一种基于超连续谱光源的多色荧光成像系统

摘要

本发明提供了一种基于超连续谱光源的多色荧光成像系统，包括：依次耦合的超连续谱激光发生装置、激光波长选择装置和成像装置。所述超连续谱激光发生装置发出超连续谱激光光束至所述激光波长选择装置，所述激光波长选择装置按照预设规则依次选通所获取的所述超连续谱激光光束中不同波长的单波长激光光束，所述成像装置依次获取所述待测物经多个所述单波长激光光束激发后发出的多个单色荧光，根据所获取的多个所述单色荧光生成多个单色荧光图像，将多个所述单色荧光图像叠加以获得所述待测物的多色荧光图像。能够减少待测物内不同的荧光团被照射的频率和时间，有效减少光热损伤和光漂白的发生。

说明书

技术领域

本发明涉及荧光成像领域，具体而言，涉及一种基于超连续谱 光源的多色荧光成像系统。

背景技术

基于荧光标记的光学成像能够将不同的荧光团(包括荧光蛋白， 染料等)特异性地标记到待测物的内部。这些荧光团能够在待测物 内长期稳定地存在和可重复地观察。

然而，多色荧光标记的待测物成像的探测待测物深层组织成像 仍面临一定的难题。一方面，由于激发光在穿透组织时会经历强烈 的散射和吸收，因此，要求成像系统的成像深度必须足够大；另一 方面，由于多色荧光团的最优激发波长各不相同，因此，要求宽谱 光源的功率谱密度足够高，才能充分有效地激发多色荧光团。

现有的成像系统多采用可长波激发的染料和高亮度光源(如大 功率的热炽灯，LED和激光器等)以提升激发光的穿透深度和亮度。 然而，这些光源用于多色荧光成像都存在一些不足：热炽灯(如卤 钨灯和氙灯)的光谱几乎能够覆盖所有荧光团的激发峰值，但是使 用寿命有限且大功率连续光照射可能引起光热损伤和光漂白，无法 实现高亮度的多色荧光激发；而LED和固体激光器的光谱线宽有 限，也难以实现多色荧光激发。

为了实现更深的穿透深度，一些研究者使用可长波激发的染料 和高亮度光源(如大功率的热炽灯，LED和激光器等)以提升激发 光的穿透深度和亮度。然而，这些光源用于多色荧光成像都存在一 些不足：热炽灯(如卤钨灯和氙灯)的光谱几乎能够覆盖所有荧光 团的激发峰值，但是使用寿命有限且大功率连续光照射可能引起光 热损伤和光漂白，无法实现高亮度的多色荧光激发；而LED和固体 激光器的光谱线宽有限，也难以实现多色荧光激发。因此，荧光成 像受限于现有激发光源，其用于深层组织的多色标记研究存在一定 的困难。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于超连续谱光源的多色荧光成像 系统，以解决上述的问题。

第一方面，本发明实施例提供的一种基于超连续谱光源的多色 荧光成像系统，包括：依次耦合的超连续谱激光发生装置、激光波 长选择装置和成像装置。所述超连续谱激光发生装置用于发出超连 续谱激光光束至所述激光波长选择装置。所述激光波长选择装置用 于按照预设规则依次选通所获取的所述超连续谱激光光束中不同波 长的单波长激光光束。所述成像装置用于依次获取所述待测物经多 个所述单波长激光光束激发后发出的多个单色荧光，根据所获取的 多个所述单色荧光生成多个单色荧光图像，将多个所述单色荧光图 像叠加以获得所述待测物的多色荧光图像。

优选地，所述超连续谱激光发生装置包括：超连续谱光源和光 纤准直器，所述超连续谱光源和光纤准直器耦合。所述超连续谱光 源用于发出所述超连续谱激光光束至所述光纤准直器。所述光纤准 直器用于将所述超连续谱激光光束准直成平行光束后发送至所述激 光波长选择装置。

优选地，所述激光波长选择装置包括：偏振器和声光可调滤光 片，所述偏振器和声光可调滤光片耦合。所述偏振器用于将所述超 连续谱激光光束的偏振方向转换为线偏振方向并输出。所述声光可 调滤光片用于按照预设规则依次选通所述偏振器输入的超连续谱激 光光束内不同波长的单波长激光光束并输出。

