检测AGP1、SERPINA3和CDH1含量的系统在筛查活动性结核病患者中的应用

摘要

本发明公开了检测AGP1、SERPINA3和CDH1含量的系统在筛查活动性结核病患者中的应用。本申请的发明人发现了在活动性结核病患者中特异表达的三个蛋白质——AGP1、SERPINA3和CDH1，利用这三个蛋白质在血浆中的含量建了的筛查活动性结核病患者模型的灵敏度可达81.18％，特异性可达96.15％，准确性可达88.17％。可利用这三个蛋白质在血浆中的含量与筛查活动性结核病患者模型筛查活动性结核病患者，也可利用检测这三个蛋白质在血浆中含量的物质制备筛查活动性结核病患者产品。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中检测AGP1、SERPINA3和CDH1含量的系统在筛查活动性 结核病患者中的应用。

背景技术

结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis， MTB)感染引发的慢性传染性疾病，严重威胁人类健康。全国第五次结核病流行病学调查显 示我国现有超过500万名成人活动性肺结核患者。成人感染结核分枝杆菌后，部分呈现带菌 生存状态，并不会发展为结核病，称为结核潜伏感染者(Latenttuberculosisinfection, LTBI)；约5-10％的潜伏感染者会继续发展为活动性结核病(Activetuberculosis,ATB)。 活动性肺结核是指痰涂片阳性者,证明有结核分枝杆菌排出,病灶属于活动期,胸片上常有 斑片状阴影或是结核空洞,或者播散病灶,说明结核分枝杆菌繁殖活跃,毒力强。国内各地 区流行病学调查结果显示，基于γ-干扰素释放试验(IGRA)得出的结核分枝杆菌感染率大 约在20％-30％之间，即全国约有3-4亿人为结核分枝杆菌感染者，数目庞大的无临床症状 的结核潜伏感染者是活动性结核病的重要来源。此外，由于结核潜伏感染的预防性治疗方 案与活动性结核病的抗痨治疗方案显著不同。因此，如何实现结核分枝杆菌潜伏感染者与 活动性结核病患者的早期鉴别诊断至关重要。

常用的结核分枝杆菌感染诊断方法包括传统的结核菌素实验(TST)以及γ-干扰 素释放试验(IGRAs)，TST方法容易受到卡介苗接种和非结核分枝杆菌的干扰，结核分枝杆 菌感染诊断不够明确，更无法区别结核潜伏感染和活动性结核病。新近推行的IGRAs方法， 虽然能够检测结核分枝杆菌感染，但无法区分结核杆菌潜伏感染和活动性结核病。目前活 动性结核病的诊断金标准仍然是经典的痰涂片染色显微镜下查找抗酸杆菌以及结核杆菌 培养法，已有近百年的历史。这两种检测方法的敏感性均不高，痰涂片染色法的敏感性约 30％，结核杆菌培养法的敏感性约60％。痰涂片染色法虽然可以当天出结果，但不能区分结 核杆菌和非结核分枝杆菌，也不能区分MTB是活菌还是死菌。结核杆菌培养法的敏感性虽高 一些，但耗时较长，即使快速培养也需要1个月的时间才能得到结果。另外，对于临床上大量 的肺外结核和涂阴、菌阴的活动性结核病患者，金标准检测方法的应用受到限制，加剧了诊 断的困难，给及时治疗带来了阻力。近年来虽然陆续出现了一些先进的基于核酸扩增的分 子生物学检测技术(如XpertMTB/RIFassay)，但由于受到仪器设备和诊断费用的限制，以 及假阳性率偏高等问题，还无法全面推广。因此，现行的结核病诊断方法或辅助诊断手段都 无法实现快速有效的鉴别诊断结核分枝杆菌潜伏感染和活动性结核病，使得临床上面临严 重的治疗延误以及过度治疗等问题。基于此，寻找新的活动性结核病特异标志物，鉴别诊断 结核分枝杆菌潜伏感染和活动性结核病，已经成为活动性结核病临床诊断中一项亟待解决 的难题。

