公开/公告号CN105588898A
专利类型发明专利
公开/公告日2016-05-18
原文格式PDF
申请/专利权人 内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司;
申请/专利号CN201410564029.2
申请日2014-10-22
分类号G01N30/06(20060101);
代理机构北京汉德知识产权代理事务所(普通合伙);
代理人刘子文;徐驰
地址 011517 内蒙古自治区呼和浩特市和林格尔盛乐经济园区
入库时间 2023-12-18 15:20:54
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2018-01-16
授权
授权
2016-06-15
实质审查的生效 IPC(主分类):G01N30/06 申请日:20141022
实质审查的生效
2016-05-18
公开
公开
技术领域
本发明涉及一种检测牛奶中药物残留的样品前处理方法及检测方法，尤其适用于牛奶中磺胺类药物的检测。
背景技术
目前，牛奶中磺胺类药物残留检测方法以GB/T22966-2008《牛奶和奶粉中16种磺胺类药物残留量的测定液相色谱-串联质谱法》的方法为主，因其检测需要质谱，价格昂贵，且对化验员的水平要求较高，无法在一般中、小企业中进行推广；该方法使用危险性较高的药品-高氯酸，因为高氯酸可助燃，具强腐蚀性、强刺激性，可致人体灼伤，会给化验室带来安全隐患。
GB29694-2013《食品安全国家标准动物性食品中13种磺胺类药物多残留的测定-高效液相色谱法》中检验方法适用于肌肉和肝脏组织的检测，由于牛奶与肉类化学成分的差异，使用这种方法应用于牛奶检测时回收率无法满足检测要求。
发明内容
本发明的目的是提供一种液相色谱法检测牛奶中磺胺类药物残留的样品前处理方法，安全性高，可较完全地提取牛奶样品中的磺胺类药物。
本发明的另一个目的是提供一种液相色谱法检测牛奶中磺胺类药物残留的方法，成本低，安全性高，检测的回收率和精密度较好。
本发明提供了一种液相色谱法检测牛奶中磺胺类药物残留的样品前处理方法，包括：取1至5克待测牛奶样品，加入10至30mL乙腈，涡旋混合1至5分钟，再于8000至10000转/分钟离心3至5分钟，取上清液；并向离心后的残渣中加入乙腈10至30毫升，涡旋混合1至5分钟，再于8000至10000转/分钟离心3至5分钟，取上清液；合并两次所得的上清液；将合并后的上清液置于旋蒸瓶中，在40至50℃下旋转蒸发至干；再依次用0.1至0.2mol/L盐酸水溶液2至5mL、0.1至0.2mol/L盐酸水溶液2至5mL、正己烷3至5mL和正己烷3至5mL分别清洗旋蒸瓶；所得清洗液合并至同一离心管中，涡旋混合30至120秒，再于8000至10000转/分钟离心3至5分钟；离心后弃正己烷层，取下层液；将下层液用MCX固相萃取柱净化，得到净化液；以及将净化液于40至50℃氮气吹干，再用0.1%甲酸乙腈溶液1.0至5mL溶解；其中0.1%甲酸乙腈溶液的配制方法为：取0.1%甲酸水溶液830mL，用乙腈溶解并稀释至1000mL。
在样品前处理方法的一种示意性实施方式中，用MCX固相萃取柱净化的步骤为：先将MCX固相萃取柱依次用甲醇2至5mL和0.1mol/L盐酸水溶液2至5mL活化；将下层液过活化后的MCX固相萃取柱，控制流速1至2mL/分钟；依次用0.1至0.2mol/L盐酸水溶液1至2mL和50%甲醇乙腈溶液2至4mL淋洗MCX固相萃取柱；50%甲醇乙腈溶液的配制方法为：取甲醇50mL，用乙腈溶解并稀释至100mL；以及最后用4mL洗脱液洗脱，洗脱液的配制方法为：取氨水5mL，用甲醇溶解并稀释至100mL。
在样品前处理方法的一种示意性实施方式中，磺胺类药物包括：磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺噁唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺异噁唑、磺胺甲噁唑、苯酰磺胺和磺胺二甲氧哒嗪。
