一种牛趋化因子介导的O型口蹄疫靶向性复合表位蛋白及疫苗

摘要

本发明提供一种牛趋化因子介导的O型口蹄疫靶向性复合表位蛋白，所述靶向性复合表位蛋白的氨基酸序列为序列表中SEQ？ID？No.2。本发明还提供含有上述牛趋化因子介导的O型口蹄疫靶向性复合表位蛋白的疫苗。应用本发明的疫苗免疫牛，牛能够产生较高的体液免疫，以及较好的保护性免疫效果，是一种安全的口蹄疫新型疫苗。

说明书

技术领域

本发明属于口蹄疫免疫技术领域，具体涉及一种牛趋化因子介导的O型口蹄疫靶向性复合表位蛋白及疫苗。

背景技术

口蹄疫（foot-and-mouthdisease,FMD）是由口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV)引起的急性、热性、高度接触性传染病。主要侵害对象为牛、羊和猪等主要畜种及其它家养和野生偶蹄动物，易感者多达70余种。发病动物的特征症状是口、鼻、蹄和母畜乳头等部位发生水泡，或水泡破损后形成的溃疡或斑痂，表现流涎、跛行和卧地，由此导致生产力大幅下降。口蹄疫传染性强，发病率高达100%，可造成巨大的经济损失和社会政治影响，素有“政治经济病”之称，国际动物卫生组织（OIE）将该病列为必需通报的重大动物传染病，我国也将该病列为一类重大动物传染病之首。

FMDV不仅宿主范围广，传播迅速，变异快，而且血清型众多，共有A、O、C、Asia1、SAT1、SAT2和SAT3七个血清型，各血清型间缺乏交叉保护性，同一血清型的不同亚型或分离株间的抗原变异很大。近年来，全球除C型口蹄疫未见流行外，其他6个血清型都在流行。A型和O型流行面最广，其次为Asia1型和SAT2型。目前，对于口蹄疫的防治以免疫接种灭活疫苗为主，该疫苗为FMD疫情防控做出了重大贡献。欧洲经历了十多年的灭活疫苗接种后，疫情得到了控制，多数国家达到了无疫标准。但灭活疫苗的生产和应用存在诸多的缺点。即生产该疫苗需要繁殖大量的活病毒，存在病毒逃逸的风险；非纯化的灭活疫苗免疫动物（尤其是多次免疫）会产生非结构蛋白抗体，给以非结构蛋白为基础的感染动物与免疫动物鉴别诊断带来干扰；需要冷链运输和低温贮存以保证抗原稳定性；疫苗免疫不能阻断形成病毒携带状态，更为严重的是病毒灭活不完全有引发疫情的危险。为了克服这些缺点，研究者一直在寻找一种更为安全有效的口蹄疫新型疫苗。随着口蹄疫病毒抗原结构日益明朗，免疫学方面的新理论与新方法的不断发展，在疫苗分子设计、复合表位疫苗与免疫佐剂等方面都取得了明显进展。

表位蛋白疫苗与灭活疫苗相比，具有以下优点：生产过程不涉及活病毒，不存在散毒的风险；既可随时根据流行毒株的变化调整表位序列，也可使用不同的抗原序列，增加抗原的广谱性；利用非疫苗用表位建立的诊断方法可对疫苗免疫和自然感染动物进行有效区分。近年来，表位疫苗逐渐成为研究的热点。大量研究表明，表位蛋白疫苗在猪体试验是成功的（Cubillosetal,2008；Shaoetal,2011；Caoetal,2013，2014）。但是在牛上不能获得有效的保护（Tabogaetal,1997；Rodriguezetal,2003）。

发明内容

本发明的目的是克服现有表位蛋白疫苗对牛体免疫效果差的缺陷，提供一种牛趋化因子介导的O型口蹄疫靶向性复合表位蛋白及疫苗。利用本发明的XCL-OB7靶向性复合表位蛋白疫苗免疫牛，能够产生较高的抗体水平，以及较好的保护性免疫效果，是一种安全的口蹄疫新型疫苗。