血浆蛋白质组组成成分、表达水平和疾病有密切联系，用蛋白质组学方法分析动 态变化的蛋白质组，对鉴别诊断活动性结核病和结核潜伏感染有重要意义。Labelfree2D- LC-MSMS是将非同位素标记技术、二维液相色谱串联质谱技术相联用，信号离子表现为不同 质荷比的峰，根据波峰的高度及面积可得到准确的蛋白质定量信息，非常适合对多样本的 平行分析。

Alpha-1-acidglycoprotein1(AGP1)，α1酸性糖蛋白(α1AG)，早期称乳清类粘蛋 白，由肝脏合成，癌细胞也可合成。AGP1的肽链结构与Ig轻链可变区及部分重链区、结合珠 蛋白α链结构类似，说明AGP1从Ig家系演变而来。体液中AGP1含量的变化可按下列病种排列 依次升高，即漏出液、炎症渗出液、恶性肿瘤渗出液。Alpha-1-antichymotrypsin (SERPINA3)，α-抗胰凝乳蛋白，虽然该蛋白的详细生理功能不是很清楚，但是可以抑制中性 粒细胞和肥大细胞类糜蛋白酶，两者都可以激活使血管紧张素。E-cadherin(CDH1)，上皮细 胞钙粘蛋白，上皮细胞钙粘蛋白是一种钙离子依赖的细胞粘附分子,存在于上皮细胞,参与 细胞的粘附和信息传导过程,并与肿瘤的分级和预后均有一定的相关关系。上皮细胞钙粘 蛋白的细胞外区为信号肽结构,具有钙离子结合点,能够与钙离子特异性结合,跨膜区起着 膜固定作用,是细胞与细胞间紧密连接的关键,当其表达下调或功能障碍时,将使同种细胞 失去粘附,意味着肿瘤细胞容易从原发病灶脱落分离。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何筛查活动性结核病患者。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了M1在制备筛查或辅助筛查活动性结核病 患者产品中的应用；所述M1包括检测AGP1、SERPINA3和CDH1含量的系统。

上述应用中，所述检测AGP1、SERPINA3和CDH1含量的系统可由检测AGP1含量的系 统、检测SERPINA3含量的系统和检测CDH1含量的系统组成。

上述应用中，所述检测AGP1含量的系统为通过酶联免疫反应检测AGP1含量所需的 试剂和/或仪器；所述检测SERPINA3含量的系统为通过酶联免疫反应检测SERPINA3含量所 需的试剂和/或仪器；所述检测CDH1含量的系统为通过酶联免疫反应检测CDH1含量所需的 试剂和/或仪器。

上述应用中，所述通过酶联免疫反应检测AGP1含量所需的试剂可为AGP1和/或 AGP1的抗体，也可由所述AGP1、所述AGP1的抗体以及进行酶联免疫反应所需要的其它试剂 组成。所述AGP1可在通过酶联免疫反应检测AGP1含量中作为蛋白标准品使用。所述AGP1、所 述AGP1的抗体以及所述进行酶联免疫反应所需要的其它试剂均可独立包装。

所述AGP1、所述AGP1的抗体以及所述进行酶联免疫反应所需要的其它试剂具体可 为abcam公司货号为abcam108854的试剂盒中试剂。

所述AGP1具体可为序列表中序列1所示的蛋白质。所述AGP1的抗体可为可识别所 述AGP1的单克隆抗体或多克隆抗体。

所述通过酶联免疫反应检测SERPINA3含量所需的试剂可为SERPINA3和/或 SERPINA3的抗体，也可由所述SERPINA3、所述SERPINA3的抗体以及进行酶联免疫反应所需 要的其它试剂组成。所述SERPINA3可在通过酶联免疫反应检测SERPINA3含量中作为蛋白标 准品使用。所述SERPINA3、所述SERPINA3的抗体以及所述进行酶联免疫反应所需要的其它 试剂均可独立包装。