本发明还提供了一种液相色谱法检测牛奶中磺胺类药物残留的方法，其特征在于，先根据上述的样品前处理方法对待测牛奶样品进行前处理，再用液相色谱法进行检测。
在液相色谱法检测牛奶中磺胺类药物残留的方法的一种示意性实施方式中，液相色谱的色谱条件为：柱温箱：30至45℃；紫外检测器检测波长：270nm；进样量：20至50μL；色谱柱：C18或C8，规格为250×4.6mm，5μm；流动相：0.1%甲酸水溶液和乙腈；流速：1.0至1.5mL/分钟；洗脱梯度：
本发明提供的一种液相色谱法检测牛奶中磺胺类药物残留的样品前处理方法，操作过程中无需使用危险性较高的高氯酸，安全性较高，且可较完全地提取牛奶样品中的磺胺类药物。使用该样品前处理方法进行牛奶中磺胺类药物残留的液相色谱法检测，安全性高，检测的回收率和精密度较好。由于本发明的检测方法无需使用质谱检测器，也降低了检测成本。
具体实施方式
为了对发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现结合以下实施例说明本发明的具体实施方式。
虽然以下实施例采用了带有紫外检测器的色谱系统，但目的是便于说明本发明的技术方案、便于比较检测的效果，并非用于限定本发明。本领域的技术人员可以用质谱检测器或其他适合磺胺药物的检测器代替紫外检测器，也可以实施本发明的检测方法。
实施例1。
一、试剂：
0.1%甲酸溶液：取甲酸1mL，用水溶解并稀释至1000mL；
0.1%甲酸乙腈溶液：取0.1%甲酸水溶液830mL，用乙腈溶解并稀释至1000mL；
洗脱液：取氨水5mL，用甲醇溶解并稀释至100mL；
50%甲醇乙腈溶液：取甲醇50mL，用乙腈溶解并稀释至100mL。
二、样品前处理方法：
1、取1克待测牛奶样品，加入30mL乙腈，涡旋混合5分钟，再于10000转/分钟离心5分钟，取上清液；
2、向离心后的残渣中加入乙腈30毫升，涡旋混合5分钟，再于10000转/分钟离心5分钟，取上清液；合并两次所得的上清液；
3、将合并后的上清液置于旋蒸瓶中，在40℃下旋转蒸发至干；再依次用0.2mol/L盐酸水溶液2mL、0.2mol/L盐酸水溶液2mL、正己烷3mL和正己烷3mL分别清洗旋蒸瓶；所得清洗液合并至同一离心管中，涡旋混合30秒，再于8000转/分钟离心5分钟；离心后弃正己烷层，取下层液；
4、将下层液用MCX固相萃取柱净化，得到净化液，具体步骤如下：
4.1先将MCX固相萃取柱依次用甲醇5mL和0.1mol/L盐酸水溶液2mL活化；
4.2将下层液过活化后的MCX固相萃取柱，控制流速1mL/分钟；
4.3依次用0.2mol/L盐酸水溶液1mL和50%甲醇乙腈溶液2mL淋洗MCX固相萃取柱；
4.4最后用4mL洗脱液洗脱；
5、将净化液于40℃氮气吹干，再用0.1%甲酸乙腈溶液1mL溶解，滤膜过滤，得到待测液，供高效液相色谱测定。
三、高效液相色谱法（HPLC）检测。
使用戴安公司高效液相色谱仪，配紫外检测器。设定色谱条件如下：
柱温箱：30℃；
紫外检测器检测波长：270nm；
进样量：20μL；
色谱柱：C8，规格为250×4.6mm，5μm；
流动相：0.1%甲酸水溶液和乙腈；
流速：1mL/分钟；
洗脱梯度：
检测目标物质：磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺噁唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺异噁唑、磺胺甲噁唑、苯酰磺胺和磺胺二甲氧哒嗪。
标准溶液浓度梯度：12种磺胺类标准品的浓度均为100μg/kg、200μg/kg、300μg/kg、400μg/kg、500μg/kg，稀释溶剂为0.1%甲酸乙腈溶液。
利用HPLC对12种磺胺类药物标准溶液进行检测，制订磺胺浓度与峰面积之间对应关系的标准曲线，12种磺胺类药物标准曲线的R2均大于0.999。根据标准曲线及对待测液的检测结果计算待测牛奶样品中12种磺胺类药物的含量。
实施例2。
一、试剂：