为了提高表位蛋白疫苗对牛的免疫效果，将表位蛋白分子靶向于树突状细胞（DC）表面受体，将有可能提高表位蛋白的抗原递呈效率，进而提高表位疫苗的免疫效果。DC是最重要的抗原递呈细胞（antigen-presentingcells，APCs），通过其表面受体介导的胞吞、胞饮与吞噬作用，对自身产生的病变细胞与入侵病原进行监视与清除，在启动与控制获得性免疫应答方面发挥着关键性的作用。通过DC表面受体将抗原靶向到DC，可以显著提高抗原递呈效率，即使少量的抗原也能够刺激产生较高的细胞免疫与体液免疫。近来发现趋化因子受体XCR1仅表达于一群具有抗原交互递呈功能的DC，是C型趋化因子XCL1唯一的受体。通过XCL1将抗原靶向到这类DC，不但具有很高的特异性，而且靶向的抗原可以通过MHC-I与MHC-II两类分子交叉递呈抗原给CD8+T细胞（CTL）与CD4+T细胞，从而产生强而持久的细胞免疫与体液免疫应答。XCL1的氨基酸序列在不同种属动物之间有差异，因而具有种属特异性。

本发明的第一个目的是提供一种融合牛趋化因子XCL1的O型口蹄疫靶向性复合表位蛋白，所述靶向性复合表位蛋白的氨基酸序列为序列表中SEQIDNo.2。

本发明的牛O型口蹄疫靶向性复合表位蛋白包含N端融合的牛趋化因子XCL1序列，中国型（Cathay）、泛亚、缅甸98三个谱系O型FMDV主要中和性抗原表位区、通用T细胞表位、FMDV特异性T细胞表位以及表位间的间隔序列，增加FMDV特异性T细胞表位旨在提高对牛的FMDV特异性细胞免疫效果。表位间的间隔序列有助于蛋白形成稳定的空间结构，提高蛋白的免疫原性；在重组蛋白末端融合有6个组氨酸标签，以便于表位蛋白的分离纯化。

本发明的第二个目的是提供编码权利要求1所述的牛趋化因子介导的O型口蹄疫靶向性复合表位蛋白的核苷酸；

作为优选，所述核苷酸序列为序列表中SEQIDNo.1。

本发明的第三个目的是提供一种牛趋化因子介导的O型口蹄疫靶向性复合表位蛋白疫苗，所述疫苗由水相和油相按比例混合后制备而成；所述水相的溶质为权利要求1所述的牛趋化因子介导的O型口蹄疫靶向性复合表位蛋白。

作为优选，所述油相为油佐剂。

作为进一步优选，所述油佐剂为MontanideISA-201油佐剂。

作为优选，所述水相和油相的体积比为1:（0.95-1.05）。

作为优选，所述疫苗的主要组分含量为权利要求1所述的牛趋化因子介导的O型口蹄疫靶向性复合表位蛋白500μg/mL.

作为优选，所述疫苗的免疫有效量为每头份2ml。

本发明的第四个目的是提供上述疫苗的制备方法，将权利要求1所述的牛趋化因子介导的O型口蹄疫靶向性复合表位蛋白溶于磷酸盐缓冲液中，得到水相；将水相与油相等温度充分混合，乳化，得疫苗。