所述SERPINA3、所述SERPINA3的抗体以及所述进行酶联免疫反应所需要的其它试 剂具体可为abcam公司货号为abcam157706的试剂盒中试剂。

所述SERPINA3具体可为序列表中序列2所示的蛋白质。所述SERPINA3的抗体可为 可识别所述SERPINA3的单克隆抗体或多克隆抗体。

所述通过酶联免疫反应检测CDH1含量所需的试剂可为CDH1和/或CDH1的抗体，也 可由所述CDH1、所述CDH1的抗体以及进行酶联免疫反应所需要的其它试剂组成。所述CDH1 可在通过酶联免疫反应检测CDH1含量中作为蛋白标准品使用。所述CDH1、所述CDH1的抗体 以及所述进行酶联免疫反应所需要的其它试剂均可独立包装。

所述CDH1、所述CDH1的抗体以及所述进行酶联免疫反应所需要的其它试剂具体可 为R&D公司货号为DCADE0的试剂盒中试剂。

所述CDH1具体可为序列表中序列3所示的蛋白质。所述CDH1的抗体可为可识别所 述CDH1的单克隆抗体或多克隆抗体。

上述应用中，所述M1还可包括数据处理装置，所述数据处理装置用于根据待测对 象的AGP1、SERPINA3和CDH1含量确定所述待测对象是否为活动性结核病患者。所述M1可仅 为所述检测AGP1、SERPINA3和CDH1含量的系统，也可由所述检测AGP1、SERPINA3和CDH1含量 的系统与所述数据处理装置组成。所述M1也可仅为由所述检测AGP1、SERPINA3和CDH1含量 的系统组成的试剂盒，也可仅为由所述检测AGP1、SERPINA3和CDH1含量的系统与所述数据 处理装置组成的试剂盒。

上述应用中，所述数据处理装置可为利用CART算法进行数据处理的数据处理装 置，如利用CART算法进行数据处理软件或模块。

上述应用中，在待测对象血浆样本中SERPINA3的含量≥227.221μg/mL时，如所述 待测对象血浆样本中AGP1≥3693.85μg/mL，所述待测对象为或候选为活动性结核病患者， 如所述待测对象血浆样本中AGP1<3693.85μg/mL，所述待测对象为或候选为非活动性结核 病患者；在所述待测对象血浆样本中SERPINA3的含量<227.221μg/mL时，如所述待测对象血 浆样本中CDH1<105.829ng/mL，所述待测对象为或候选为活动性结核病患者，如所述待测对 象血浆样本中CDH1≥105.829ng/mL，所述待测对象为或候选为非活动性结核病患者。

为解决上述技术问题，本发明还提供了以AGP1、SERPINA3和CDH1作为活动性结核 病标志物的筛查或辅助筛查活动性结核病患者的系统在下述X1或X2中的应用：

X1、制备筛查或辅助筛查活动性结核病患者产品；

X2、筛查或辅助筛查活动性结核病患者。

为解决上述技术问题，本发明还提供了所述筛查或辅助筛查活动性结核病患者的 系统可为所述M1。

为解决上述技术问题，本发明还提供了AGP1、SERPINA3和CDH1作为活动性结核病 标志物在筛查或辅助筛查活动性结核病患者中的应用。

为解决上述技术问题，本发明还提供了筛查或辅助筛查活动性结核病患者的产 品。所述筛查或辅助筛查活动性结核病患者的产品，为所述M1。

本文中，所述筛查或辅助筛查活动性结核病患者具体可从感染结核分枝杆菌 (Mycobacteriumtuberculosis，M.tb)者中进行筛查，以区分活动性结核病患者与结核潜 伏感染者(Latenttuberculosisinfection,LTBI)。

本文中，所述AGP1含量、所述SERPINA3含量和所述CDH1含量均可为血浆中的AGP1 含量、SERPINA3含量和CDH1含量。

本申请的发明人发现了在活动性结核病患者中特异表达的三个蛋白质——AGP1、 SERPINA3和CDH1，利用这三个蛋白质在血浆中的含量建了的筛查活动性结核病患者模型的 灵敏度可达81.18％，特异性可达96.15％，准确性可达88.17％。可利用这三个蛋白质在血 浆中的含量与筛查活动性结核病患者模型筛查活动性结核病患者，也可利用检测这三个蛋 白质在血浆中含量的物质制备筛查活动性结核病患者产品。