优选地，所述激光波长选择装置还包括：光强调节装置，所述 偏振器与所述光强调节装置耦合，所述光强调节装置与所述声光可 调滤光片耦合。所述光强调节装置用于调节所述偏振器输入的线偏 振方向的超连续谱激光光束的光强度，并将调节后的超连续谱激光 光束发送至所述声光可调滤光片。

优选地，还包括与所述激光波长选择装置耦合的照明装置，所 述照明装置用于将所述激光波长选择装置输出的多个单波长激光光 束依次扩束后照射所述待测物。

优选地，所述照明装置包括非球面准直透镜和反射镜，所述激 光波长选择装置与所述非球面准直透镜耦合，所述非球面准直透镜 与所述反射镜耦合。所述非球面准直透镜用于将输入的多个单波长 激光光束依次进行扩束并输出。所述反射镜用于将经扩束的多个单 波长激光光束反射到待测物。

优选地，所述成像装置包括：成像镜头和相机，所述成像镜头 与所述相机耦合。所述成像镜头用于将所接收的每个单色荧光聚焦 到所述相机。所述相机用于根据所获取的多个所述单色荧光生成多 个单色荧光图像，将多个所述单色荧光图像叠加以获得所述待测物 的多色荧光图像。

优选地，所述成像装置还包括带通滤光器，所述成像镜头与所 述带通滤光器耦合，所述带通滤光器与所述相机耦合。所述带通滤 光器用于将所述成像镜头输出的单色荧光以外的光滤掉，将所接收 的单色荧光选通后输入到所述相机。

优选地，所述相机为CCD相机。

优选地，还包括：承载平台，所述待测物放置于所述承载平台 上，所述承载平台用于将所述待测物移动至所述成像装置的成像视 野内。

本发明实施例中，超连续谱激光发生装置发出的超连续谱激光 光束具有超宽光谱和超短脉冲的特性。其中，超宽光谱能够覆盖待 测物的所有受激的单色荧光的波长范围，而超短脉冲具有较强的穿 透性，具有较高的成像深度，便于进行高深度的多色荧光成像。

因此，本发明实施例通过激光波长选择装置依次选择超连续谱 激光光束中不同波长的单色激光光束，成像装置依次获取所述待测 物经多个所述单波长激光光束激发后发出的多个单色荧光，根据所 获取的多个所述单色荧光生成多个单色荧光图像，将多个所述单色 荧光图像叠加以获得所述待测物的多色荧光图像。与现有技术相比， 能够减少待测物内不同的荧光团被照射的频率和时间，有效减少光 热损伤和光漂白的发生。

本发明的其他特征和优点将在随后的说明书阐述，并且，部分 地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明实施例了解。本 发明的目的和其他优点可通过在所写的说明书、权利要求书、以及 附图中所特别指出的结构来实现和获得。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下 面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下 面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术 人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获 得其他的附图。通过附图所示，本发明的上述及其它目的、特征和 优势将更加清晰。在全部附图中相同的附图标记指示相同的部分。 并未刻意按实际尺寸等比例缩放绘制附图，重点在于示出本发明的 主旨。

图1示出了本发明较佳实施例提供的基于超连续谱光源的多色 荧光成像系统的结构图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将 结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清 楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例， 而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施 例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。

因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非 旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实 施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创 造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范 围。

应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因 此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对 其进行进一步定义和解释。

在本发明的描述中，需要说明的是，术语“上”、“内”、“外” 等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，或者 是该发明产品使用时惯常摆放的方位或位置关系，仅是为了便于描 述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具 有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发 明的限制。

在本发明的描述中，还需要说明的是，除非另有明确的规定和 限定，术语“设置”、“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如， 可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机 械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介 间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人 员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

第一实施例

请参阅图1，图1示出了本发明较佳实施例提供的基于超连续 谱光源111的多色荧光成像系统100，所述多色荧光成像系统100 包括：超连续谱激光发生装置110、激光波长选择装置120和成像 装置130。

超连续谱激光发生装置110用于发出超连续谱激光光束至所述 激光波长选择装置120。具体地，超连续谱激光发生装置110可以 是超连续谱激光器，它将超短脉冲激光耦合进高非线性光纤，由于 光线的非线性效应、四波混频及光孤子效应，使得输出光的脉冲光 谱展宽，从而实现超宽的光谱输出。优选地，超连续谱激光光束的 波长范围可以是400-2400nm。