本发明的第五个目的是提供上述牛趋化因子介导的O型口蹄疫靶向性复合表位蛋白在制备牛O型口蹄疫疫苗中的应用。

本发明的第六个目的是提供上述疫苗在制备预防和/或控制牛O型口蹄疫的药物中的应用。

本发明的有益效果：

牛免疫试验结果表明，免疫1mgXCL-OB7后，7天就可检测到FMDV特异性中和抗体，抗体效价不断升高，至21天抗体效价达最高，加强免疫后抗体效价迅速升高。非靶向性的OB7抗原加入Toll样受体激动剂Poly(I:C)（pIC）后，也产生了高水平的抗体应答，但早期抗体应答水平，明显低于XCL-OB7靶向性抗原免疫牛。靶向性XCL-OB7抗原加入Toll样受体激动剂Poly(I:C)后，初免后的抗体应答水平相比前两组反而降低，二免后的抗体水平相比前两组不升反降，显示出Poly(I:C)与XCL具有相反的作用，显示出单独的XCL靶向性抗原分子在诱导体液免疫应答方面具有明显的优势。而PBS对照组动物始终没有检测到FMDV特异性抗体。特异型抗体检测结果显示，首免与加强免疫后IgG1型抗体均高于IgG2型抗体，说明机体通过Th2型细胞因子调控免疫应答。加强免疫后第42天用200微升含10000个BID50的O/Mya/98口蹄疫病毒攻毒，XO7免疫组牛只有1头发病，其余4头牛获得完全保护；而PBS免疫组牛全部发病。说明重组XO7抗原是一种很好的免疫原，免疫牛能够产生较高的体液免疫，以及较好的保护性免疫效果，是一种安全的口蹄疫新型疫苗。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为XCL-OB7抗原表达产物SDS-PAGE图。1为蛋白分子量Marker；2为重组菌pET28a-XCL-OB7诱导5h产物；3为未诱导的重组菌pET28a-XCL-OB7对照；4为空载体pET28a诱导对照；

图2为XCL-OB7抗原表达纯化后SDS-PAGE分析图。1为蛋白分子量Marker；2为pH值为5.9的洗脱缓冲液洗脱的目的蛋白；4，5为pH值为4.5的洗脱缓冲液洗脱的目的蛋白；

图3为免疫动物LPBE抗体效价；

图4为免疫动物特异型抗体IgG1检测结果；

图5为免疫动物特异型抗体IgG2检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。

实施例1

1、免疫原的设计与表达

本申请人根据国内外O型口蹄疫流行病学信息，设计并合成了免疫原基因OB7，并于OB7N端融合牛趋化因子XCL1后形成靶向抗原XCL-OB7；同时突变XCL1第18与55位两个半胱氨酸为丙氨酸，以消除XCL1的靶向功能，构建ΔXCL-OB7作为非靶向对照。其中OB7含有中国型（Cathay）、泛亚、缅甸98三个谱系O型口蹄疫病毒主要中和性抗原表位区、通用T细胞表位以及位于FMDV非结构蛋白3A与3D中血清型间保守的特异性T细胞表位，各表位之间以两个甘氨酸相连，并将牛趋化因子XCL1与OB7用间隔序列串联，最后加6组氨酸标签序列，以利于表达蛋白的纯化。设计好的XCL-OB7序列交由南京金斯瑞公司进行编码序列的优化与合成，两端分别加入NcoI酶切位点/启始密码子与终止密码子/HindIII酶切位点，合成序列经NcoI/HindIII酶切位点插入pET28a载体中，用于表达XCL-OB7融合蛋白。编码XCL-OB7蛋白的核苷酸序列如下，为序列表中SEQIDNo.1，其蛋白序列为序列表中SEQIDNo.2。该核苷酸序列中各段编码肽段来源与功能如下表1所示。序列表中SEQIDNo.1:

ATGGCATACACAGTCGAAGGAGTCGGTAGCGAGGTCCTGGAGAAGTCTATTTGCGTTTCCCTGACAACACAGCGTCTGCCCATCAAGAATATCAAAACCTACACTATTAAGGAAGGTAGTGTGAAAGCGGTCATCTTCATTACCCGTCGCGGCTTTAAAATCTGCGCGGATCCTCAGGCCGCGTGGGTTAAAAAGGCTGTGCAAAAAATCGACCGTAAGAATATTAGCCAGGCGAAGCCAACTGGAGCTGGCCCTGGCCCTGGTACCGCCAAATCTAAGAAGTTTCCAAGCTACACCGCTACCTATCAGTTCGGGGGAGCCGCTATTGAGTTTTTCGAGGGGATGGTCCACGATTCTATCAAGGGCGGCTCCAGCAAATACGGGGATACCTCAACAAACAATGTGAGGGGCGACCTGCAGGTCCTCGCCAAGAAAGCTGAGAGAGCCCTGCCTGGAGGAGCTATCCAGCCATCTACCGCCAGACATAAGCAGAAAATTGTGGCCCCTGCTAAGCAGGGAGGGGGCAACTGCAAATATGGAGAATCACCCGTGACCAATGTCCGAGGGGACCTGCAGGTGCTCGCTCAGAAGGCTGCTCGCACACTGCCAGGAGGAGCTATCCACCCTAACGAGGCCCGCCACAAACAGAAGATTGTGGCCCCAGTCAAGCAGGGCGGAGATTGCAAATACGGCGAATCTCGCACCACAAACGTGCGGGGAGACCTGCAGGTCCTGGCCCAGAAGGCTGCTACCACACTGCCTGGAGGAGGAAACTGTAAATATGCTGGAGGCTCCCTCACCAATGTGCGGGGCGATCTGCAGGTCCTCGACCAGAAGGCTGCTAGGCCCCTGCCAGGAGGAGCCGTGCACCCAAGCGCCGCTAGGCATAAGCAGAAAATCGTGGCTCCCGTGAAGCAGGGCGGAGTGGTCGCCTCCGACTACGATCTGGACTTCGAGGCCCTCAAGCCCCACTTTAAAAGCCTGGGCCAGACCATTACACCCGCTGACAAATCTGGGGGGGCTAAGTTCGTGGCTGCTTGGACCCTGAAGGCTGCTGCCCACCACCACCACCACCACTGA

序列表中SEQIDNo.2:

MAYTVEGVGSEVLEKSICVSLTTQRLPIKNIKTYTIKEGSVKAVIFITRRGFKICADPQAAWVKKAVQKIDRKNISQAKPTGAGPGPGTAKSKKFPSYTATYQFGGAAIEFFEGMVHDSIKGGSSKYGDTSTNNVRGDLQVLAKKAERALPGGAIQPSTARHKQKIVAPAKQGGGNCKYGESPVTNVRGDLQVLAQKAARTLPGGAIHPNEARHKQKIVAPVKQGGDCKYGESRTTNVRGDLQVLAQKAATTLPGGGNCKYAGGSLTNVRGDLQVLDQKAARPLPGGAVHPSAARHKQKIVAPVKQGGVVASDYDLDFEALKPHFKSLGQTITPADKSGGAKFVAAWTLKAAAHHHHHH.

表1XCL-OB7融合蛋白编码序列中各肽段来源与功能

各表位间的间隔氨基酸序列不同时，会得到不同的蛋白空间结构；经实验证实，当氨基酸序列为本专利中XCL-OB7蛋白的序列时，能够得到一种稳定的蛋白空间结构，使得最终得到的XCL-OB7复合表位蛋白的免疫原性和免疫效果最佳。

2、XCL-OB7与ΔXCL-OB7蛋白的表达

合成后的核苷酸序列插入pET28a载体中，将此重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，将鉴定阳性的重组菌在卡拉霉素抗性的LB液体培养基中培养过夜，然后按1%转接到含75μg/mL卡拉霉素的LB培养基中，37℃培养至对数生长期(OD₆₀₀为0.5～1.0)，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃振荡培养5h后，取表达产物1mL进行SDS-PAGE分析。结果，表达的XCL-OB7与ΔXCL-OB7蛋白大小介于35～40kD之间，与预期的38kD大小相符，图1显示XCL-OB7蛋白表达后电泳检测结果。

