝细胞内甘油三酯蓄积的抑制作用；

其中，当实验组中的肝细胞内甘油三酯蓄积显著低于对照组，则表明所述候选化合物为治疗脂肪肝的物质。

本发明第四方面，提供了一种体外非治疗性的抑制p110α表达量和/或活性；和/或抑制肝细胞内甘油三酯蓄积的方法，包括步骤：

向细胞培养体系中加入本发明第二方面所述的药物组合物或miRNA-378，从而抑制p110α表达量和/或活性；和/或抑制肝细胞内甘油三酯蓄积。

本发明第五方面，提供了一种抑制p110α表达量和/或活性、和/或抑制肝细胞内甘油三酯蓄积、和/或治疗脂肪肝的方法，包括步骤：

向需要的对象施用本发明第二方面所述的药物组合物，从而抑制p110α表达量和/或活性、和/或抑制肝细胞内甘油三酯蓄积、和/或治疗脂肪肝。

在另一优选例中，所述需要的对象为哺乳动物，较佳地，为人、小鼠、或大鼠。

本发明第六方面，提供了一种p110α基因或其蛋白的抑制剂，所述的抑制剂包括本发明第二方面所述的药物组合物。

本发明第七方面，提供了一种p110α基因抑制剂的用途，用于制备治疗脂肪肝的药物组合物。

在另一优选例中，所述的p110α基因抑制剂为miRNA-378或其衍生序列。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了通过腺病毒在小鼠肝脏中过表达miR-378，qPCR结果显示miR-378过表达超过50倍。

图2A显示了p110α的3’UTR序列中存在一段与可能miR-378进行结合的位点；图2B显示了小鼠肝脏感染sh-p110α后，肝脏TG含量也发生了下降。

图3显示了腺病毒在ob/ob小鼠肝脏中过表达miR-378，可以有效的降低其肝脏的TG含量。

图4a显示p110α3’UTR相对荧光强度随着miR-378浓度的升高而减弱；图4b显示了当突变了p110α3’UTR中的miR-378结合位点的一个或者两个核苷酸后，miR-378对于突变的p110α3’UTR不再存在抑制作用。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，miRNA-378能够通过抑制p110α蛋白，显著降低肝脏甘油三酯的含量，减轻肝内脂肪沉积，从而有效地治疗脂肪肝。实验证明，在过表达miRNA-378的小鼠肝脏中，p110α蛋白得到显著抑制，从而使甘油三酯的含量显著降低。在此基础上，完成了本发明。

脂肪肝

肝脏是人体重要的代谢性器官，其可以感知来自激素、神经冲动以及营养代谢因子等多种信号并行使特定的功能。肝脏在调节机体糖脂平衡中有着十分重要的作用。而脂肪肝是由于机体脂代谢紊乱而导致肝细胞内甘油三酯(TG)蓄积过多而产生的病变。近年来，随着人们生活饮食结构的变化，脂肪肝的发病率逐年增加。

胰岛素对肝脏的脂代谢有着十分重要的作用。当机体由饥饿状态转化为进食状态，血液中血糖浓度的上升会引起胰岛素的释放，胰岛素的释放会抑制肝脏糖异生，促进糖原的合成，并促进脂肪合成。肝脏的胰岛素抵抗已被认为代谢性疾病，如II型糖尿病、脂肪肝等，重要的组成部分。

目前认为，胰岛素抵抗的发病是一个多因素疾病，遗传、基因突变、一些特殊疾病的发生均会导致胰岛素抵抗。因此，目前尚未能找出胰岛素抵抗及其造成脂肪肝的发病机制中的关键致病因素，也未能找到治疗胰岛素抵抗及其导致的相关疾病(如脂肪肝)的良好方法。

本发明通过实验证明，在胰岛素抵抗及其造成的脂肪肝疾病发病机制中，miRNA-378对p110α基因或其蛋白的抑制作用起到了非常重要的作用，实验证明，miRNA-378能够抑制p110α的表达，从而减少了肝内的甘油三酯的积蓄，进一步达到治疗脂肪肝的效果。