0.1%甲酸溶液：取甲酸1mL，用水溶解并稀释至1000mL；
0.1%甲酸乙腈溶液：取0.1%甲酸水溶液830mL，用乙腈溶解并稀释至1000mL；
洗脱液：取氨水5mL，用甲醇溶解并稀释至100mL；
50%甲醇乙腈溶液：取甲醇50mL，用乙腈溶解并稀释至100mL。
二、样品前处理方法：
1、取5克待测牛奶样品，加入10mL乙腈，涡旋混合1分钟，再于8000转/分钟离心3分钟，取上清液；
2、向离心后的残渣中加入乙腈10毫升，涡旋混合1分钟，再于8000转/分钟离心3分钟，取上清液；合并两次所得的上清液；
3、将合并后的上清液置于旋蒸瓶中，在50℃下旋转蒸发至干；再依次用0.1mol/L盐酸水溶液5mL、0.1mol/L盐酸水溶液5mL、正己烷5mL和正己烷5mL分别清洗旋蒸瓶；所得清洗液合并至同一离心管中，涡旋混合120秒，再于10000转/分钟离心3分钟；离心后弃正己烷层，取下层液；
4、将下层液用MCX固相萃取柱净化，得到净化液，具体步骤如下：
4.1先将MCX固相萃取柱依次用甲醇2mL和0.1mol/L盐酸水溶液5mL活化；
4.2将下层液过活化后的MCX固相萃取柱，控制流速2mL/分钟；
4.3依次用0.1mol/L盐酸水溶液2mL和50%甲醇乙腈溶液4mL淋洗MCX固相萃取柱；
4.4最后用4mL洗脱液洗脱；
5、将净化液于50℃氮气吹干，再用0.1%甲酸乙腈溶液5mL溶解，滤膜过滤，得到待测液，供高效液相色谱测定。
三、高效液相色谱法（HPLC）检测。
使用戴安公司高效液相色谱仪，配紫外检测器。设定色谱条件如下：
柱温箱：45℃；
紫外检测器检测波长：270nm；
进样量：50μL；
色谱柱：C18，规格为250×4.6mm，5μm；
流动相：0.1%甲酸水溶液和乙腈；
流速：1.5mL/分钟；
洗脱梯度：
检测目标物质：磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺噁唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺异噁唑、磺胺甲噁唑、苯酰磺胺和磺胺二甲氧哒嗪。
标准溶液浓度梯度：12种磺胺类标准品的浓度均为100μg/kg、200μg/kg、300μg/kg、400μg/kg、500μg/kg，稀释溶剂为0.1%甲酸乙腈溶液。
利用HPLC对12种磺胺类药物标准溶液进行检测，制订磺胺浓度与峰面积之间对应关系的标准曲线，12种磺胺类药物标准曲线的R2均大于0.999。根据标准曲线及对待测液的检测结果计算待测牛奶样品中12种磺胺类药物的含量。
实施例3。
一、试剂：
0.1%甲酸溶液：取甲酸1mL，用水溶解并稀释至1000mL；
0.1%甲酸乙腈溶液：取0.1%甲酸水溶液830mL，用乙腈溶解并稀释至1000mL；
洗脱液：取氨水5mL，用甲醇溶解并稀释至100mL；
50%甲醇乙腈溶液：取甲醇50mL，用乙腈溶解并稀释至100mL。
二、样品前处理方法：
1、取2克待测牛奶样品，加入10mL乙腈，涡旋混合2分钟，再于8000转/分钟离心5分钟，取上清液；
2、向离心后的残渣中加入乙腈10毫升，涡旋混合2分钟，再于8000转/分钟离心5分钟，取上清液；合并两次所得的上清液；
3、将合并后的上清液置于旋蒸瓶中，在50℃下旋转蒸发至干；再依次用0.1mol/L盐酸水溶液2mL、0.1mol/L盐酸水溶液2mL、正己烷5mL和正己烷5mL分别清洗旋蒸瓶；所得清洗液合并至同一离心管中，涡旋混合60秒，再于8000转/分钟离心5分钟；离心后弃正己烷层，取下层液；
4、将下层液用MCX固相萃取柱净化，得到净化液，具体步骤如下：
4.1先将MCX固相萃取柱依次用甲醇3mL和0.1mol/L盐酸水溶液4mL活化；
4.2将下层液过活化后的MCX固相萃取柱，控制流速1mL/分钟；
4.3依次用0.15mol/L盐酸水溶液1.5mL和50%甲醇乙腈溶液3mL淋洗MCX固相萃取柱；
4.4最后用4mL洗脱液洗脱；
5、将净化液于50℃氮气吹干，再用0.1%甲酸乙腈溶液2mL溶解，滤膜过滤，得到待测液，供高效液相色谱测定。