3、XCL-OB7与ΔXCL-OB7蛋白包涵体的大量制备与溶解

取过夜培养的转化菌5mL接种于500mLLB培养液（含75μg/mL卡那霉素）中，37℃，250r/min培养至OD₆₀₀为0.5～1.0时，加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L，诱导表达5h，得诱导表达后的重组XCL-OB7与ΔXCL-OB7蛋白。

将诱导表达后的重组XCL-OB7与ΔXCL-OB7蛋白于4℃10000r/min离心15min收集菌体，弃上清，每100mL培养物加10mL冰浴的1×IBWashBuffer（EDTA10mmol/L;Tris-HCl20mmol/L,pH7.5;TritonX-1001%）重悬沉淀，加入终浓度为100μg/mL的溶菌酶，30℃温育15min后，置于冰浴中超声波裂解至细胞完全裂解，溶液不再粘稠。12000r/min离心10min，弃上清，每100mL菌液的沉淀加10mL冰浴的1×IBWashBuffer重复洗涤一次，重悬后转移至已知重量的干净离心管中，12000r/min离心10min收集包涵体，用卷纸吸干管底部微量液体。计算出包涵体的湿重，标准的包涵体重量为1~4mg/ml培养物。

室温下准备含有0.3%的N-十二烷基肌氨酸钠的1×IBSolubilizationBuffer（50mmol/LCAPS,pH11.0）（即49.45mL1×IBSolubilizationBuffer中加入0.5mL30%N-lauroylsarcosine），按照包涵体湿重计算所要加入的1×IBSolubilizationBuffer用量，将包涵体的量调整到10~20mg/mL。向包涵体中加入计算量的1×IBSolubilizationBuffer，轻轻混匀，反复吹打，破碎大量细胞碎片，室温孵育15min，可适当延长时间至蛋白完全溶解，12000r/min离心30min弃去不可溶物质，上清即为粗提的包涵体。

4、XCL-OB7与ΔXCL-OB7蛋白的亲和层析纯化

重组XCL-OB7与ΔXCL-OB7蛋白通过末端融合的6-组氨酸标签进行亲合层析纯化，具体为：在每4mL包涵体裂解液中加入1mL50％的Ni-NTAHis·BindResin，轻柔混合均匀后，室温条件下以200r/min摇晃2h，使目的蛋白与Ni-NTAHis·BindResin发生完全的特异性结合；待液体流干，用WashingBuffer（100mmol/LNaH₂PO₄，10mmol/LTris·Cl，8mol/Lurea；pH6.3）洗净未结合杂蛋白，洗涤2次，每次洗2个柱体积。最后用不同pH值（5.9和4.5）洗脱缓冲液（100mmol/LNaH₂PO₄，10mmol/LTris·Cl，8mol/Lurea）洗脱柱体，洗脱4次，每次洗脱1个柱体积。收集洗脱下的溶液为纯化后的目的蛋白，取部分蛋白溶液SDS-PAGE电泳分析，结果不同pH值洗脱液洗下的目的蛋白纯度均达到95%以上，图2显示XCL-OB7蛋白的纯化结果。ΔXCL-OB7蛋白的表达纯化与复性与XCL-OB7相同，目的蛋白纯度达到制苗要求。

5、纯化蛋白复性及浓度测定

将纯化后的重组蛋白质装入透析袋。先用50倍体积的含0.1mmol/LDTT的复性液(20mmol/LTris-HCl,pH8.5)4℃透析3h以上，并换液1次，继续透析3h以上；用不含DTT的复性液再透析3h以上，并换液1次，以除去DTT。

用Bradford蛋白质定量试剂盒（碧云天公司）测定纯化复性后目的蛋白浓度，纯化蛋白的浓度应不低于1mg/mL。

6、疫苗配制

水相：XCL-OB7重组蛋白按终浓度1mg/mL稀释于磷酸盐缓冲液，或者将1mg/mL的XCL-OB7与ΔXCL-OB7中添加Poly(I:C)至终浓度为500μg/ml，然后再与油相混合乳化；油相：MontanideISA201VG佐剂。将水相和油相分别平衡至室温，再按体积比（水相:油相=1:1）真空进料到乳化罐中，循环搅拌至水相与油相充分混合，再通过均质机乳化成双向油乳剂（W/O/W）疫苗。