PI3K/AKT信号通路是胰岛素调控细胞代谢所必需的通路。当细胞外的胰岛素信号通过IR和IRS传递到细胞内以后，磷酸化的IRS和PI3K的调节亚基p85的SH2结构域结合，从而招募并且激活PI3K的催化亚基p110。PI3K根据序列的同源性和底物的特异性可以分为3类。IA类PI3K由p85调节亚基(p85α、p85β、p55γ)和p110催化亚基(p110α、p110β、p110αδ)形成异二聚体。调节肝脏能量代谢的胰岛素信号通路中的PI3K主要是指p85α和p110α。

miRNA及其前体

微小RNA(microRNA，简称miRNA)是近年来在线虫，果蝇和植物，哺乳动物等真核生物中发现的一种内源性的长度为22个核苷酸左右的非编码单链小RNA。它在表达上具有组织和时间的特异性，通过与靶mRNA的碱基互补配对而在转录后水平上对基因的表达进行负调控，导致mRNA的降解或翻译抑制，是调节其他功能基因表达的重要调控分子。越来越多的证据表明miRNA虽然微小，但它通过与靶mRNA形成完全或者不完全互不配对从而对生物体的各种生命过程有着至关重要的作用。本发明提供了一类涉及通过抑制p110α蛋白从而治疗脂肪肝的miRNA。如本文所用，所述的“miRNA”是指一类RNA分子，从可形成miRNA前体的转录物加工而来。成熟的miRNA通常具有18-26个核苷酸(nt)(更特别的约19-22nt)，也不排除具有其它数目核苷酸的miRNA分子。miRNA通常可被Northern印迹检测到。

人来源的miRNA可被从人细胞中分离。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

miRNA可从前体miRNA(PrecursormiRNA，Pre-miRNA)加工而来，所述的前体miRNA可折叠成一种稳定的茎环(发夹)结构，所述的茎环结构长度一般在50-100bp之间。所述的前体miRNA可折叠成稳定的茎环结构，茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。所述的前体miRNA可以是天然的或是人工合成的。

前体miRNA可被剪切生成miRNA，所述的miRNA可与编码基因的mRNA的至少一部分序列基本上互补。如本文所用，“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70％的核苷酸是互补的；优选的，至少有80％的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90％的核苷酸是互补的；进一步优选的，至少有95％的核苷酸是互补的；如98％、99％或100％。一般地，两条足够互补的分子之间可以具有最多40个不匹配的核苷酸；优选的，具有最多30个不匹配的核苷酸；更优选的，具有最多20个不匹配的核苷酸；进一步优选的，具有最多10个不匹配的核苷酸，如具有1、2、3、4、5、8、11个不匹配的核苷酸。

如本申请所用，“茎环”结构也被称作“发夹”结构，是指一种核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的，核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。

本发明所述的miRNA是指：微小RNA-378(miRNA-378)家族，所述miRNA-378家族包括：miRNA-378或经修饰的miRNA-378衍生物，其功能与miRNA-378-相同或基本相同。

在另一优选例中，所述的微小RNA来源于人或非人哺乳动物；较佳地所述的非人哺乳动物为大鼠、小鼠，鼠和人的miRNA-378家族序列完全一致。所述的“功能与miRNA-378相同或基本相同”是指保留了miRNA-23b-3p的≥40％、≥50％、≥60％、≥70％、≥80％、≥90％的抑制p110α蛋白从而治疗脂肪肝的功能。

本发明还包括miRNA变体和衍生物。此外，广义上的miRNA衍生物也可包括miRNA变体。本领域的普通技术人员可以使用通用的方法对miRNA-378进行修饰，修饰方式包括(但不限于)：甲基化修饰、烃基修饰、糖基化修饰(如2-甲氧基-糖基修饰、烃基-糖基修饰、糖环修饰等)、核酸化修饰、肽段修饰、脂类修饰、卤素修饰、核酸修饰(如“TT”修饰)等。

多核苷酸构建物

根据本发明所提供的miRNA序列，可设计出在被导入后可被加工成可影响相应的mRNA表达的miRNA的多核苷酸构建物，也即所述多核苷酸构建物能够在体内上调相应的miRNA的量。因此，本发明提供了一种分离的多核苷酸(构建物)，所述的多核苷酸(构建物)可被人细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA可被人细胞剪切且表达成所述的miRNA。

作为本发明的一种优选方式，所述的多核苷酸构建物含有式II所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向

式II

式II中，

Seq_正向为可在细胞中表达成所述的miRNA-27b的核苷酸序列，Seq_反向为与Seq_正向基本上互补的核苷酸序列；或者，Seq_反向为可在细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq_正向为与Seq_正向基本上互补的核苷酸序列；X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补；