于本发明实施例中，超连续谱激光发生装置110包括超连续谱 光源111和光纤准直器112。连续谱光源可以为上述的超连续谱激 光器，用于发出所述超连续谱激光光束至所述光纤准直器112。光 纤准直器112用于将所述超连续谱激光光束准直成平行光束后发送 至所述激光波长选择装置120。具体地，光纤准直器112可以由尾 纤与自聚焦透镜精确定位而成，它可以将光纤内的传输光转变成准 直光(平行光)。

激光波长选择装置120用于按照预设规则依次选通所获取的所 述超连续谱激光光束中不同波长的单波长激光光束。优选地，激光 波长选择装置120的工作波段位于450-750nm之间。

激光波长选择装置120包括：偏振器121、光强调节装置122、 声光可调滤光片123和短通滤光片124，偏振器121、光强调节装置 122、声光可调滤光片123和短通滤光片124沿超连续谱激光光束的 传播路径依次耦合。

偏振器121用于将所述超连续谱激光光束的偏振方向转换为线 偏振方向，即产生线偏振光。具体地，偏振器121可以是格兰-泰勒 方解石偏振器121。

光强调节装置122用于调节所述偏振器121输入的线偏振方向 的超连续谱激光光束的光强度，并将调节后的超连续谱激光光束发 送至所述声光可调滤光片123。具体地，光强调节装置122可以为 消色差半波片，它是一种旋转半波片，其输出光束的光强由半波片 的快轴与入射光的方向夹角有关，一般是非线性的余弦函数的关系。 因此，旋转所述光强调节装置122的半波片，能够调节出射的超连 续谱激光光束的光强度。

声光可调滤光片123用于按照预设规则依次选通所述偏振器 121输入的超连续谱激光光束内不同波长的单波长激光光束并输 出。其中，预设规则是指在实施多色荧光成像过程中，设定采集多 个单色荧光图像的顺序。根据采集多个单色荧光图像的顺序，选出 每个单色荧光对应的产生荧光效果最好的单波长激光光束。具体地， 所述声光可调滤光片123可以是一种电调谐滤光片，辐射束通过介 质时发生相互作用而改变传输方向，产生布拉格衍射，即可具有选 通特定波长的激光光束通过的功能。于本发明实施例中，所述声光 可调滤光片123内的布拉格衍射的变化可以通过一个驱动信号来控 制，以按照预设规则依次改变布拉格衍射的状态，从而按照预设规 则依次选通所述偏振器121输入的超连续谱激光光束内不同波长的 单波长激光光束。

短通滤光片124用于将所述声光可调滤光片123输出的激光光 束进行滤波，以滤除所述声光可调滤光片123输出的激光光束的长 波部分。于本发明实施例中，所述多色荧光成像系统的工作波长集 中在450nm—750nm。因此，长波长主要是指大于800nm以上的波 长，所述超连续谱激光光束的长波部分是指超连续谱激光光束中波 长大于800nm部分的激光光束。需要说明的是，短通滤光片124的 截止波长可以根据所述工作波长而设定，本实施例所述的长波长的 范围并不构成对短通滤光片124的限定。

由于待测物内的荧光团能够在超连续谱激光光束的可见光波段 范围的激光光束作用下激发，因此，通过短通滤光片124将激光光 束内的长波段激光过滤掉，以有效防止本系统前段光源中所不需要 的长波段激光进入所述系统的后端部分。一方面，能够避免长波段 部分的激光光束的能量对成像装置中的感光元件CCD器件的损坏； 另一方面，能够避免长波段部分的激光光束的能量对待测物的破坏。

成像装置130用于依次获取所述待测物经多个所述单波长激光 光束激发后发出的多个单色荧光，根据所获取的多个所述单色荧光 生成多个单色荧光图像，将多个所述单色荧光图像叠加以获得所述 待测物的多色荧光图像。具体地，成像装置130可以是包括一个相 机133和数据处理装置。其中，相机133可以是CCD相机或者CMOS 相机133，优先为CCD相机。成像装置130可以在一次快门开启的 时间段内，成像装置130的荧光屏上接收多个所述单色荧光，然后 每个单色荧光产生的单色荧光图像在荧光屏上叠加以获得所述待测 物的多色荧光图像。当然，成像装置130也可以是包括一个CCD 相机和数据处理装置。CCD相机用于在每次快门开启时间内获取一 个单色荧光并生成一个单色荧光图像。数据处理装置用于获取CCD 相机生成的多个单色荧光图像，并将多个单色荧光图像叠加成一个 完成的多色荧光图像。其中，数据处理装置可以是由单片机、DSP 芯片或者ARM芯片构成的具有数据处理功能的集成电路模块。