附图说明

图1为不同组别患者血浆中AGP1、SERPINA3和CDH1的含量。其中，A为AGP1，B为 SERPINA3，C为CDH1。

图2为模型建立阶段在结核潜伏感染患者和活动性结核病患者中筛查活动性结核 病患者的结果。其中，AGP1与SERPINA3的单位为μg/mL，CDH1的单位为ng/mL。

图3为模型建立阶段在健康人和活动性结核病患者中筛查活动性结核病患者的结 果。其中，AGP1与SERPINA3的单位为μg/mL，CDH1的单位为ng/mL。

图4为验证阶段在结核潜伏感染患者和活动性结核病患者中筛查活动性结核病患 者的结果。其中，AGP1与SERPINA3的单位为μg/mL，CDH1的单位为ng/mL。

图5为验证阶段在健康人和活动性结核病患者中筛查活动性结核病患者的结果。 其中，AGP1与SERPINA3的单位为μg/mL，CDH1的单位为ng/mL。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

受试者工作特征(receiveroperatingcharacteristic,ROC)反映了灵敏度与特 异度间的平衡，ROC曲线下面积是重要的试验准确度指标，ROC曲线下面积越大，试验的诊断 价值越大。

灵敏度(真阳性率)：实际有病而按试验标准被正确判断为有病的百分率，灵敏度 越大越好，理想灵敏度为100％。

特异度(真阴性率)：实际无病而按试验标准被正确判断为无病的百分率，特异度 越大越好，理想特异度为100％。

下述实施例中的默克去高丰度柱子为安捷伦公司产品；ProteinScape2.1软件为 德国Bruker公司产品。

实施例1、AGP1、SERPINA3、CDH1可以用来筛查活动性结核病患者

一、差异表达蛋白的筛选

1、检测对象为：健康对照组(HC)15例、活动性结核病组(TB)15例和结核潜伏感染 组(LTBI)15例。

健康对照组的入选标准为：无结核病史，无任何结核病临床症状，胸片无异常，结 核菌素皮试TST硬结直径小于5mm，伽马－干扰素释放试验IGRA检测阴性。

活动性结核病组的入选标准为：具有肺结核临床症状、胸部x线有结核病变，痰集 菌连续至少两次(+)或痰结核分枝杆菌培养阳性。

结核潜伏感染组的入选标准为：无任何结核病临床症状，胸片无异常，结核菌素皮 试TST硬结直径大于10mm，伽马－干扰素释放试验IGRA检测阳性。

所有的血浆样本均在清晨空腹下抽取，分离血浆后储存在-80低温冰箱中。

2、去除高丰度蛋白质，非标记血浆蛋白质：将实验用血浆样本-80℃取出后，待4℃ 自然溶解，使用默克去高丰度柱子，去除2种高丰度蛋白(白蛋白和IgG)。在过柱子过程中进 行紫外检测，初始体积为50ul血浆进行处理收集第一个峰，流出柱子后蛋白质进行3k分子 量截留超滤，以去除洗脱液中的盐成分，再用丙酮在-20℃沉淀过夜，蛋白质沉淀用溶解液 再悬浮，最后测定蛋白质浓度。

3、测定好浓度的蛋白质脱盐处理后，进行胰蛋白酶酶解，2D-LC-MS/MS分离和检测 蛋白质。

2D-LC-MS/MS液相色谱条件：

a.纳升分析柱：dionexC18纳升分离柱，75μm×15cm，粒径3μm，孔径

b.捕获柱：dionexC18，300μm×5mm，粒径5μm，孔径

c.进样体积：16μL。

d.流速：0.5μL/min。

e.流动相：SolventA:H₂O(0.1％FA)，SolventB:ACN(0.1％FA)。

梯度洗脱条件见表1.