7、牛免疫试验

用1周岁左右的健康易感牛（健康易感牛标准：乳鼠中和抗体滴度不高于1:4或细胞中和抗体滴度不高于1:8或液相阻断ELISA抗体效价不高于1:8和3ABC抗体检测为阴性）10头，动物分为4组，每组5头。牛均经耳根后肌肉注射疫苗2mL，第1组注射疫苗含XCL-OB7（1mg），第2组注射疫苗含ΔXCL-OB7(1mg)+pIC(500μg)，第3组注射疫苗含XCL-OB7(1mg)+pIC(500μg)，第4组注射2mLPBS作为阴性对照。一免后28天加强免疫一次。接种后每周采血一次，用液相阻断ELISA测FMDV特异性抗体，并用间接ELISA方法检测型特异型IgG1、IgG2。加强免疫后第42天用200μL含10000个BID50的Mya98O型口蹄疫病毒攻毒，连续观察10日，对照牛均应至少有一蹄出现口蹄疫症状。免疫牛出现任何口蹄疫症状即判为不保护。

试验结果显示，XCL-OB7与ΔXCL-OB7+pIC疫苗免疫牛第7天就可检测到FMDV特异性抗体，抗体效价不断升高，至21天抗体效价达最高，加强免疫后抗体效价讯速升高；但单独XCL-OB7免疫组初免抗体产生时间与水平均明显高于ΔXCL-OB7+pIC免疫牛，说明XCL介导的靶向性OB7抗原诱导产生了更好的体液免疫应答，非靶向性OB7抗原分子在Toll样受体激动剂pIC的辅助作用下抗体应答水平也显著上升，但初免抗体水平没有靶向OB7抗原分子高。XCL-OB7+pIC免疫组，初免后产生了FMDV特异性抗体，而加强免疫后抗体水平不升反降，说明XCL与pIC的作用有冲突，影响了靶向性抗原分子诱导的抗体应答，其机理还有待进一步研究，但说明XCL介导的靶向抗原分子在诱导体液免疫方面，确实具有独特的优势，是一种增强体液免疫效果的一种新策略。PBS对照组牛一直没检测到FMDV特异性抗体(图3)。

特异型抗体检测结果显示，三个抗原免疫组，一免与加强免疫后IgG1型抗体（图4）均高于IgG2型抗体（图5），提示机体通过Th2型细胞因子调控免疫应答；其中XCL-OB7与ΔXCL-OB7+pIC组的IgG1与IgG2的抗体应答水平均显著高于XCL-OB7添加pIC免疫组，进一步说明了趋化因子与pIC在诱导体液免疫应答方面，具有相反的作用。加强免疫后第42天用200μL含10000个BID50的Mya98O型口蹄疫病毒攻毒，XCL-OB7免疫组与ΔXCL-OB7+pIC免疫组均只有1头牛发病，其余4头牛获得完全保护。XCL-OB7+pIC免疫组与PBS对照组牛于攻毒后全部发病。说明重组XCL-OB7抗原是一种很好的靶向性免疫原，免疫牛能够产生较高的体液免疫，以及较好的保护性免疫效果，是一种安全的口蹄疫新型疫苗。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>中国农业科学院兰州兽医研究所