式I所示的结构在转入细胞后，形成式III所示的二级结构：

式III

式III中，Seq_正向、Seq_反向和X的定义如上述；

||表示在Seq_正向和Seq_反向之间形成的碱基互补配对关系。

通常，所述的多核苷酸构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的miRNA，或所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。

药物组合物及施用方法

如本文所用，术语“活性成分”指的是可用于本发明的miRNA-378、miRNA-378衍生物或其前体序列、或含有其的表达载体。优选地，所述的活性成分选自下组：

(a).miRNA-378家族的微小RNA，所述miRNA-378家族的微小RNA包括：miRNA-378或经修饰的miRNA-378衍生物；或核心序列为5’CUGGACU3’、长度为18-26nt、功能与miRNA-378相同或基本相同的微小RNA或经修饰的miRNA衍生物；

(b).前体miRNA，所述的前体miRNA能在宿主内加工成(a)中所述的miRNA-378；

(c).多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主转录形成(b)中所述的前体miRNA，并加工形成(a)中所述的微小RNA；

(d).表达载体，所述表达载体含有(a)中所述的miRNA-378、或(b)中所述的前体miRNA、或(c)中所述的多核苷酸。

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，术语“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。

本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。

在本发明中，miRNA-378可被用于制备抑制p110α蛋白的药物组合物。例如，miRNA-378的衍生物或其激动剂可被用于制备肝内甘油三酯蓄积、治疗脂肪肝的药物组合物。

此外，本发明药物组合物中还可以含有其他p110α的抑制剂或降脂药。例如，优选的降脂药包括HMG—CoA还原酶抑制剂(他汀类药物)、烟酸及其衍生物、普罗布考以及贝特类等。

抑制p110α的方法以及治疗脂肪肝的方法

本发明提供了一种体外非治疗行的抑制p110α的方法，例如可向培养的肝细胞体系内加入本发明药物组合物或本发明活性成分，从而抑制p110α的表达量和/或活性，尤其是p110α的表达。

而本发明通过体内实验证明了可以将miRNA-378用于治疗脂肪肝(如甘油三酯肝内蓄积)的方法。

此外，由于p110α已知与部分肿瘤相关，因此，基于miRNA-378对p110α的抑制关系，可将miRNA-378作为p110α的抑制剂，用于制备治疗p110α相关性肿瘤的药物组合物。在另一优选例中，所述的p110α相关性肿瘤包括结肠直肠癌、胃癌、成胶质细胞癌、乳腺癌以及肺癌等。

本发明有益效果

本发明发现在肝脏中高表达miRNA-378，能够特异性地有效地抑制p110α，并能显著降低肝脏中的甘油三酯含量，从而能够利用miRNA-378作为治疗脂肪肝的新手段。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

通用方法

a.小鼠

实验所用小鼠C57BL/6J购自上海斯莱克实验动物公司，db/db、ob/ob及对照小鼠购自南京大学模式生物研究所。动物22-23℃恒温饲养于SPF级动物房，12小时昼夜循环，以正常饲料饲养。小鼠的使用和操作均严格按照中科院营养所动物管理和使用委员会的规程进行。腺病毒介导的基因功能研究均通过尾静脉注射操作。

b.腺病毒的构建

腺病毒过表达系统利用Statagene公司的AdEasy^TMAdenoviralVectorSystem构建。表达序列被克隆于穿梭质粒pShuttle-CMV或pAdTrack-CMV。穿梭质粒经PmeI线性化后，转化至BJ5183感受态细胞中，此感受态预先转入了pAdEasy-1质粒。通过挑取小克隆检出重组质粒。重组质粒经PacI酶切后转染293A细胞，待90％细胞出现CPE(细胞病变效应)时，收取细胞和培养液。冻融3次释放病毒颗粒，即为P1代病毒。