表1.NanoLC液相色谱梯度洗脱条件

质谱采用质谱仪micrOTOF-QII进行，条件为：

f.一级谱条件：源温：180℃，采集范围：MS：m/z50-m/z2500，扫描速度：3Hz。

g.二级谱条件：AutoMS/MS模式，采集范围：MS/MS：m/z50-m/z2500，扫描速度： 2Hz。

4、ProteinScape2.1软件鉴定和分析差异蛋白质：导出msms波谱，搜索mascot human数据库，软件对每一种蛋白质进行打分评级，protscore大于1.3且有一个及以上肽段 有95％置信度的蛋白质进行下一轮数据分析，通过软件获得蛋白质的ID号码，并根据同一 种蛋白质在不同组别中的质谱峰面积获得蛋白质差异比值，并分析蛋白质生物学功能等信 息。共筛选出满足protscore大于1.3且有一个及以上肽段有95％置信度的蛋白质227个。

5、挑选活动性结核病特征蛋白质：分别对比健康对照组和结核潜伏感染组，进行 蛋白质组间比较，找出差异表达的蛋白质，蛋白质比值大于2.0倍表明其表达显著上调，蛋 白质比值小于0.5倍表明其表达显著下调。其中活动性结核病组与结核潜伏感染组比较，活 动性结核病组高表达蛋白质37个，活动性结核病组低表达蛋白质28个；活动性结核病组与 健康对照组比较，活动性结核病组高表达蛋白质28个，活动性结核病组低表达蛋白质34个。 最后筛选出3个与活动性结核病发生密切相关的特征蛋白质，分别为AGP1、SERPINA3、CDH1。 不同组别中这三个蛋白质含量的比值如表2所示。

表2.活动性结核病、结核潜伏感染和健康对照血浆中3种特征蛋白质表达变化

表2中，“活动性结核病/结核潜伏感染”表示相应蛋白质在活动性结核病组中表达 量与结核潜伏感染组中表达量比值的平均值；“活动性结核病/健康对照”表示相应蛋白质 在活动性结核病组中表达量与健康对照组中表达量比值的平均值。

不同组别中AGP1、SERPINA3、CDH1蛋白质的含量如图1所示。活动性结核病组(TB) 患者血浆中的AGP1含量分别高于健康对照组(HC)和结核潜伏感染组(LTBI)，活动性结核病 组(TB)患者血浆中的SERPINA3含量分别高于健康对照组(HC)和结核潜伏感染组(LTBI)，活 动性结核病组(TB)患者血浆中的CDH1含量分别低于健康对照组(HC)和结核潜伏感染组 (LTBI)。

二、差异表达蛋白的验证

1、模型建立阶段

发明人重新收集了71例健康人、85例活动性结核病患者和84例结核潜伏感染患者 血浆样本，健康人、活动性结核病患者与结核潜伏感染患者均满足步骤一中相应组别的标 准。

通过ELISA检测所有样本中AGP1、SERPINA3、CDH1蛋白质的含量，实验重复三次。

检测样本中AGP1含量利用abcam公司的货号为abcam108854的试剂盒进行，其中二 抗带有链霉素－过氧化物酶标记，作为标准品的AGP1蛋白质的氨基酸序列为序列表中序列 1；

检测样本中SERPINA3含量利用abcam公司的货号为abcam157706的试剂盒进行，其 中二抗带有辣根过氧化物酶标记，作为标准品的AGP1蛋白质的氨基酸序列为序列表中序列 2；

检测样本中CDH1含量利用R&D公司的货号为DCADE0的试剂盒进行，其中，作为标准 品的CDH1蛋白质的氨基酸序列为序列表中序列3。

样本中AGP1、SERPINA3、CDH1蛋白质的平均含量如表3所示。

ELISA检测方法具体如下：

(1)实验前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温(20-25℃)。

(2)建立标准曲线：设标准孔和空白对照。

(3)加样：除空白孔外，分别将不同浓度的标准品和标本加入相应的孔中，将反应 板置37℃120分钟，用洗涤液将反应板充分洗涤4-5次，向滤纸上印干。

(4)加酶标抗体：除空白孔外，加入酶标抗体工作液，将反应板充分混匀后置37℃ 60分钟，洗板同前。

(5)加底物液显色：于反应孔中加入底物溶液50uL，37℃，10-30分钟。

(6)终止反应：于反应孔中加入终止液50uL。此时蓝色立转黄色，于20min内测定实 验结果。

(7)结果判定：将酶标板在酶标仪上，于450nm，读数，输出到Excel中。

表3.样本中AGP1含量(μg/mL)、SERPINA3含量(μg/mL)和CDH1含量(ng/mL)