<120>一种牛趋化因子介导的O型口蹄疫靶向性复合表位蛋白及疫苗

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>1080

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

atggcatacacagtcgaaggagtcggtagcgaggtcctggagaagtctatttgcgtttcc60

ctgacaacacagcgtctgcccatcaagaatatcaaaacctacactattaaggaaggtagt120

gtgaaagcggtcatcttcattacccgtcgcggctttaaaatctgcgcggatcctcaggcc180

gcgtgggttaaaaaggctgtgcaaaaaatcgaccgtaagaatattagccaggcgaagcca240

actggagctggccctggccctggtaccgccaaatctaagaagtttccaagctacaccgct300

acctatcagttcgggggagccgctattgagtttttcgaggggatggtccacgattctatc360

aagggcggctccagcaaatacggggatacctcaacaaacaatgtgaggggcgacctgcag420

gtcctcgccaagaaagctgagagagccctgcctggaggagctatccagccatctaccgcc480

agacataagcagaaaattgtggcccctgctaagcagggagggggcaactgcaaatatgga540

gaatcacccgtgaccaatgtccgaggggacctgcaggtgctcgctcagaaggctgctcgc600

acactgccaggaggagctatccaccctaacgaggcccgccacaaacagaagattgtggcc660

ccagtcaagcagggcggagattgcaaatacggcgaatctcgcaccacaaacgtgcgggga720

gacctgcaggtcctggcccagaaggctgctaccacactgcctggaggaggaaactgtaaa780

tatgctggaggctccctcaccaatgtgcggggcgatctgcaggtcctcgaccagaaggct840

gctaggcccctgccaggaggagccgtgcacccaagcgccgctaggcataagcagaaaatc900

gtggctcccgtgaagcagggcggagtggtcgcctccgactacgatctggacttcgaggcc960

ctcaagccccactttaaaagcctgggccagaccattacacccgctgacaaatctgggggg1020

gctaagttcgtggctgcttggaccctgaaggctgctgcccaccaccaccaccaccactga1080

<210>2

<211>359

<212>PRT

<213>人工蛋白

<400>2

MetAlaTyrThrValGluGlyValGlySerGluValLeuGluLysSer

151015

IleCysValSerLeuThrThrGlnArgLeuProIleLysAsnIleLys

202530

ThrTyrThrIleLysGluGlySerValLysAlaValIlePheIleThr

354045

ArgArgGlyPheLysIleCysAlaAspProGlnAlaAlaTrpValLys

505560

LysAlaValGlnLysIleAspArgLysAsnIleSerGlnAlaLysPro

65707580

ThrGlyAlaGlyProGlyProGlyThrAlaLysSerLysLysPhePro

859095

SerTyrThrAlaThrTyrGlnPheGlyGlyAlaAlaIleGluPhePhe

100105110

GluGlyMetValHisAspSerIleLysGlyGlySerSerLysTyrGly

115120125

AspThrSerThrAsnAsnValArgGlyAspLeuGlnValLeuAlaLys

130135140

LysAlaGluArgAlaLeuProGlyGlyAlaIleGlnProSerThrAla

145150155160

ArgHisLysGlnLysIleValAlaProAlaLysGlnGlyGlyGlyAsn

165170175

CysLysTyrGlyGluSerProValThrAsnValArgGlyAspLeuGln

180185190

ValLeuAlaGlnLysAlaAlaArgThrLeuProGlyGlyAlaIleHis

195200205

ProAsnGluAlaArgHisLysGlnLysIleValAlaProValLysGln

210215220

GlyGlyAspCysLysTyrGlyGluSerArgThrThrAsnValArgGly

225230235240

AspLeuGlnValLeuAlaGlnLysAlaAlaThrThrLeuProGlyGly

245250255

GlyAsnCysLysTyrAlaGlyGlySerLeuThrAsnValArgGlyAsp

260265270

LeuGlnValLeuAspGlnLysAlaAlaArgProLeuProGlyGlyAla

275280285

ValHisProSerAlaAlaArgHisLysGlnLysIleValAlaProVal

290295300

LysGlnGlyGlyValValAlaSerAspTyrAspLeuAspPheGluAla

305310315320

LeuLysProHisPheLysSerLeuGlyGlnThrIleThrProAlaAsp

325330335

LysSerGlyGlyAlaLysPheValAlaAlaTrpThrLeuLysAlaAla

340345350

AlaHisHisHisHisHisHis

355