另外，成像装置130还包括：成像镜头131和相机133。

所述成像镜头131用于将所接收的每个单色荧光聚焦到所述相 机133。具体地，所述成像镜头131可以是宽场成像镜头，例如， 成像镜头131包括24mm-70mm大光圈。

带通滤光器132用于将所述成像镜头131输出的单色荧光以外 的光滤掉，将所接收的单色荧光选通后输入到所述相机133。具体 地，带通滤光器132可以为由转轮和多种带通滤光片组成的光学器 件。其中，每个带通滤光片的选通波长对应一个单色荧光的中心波 长，通过转轮的转动可以将所需的带通滤光片旋转到单色荧光的传 播路径内，以实现对不同单色荧光的杂光的带通过滤。优选地，所 述带通滤光器132的转轮可以由驱动信号控制。

需要说明的是，本发明实施例中，所述待测物可以是通过转基 因技术(或抗体标记)将不同的荧光团(包括荧光蛋白，染料等) 特异性地标记到肿瘤和宿主细胞的动物，当然，也可以是其他的物 体。

采用本发明较佳实施例提供的多色荧光成像系统进行待测物的 多色荧光成像的具体实施方式如下：

预先设定CCD相机的积分时间。按照预设规则调整声光可调 滤光片123的驱动信号，以使声光可调滤光片123按照预设规则从 超连续谱激光光束内依次选通不同波长的单波长激光光束。转动带 通滤光器132的转轮，并适当旋转消色差半波片和调整CCD相机 的参数以获得信噪比良好的荧光图像。

CCD相机依次获取所述待测物经多个所述单波长激光光束激 发后发出的多个单色荧光，根据所获取的多个所述单色荧光生成多 个单色荧光图像。再将多个所述单色荧光图像叠加以获得所述待测 物的多色荧光图像。

第二实施例

请参阅图1，在第一实施例的基础上，所述多色荧光成像系统 100还包括：照明装置140和承载平台150。

承载平台150用于摆放待测物。所述承载平台150用于将所述 待测物移动至所述成像装置130的成像视野内。其中，所述成像装 置130的成像视野内是指成像镜头131的视野范围。优选地，承载 平台150能够移动，便于将所述待测物移动至所述成像装置130的 成像视野内。具体地，承载平台150是行程为114mmx75mm的二 维平移台。

照明装置140用于将所述激光波长选择装置120输出的多个单 波长激光光束依次扩束后照射所述待测物。

具体地，照明装置140包括：非球面准直透镜141和反射镜142， 所述非球面准直透镜141用于将输入的多个单波长激光光束依次进 行扩束并输出，所述反射镜142用于将经扩束的多个单波长激光光 束反射到待测物。经过所述非球面准直透镜141的扩束以及反射镜 142的反射后，在承载平台150上能够形成直径约为2-6cm的照明 光斑，以增大单波长激光光束的照射范围。优选地，照明装置140 和成像装置130均位于承载平台150的上方，非球面准直透镜141 的数值孔径为0.1-0.5，经非球面准直透镜141扩大后的光束的直径 为2-6cm。

所属领域的技术人员可以清楚地了解到，为描述的方便和简洁， 第二实施例的系统和装置的具体工作过程，可以参考前述实施例中 的对应过程，在此不再赘述

综上所述，本发明实施例中，超连续谱激光发生装置110发出 的超连续谱激光光束具有超宽光谱和超短脉冲的特性。其中，超宽 光谱能够覆盖待测物的所有受激的单色荧光的波长范围，而超短脉 冲具有较强的穿透性，具有较高的成像深度，便于进行高深度的多 色荧光成像。

因此，本发明实施例通过激光波长选择装置120依次选择超连 续谱激光光束中不同波长的单色激光光束，成像装置130依次获取 所述待测物经多个所述单波长激光光束激发后发出的多个单色荧 光，根据所获取的多个所述单色荧光生成多个单色荧光图像，将多 个所述单色荧光图像叠加以获得所述待测物的多色荧光图像。与现 有技术相比，能够减少待测物内不同的荧光团被照射的频率和时间， 有效减少光热损伤和光漂白的发生。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围 并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技 术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围 之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。