c.腺病毒包装扩增

1)293A细胞铺于10-20个15cm培养皿，待细胞长满，每皿加入0.5-1mlP1代病毒；

2)当细胞完全病变后，每皿加入1ml10％NP40裂解细胞，混匀，冻于-80℃；

3)室温融化，4℃，12,500rcf，离心10min，收集上清；

4)加入1/2上清体积的PEG8000(20％PEG8000，2.5MNaCl)，冰上放置2小时沉淀病毒；

5)4℃，12,500rcf，离心20min，去上清；

6)沉淀重悬于10ml密度为1.1g/ml的CsCl溶液(溶剂20mMTris-HCl，pH8.0)；

7)4℃，8,000rcf，离心5min，保留上清；

8)制备CsCl梯度：先加入2ml1.4g/ml的CsCl溶液(溶剂同上)，然后加入3ml1.3g/ml的CsCl溶液，再加入5ml病毒悬液，2ml液体石蜡；

9)用SW41转子，20℃，20,000rpm(60000g)，离心2小时；

10)收集1.4g/ml和1.3g/ml之间的蓝白色病毒条带至透析袋中；

11)4℃透析过夜。透析缓冲液体积至少为病毒的200倍，中间换两次液；透析液：

a)5％蔗糖

b)10mMTris-HCl，pH8.0

c)2mMMgCl2

12)透析结束后分装病毒保存于-80℃超低温冰箱。

d.RNA的提取

1)对于组织样品，在提取RNA之前，按照每50-100mg组织用1mlTrizol试剂对组织进行充分研磨和裂解。对于细胞样品，3.5cm培养皿加入1mlTrizol试剂，并反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；

2)将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入1.5mlEP管中，在室温下放置5min；

3)在上述EP管中，按照每1mlTrizol加入0.2ml氯仿的量加入氯仿，在手中用力震荡15sec，室温放置3min后，以10,000rcf，4℃离心15min；

4)小心吸取上层水相置于新EP管中，并按照每1mlTrizol加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，混匀，室温静置10min，10,000rcf，4℃，离心10min；

5)弃上清，保留沉淀，并按照每1mlTrizol加入1ml75％乙醇的用量，对沉淀进行洗涤，7500rcf，4℃，离心5min；

6)弃上清，让RNA在室温下自然干燥，最后用RNase-freeddH2O溶解干燥的RNA；

7)电泳检测RNA质量并用分光光度计对RNA进行浓度测定。

e.逆转录及实时定量PCR

逆转录反应使用POLY-A系统进行转录，反应条件如下

37℃，1h(反转录反应)；

85℃，5sec(反转录酶失活反应)。

cDNA稀释10倍后用于RealTimePCR反应模板。

按下列组份配制PCR反应液(反应液配制在冰上进行)

进行RealTimePCR反应。

两步法PCR扩增标准程序：

Stage1：50℃，2min，Reps：1；

Stage2：95℃，10min，Reps：1。热启动PCR聚合酶；

Stage3：95℃15sec；

60℃1min，Reps：40。PCR反应过程；

Stage4：95℃15sec；

60℃1min；

95℃15sec，Reps：1。熔解曲线过程。

实验结果分析：反应结束后确认RealTimePCR的扩增曲线。采用ΔCt进行相对定量。

f.免疫印迹分析(westernblot)

1)细胞及组织蛋白的提取：收集细胞或一定量的小鼠肝脏组织在含有蛋白酶抑制剂合磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液中裂解或匀浆。冰上放置30min，14,000rpm，4℃离心20分钟，收集上清溶液即为细胞或组织的总蛋白质；

RIPA裂解液：

a)50mMTris-HCl，pH＝7.4

b)150mMNaCl

c)1mMEDTA

d)1％Tritonx-100

e)蛋白酶抑制剂

f)磷酸酶抑制剂

2)制样：用Bradford蛋白分析试剂测定蛋白浓度后，将蛋白调整至同样浓度。加入上样缓冲液，并于100℃煮5分钟，可存放于-80℃或上样电泳；

3)电泳：配置10％的SDS聚丙烯酰胺凝胶，以每个样本40μg-80μg的蛋白量上样。140V恒压电泳，至前端溴酚蓝跑出胶底部；

4)转膜：PVDF膜用甲醇浸泡1min后，然后和胶一起放在转膜液中平衡5min，然后按照阳极-海绵-两层滤纸-PVDF膜-胶-两层滤纸-海绵-阴极的顺序安放好，放到湿转转膜仪中，将转膜仪包埋于冰中，300mA转膜3小时；