表3中，“——”表示无该数据。

利用CART决策树分析建立筛查模型，该筛查活动性结核病患者模型如下：在待测 对象血浆样本中SERPINA3的含量≥227.221μg/mL时，如待测对象血浆样本中AGP1≥ 3693.85μg/mL，待测对象为活动性结核病患者，如待测对象血浆样本中AGP1<3693.85μg/ mL，待测对象为非活动性结核病患者；在待测对象血浆样本中SERPINA3的含量<227.221μg/ mL时，如待测对象血浆样本中CDH1<105.829ng/mL，待测对象为活动性结核病患者，如待测 对象血浆样本中CDH1≥105.829ng/mL，待测对象为非活动性结核病患者。

利用该模型在结核潜伏感染患者和活动性结核病患者中筛查活动性结核病患者 的结果如图2所示，正确筛查出69例(11例+58例)活动性结核病患者与80例(78例+2例)非活 动性结核病患者，灵敏度为69/85×100％＝81.18％，特异度为80/84×100％＝95.24％，准 确性为(69+80)/(85+84)×100％＝88.17％。

利用该模型在健康人和活动性结核病患者中筛查活动性结核病患者的结果如图3 所示，正确筛查出69例(11例+58例)活动性结核病患者与64例(63例+1例)非活动性结核病 患者，灵敏度为69/85×100％＝81.18％，特异度为64/71×100％＝90.14％，准确性为(69+ 64)/(85+71)×100％＝85.26％。

利用该模型在活动性结核病患者和非活动性结核病患者(结核潜伏感染患者+健 康人)中筛查活动性结核病患者，正确筛查出69例活动性结核病患者与144例(80例+64例) 非活动性结核病患者，灵敏度为81.18％，特异度为144/(84+71)×100％＝92.90％，准确性 为(69+144)/(85+84+71)×100％＝88.75％。

2、验证

发明人利用另外的26例健康人、28例活动性结核病患者和26例结核潜伏感染患者 的血浆样本对步骤1中的模型进行了验证，健康人、活动性结核病患者与结核潜伏感染患者 均满足步骤一中相应组别的标准。

按照步骤1中ELISA方法检测样本中AGP1、SERPINA3、CDH1蛋白质的含量，结果如表 4所示。

表4.样本中AGP1含量(μg/mL)、SERPINA3含量(μg/mL)和CDH1含量(ng/mL)

表4中，“——”表示无该数据。

利用步骤1的筛查活动性结核病患者模型在结核潜伏感染患者和活动性结核病患 者中筛查活动性结核病患者的结果如图4所示，正确筛查出21例(0例+21例)活动性结核病 患者与25例(25例+0例)非活动性结核病患者，灵敏度为21/28×100％＝75％，特异度为25/ 26×100％＝96.15％，准确性为(21+25)/(28+26)×100％＝85.18％。

利用步骤1的筛查活动性结核病患者模型在健康人和活动性结核病患者中筛查活 动性结核病患者的结果如图5所示，正确筛查出21例(0例+21例)活动性结核病患者与24例 (24例+0例)非活动性结核病患者，灵敏度为21/28×100％＝75％，特异度为24/26×100％ ＝92.3％，准确性为(21+24)/(28+26)×100％＝83.33％。

利用步骤1的筛查活动性结核病患者模型在活动性结核病患者和非活动性结核病 患者(结核潜伏感染患者+健康人)中筛查活动性结核病患者，正确筛查出21例活动性结核 病患者与49例(25例+24例)非活动性结核病患者，灵敏度为75％，特异度为49/(26+26)× 100％＝94.23％，准确性为(21+49)/(28+26+26)×100％＝87.5％。