5)封闭：取出PVDF膜，放入丽春红染液中染色，然后用去离子水洗掉多余染料，观察转膜效果，并按相应位置剪膜。5％脱脂牛奶封闭1小时；

6)一抗：加入用5％BSA合适稀释的抗体，4℃水平摇床摇过夜；

7)洗膜：回收抗体，将膜用TBST洗3次，每次5分钟；

8)二抗：加入5％脱脂牛奶稀释的相应二抗(1:3000)室温孵育1小时；

9)洗膜：去掉二抗，将膜用TBST洗3次，每次5分钟；

10)ECL显色，暗室压片；

11)显影过的X-光片用Bio-Rad公司的Chemi-DocImaging系统扫描，同时该系统的QuantitiyOne分析软件对扫描出的条带进行灰度定量。

g.甘油三酯的测定

甘油三酯的测定使用Wako公司的TG检测试剂盒测定。

实施例1过表达miR-378对小鼠肝脏TG含量的影响

利用通用方法，通过腺病毒在小鼠肝脏中过表达miR-378，qPCR结果显示miR-378过表达超过50倍(图1)。

对肝脏TG含量进行测定，结果显示，肝脏在感染miR-378后，TG含量显著下降；对肝脏进行H&E染色与油红染色，结果也显示，肝脏过表达miR-378后，可以降低肝脏的TG含量。

实施例2miR-378通过靶向p110α影响肝脏TG含量

2.1通过生物信息学分析，筛选了数十个潜在的miR-378的靶蛋白，这些靶蛋白可能参与了miR-378对于肝脏TG的调节。然后通过westernblot，对小鼠肝脏蛋白进行检测发现，肝脏在感染了miR-378后，那些经筛选的潜在靶蛋白中，参与肝脏胰岛素信号通路的重要因子p110α，其蛋白水平有最显著的下降。

2.2对p110α的序列进行了进一步的研究，发现在p110α的3’UTR序列中存在一段与可能miR-378进行结合的位点(图2a)。然后，在对p110α的3’UTR序列中的潜在miR-378结合位点进行克隆，然后通过体外细胞中双荧光实验，发现miR-378能够显著抑制p110α-3’UTR的活性。说明miR-378会通过这一位点直接调控p110α。

2.3构建了p110α的shRNA的腺病毒，结果显示小鼠肝脏感染sh-p110α后，肝脏TG含量也发生了下降。表明p110α可以有效地降低肝脏的TG含量(图2b)。

而当对p110α-3’UTR的miR-378结合位点进行突变后，miR-378对于p110α的抑制就不存在了。结果如图4所示，其中，图4a显示p110α3’UTR相对荧光强度随着miR-378浓度的升高而减弱；图4b显示了当突变了p110α3’UTR中的miR-378结合位点的一个或者两个核苷酸后，miR-378对于突变的p110α3’UTR不再存在抑制作用。这就很好的解释了miR-378可以通过结合p110α的特定位点，从而抑制肝脏中的p110α并减少肝脏的TG水平。

实施例3miR-378对肝脏脂肪蓄积的改善

通过腺病毒在ob/ob小鼠肝脏中过表达miR-378，可以有效的降低其肝脏的TG含量(图3)。随后H&E和油红染色的结果也同样符合先前的结果。综上表明，在ob/ob小鼠肝脏中过表达miR-378可以有效改善肝脏的脂肪蓄积。

讨论

胰岛素信号通路主要指胰岛素通过激活胰岛素受体，胰岛素受体底物，磷脂酰肌醇3激酶以及蛋白激酶B等的信号转导过程，对于调节肝脏甘油三酯的水平有着重要作用。肝脏甘油三酯的过度积累往往是由于肝脏胰岛素信号通路的异常造成的。本发明发掘出可以影响胰岛素信号通路关键节点的microRNA，从而对胰岛素信号通路有着更为清晰的认识，并对治疗代谢性疾病(II型糖尿病、脂肪肝等)提供潜在的靶点。

本发明证实，肝脏中miR-378是调控胰岛素信号通路的核心元件。当小鼠肝脏过表达miR-378时，小鼠脂代谢稳态得到提升，主要表现为肝脏TG含量下降。其中，miR-378可以通过抑制胰岛素信号通路的关键蛋白p110α行使其功能。当小鼠肝脏过表达miR-378后，发现p110α蛋白水平明显下降。随后我们构建了sh-p110α的腺病毒，当感染小鼠肝脏后，其仍然表现为肝脏TG含量下降。

而在ob/ob小鼠中验证了先前的结论。向ob/ob小鼠肝脏中过表达miR-378可以明显降低肝脏TG的含量，显著改善其肝脏脂肪蓄积情况。

结果表明在肝脏中通过过表达miR-378抑制p110α的表达可以成为一种新的治疗肝脏脂质蓄积的策略。目前，针对microRNA的临床治疗已经开展，相信miR-378未来可以成为治疗脂肪肝的一种潜在靶点。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。