三、高效液相色谱法（HPLC）检测。
使用戴安公司高效液相色谱仪，配紫外检测器。设定色谱条件如下：
柱温箱：40℃；
紫外检测器检测波长：270nm；
进样量：30μL；
色谱柱：C8，规格为250×4.6mm，5μm；
流动相：0.1%甲酸水溶液和乙腈；
流速：1.2mL/分钟；
洗脱梯度：
检测目标物质：磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺噁唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺异噁唑、磺胺甲噁唑、苯酰磺胺和磺胺二甲氧哒嗪。
标准溶液浓度梯度：12种磺胺类标准品的浓度均为100μg/kg、200μg/kg、300μg/kg、400μg/kg、500μg/kg，稀释溶剂为0.1%甲酸乙腈溶液。
利用HPLC对12种磺胺类药物标准溶液进行检测，制订磺胺浓度与峰面积之间对应关系的标准曲线，12种磺胺类药物标准曲线的R2均大于0.999。根据标准曲线及对待测液的检测结果计算待测牛奶样品中12种磺胺类药物的含量。
实施例4。
一、试剂：
0.1%甲酸溶液：取甲酸1mL，用水溶解并稀释至1000mL；
0.1%甲酸乙腈溶液：取0.1%甲酸水溶液830mL，用乙腈溶解并稀释至1000mL；
洗脱液：取氨水5mL，用甲醇溶解并稀释至100mL；
50%甲醇乙腈溶液：取甲醇50mL，用乙腈溶解并稀释至100mL。
二、样品前处理方法：
1、取2.5克待测牛奶样品，加入15mL乙腈，涡旋混合2分钟，再于10000转/分钟离心5分钟，取上清液；
2、向离心后的残渣中加入乙腈15毫升，涡旋混合2分钟，再于10000转/分钟离心5分钟，取上清液；合并两次所得的上清液；
3、将合并后的上清液置于旋蒸瓶中，在45℃下旋转蒸发至干；再依次用0.1mol/L盐酸水溶液3mL、0.1mol/L盐酸水溶液3mL、正己烷5mL和正己烷5mL分别清洗旋蒸瓶；所得清洗液合并至同一离心管中，涡旋混合60秒，再于9000转/分钟离心5分钟；离心后弃正己烷层，取下层液；
4、将下层液用MCX固相萃取柱净化，得到净化液，具体步骤如下：
4.1先将MCX固相萃取柱依次用甲醇4mL和0.1mol/L盐酸水溶液4mL活化；
4.2将下层液过活化后的MCX固相萃取柱，控制流速2mL/分钟；
4.3依次用0.15mol/L盐酸水溶液1.5mL和50%甲醇乙腈溶液2mL淋洗MCX固相萃取柱；
4.4最后用4mL洗脱液洗脱；
5、将净化液于50℃氮气吹干，再用0.1%甲酸乙腈溶液5mL溶解，滤膜过滤，得到待测液，供高效液相色谱测定。
三、高效液相色谱法（HPLC）检测。
使用戴安公司高效液相色谱仪，配紫外检测器。设定色谱条件如下：
柱温箱：35℃；
紫外检测器检测波长：270nm；
进样量：50μL；
色谱柱：C18，规格为250×4.6mm，5μm；
流动相：0.1%甲酸水溶液和乙腈；
流速：1mL/分钟；
洗脱梯度：
检测目标物质：磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺噁唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺异噁唑、磺胺甲噁唑、苯酰磺胺和磺胺二甲氧哒嗪。
标准溶液浓度梯度：12种磺胺类标准品的浓度均为100μg/kg、200μg/kg、300μg/kg、400μg/kg、500μg/kg，稀释溶剂为0.1%甲酸乙腈溶液。
利用HPLC对12种磺胺类药物标准溶液进行检测，制订磺胺浓度与峰面积之间对应关系的标准曲线，12种磺胺类药物标准曲线的R2均大于0.999。根据标准曲线及对待测液的检测结果计算待测牛奶样品中12种磺胺类药物的含量。
实施例5。
一、试剂：
0.1%甲酸溶液：取甲酸1mL，用水溶解并稀释至1000mL；
0.1%甲酸乙腈溶液：取0.1%甲酸水溶液830mL，用乙腈溶解并稀释至1000mL；
洗脱液：取氨水5mL，用甲醇溶解并稀释至100mL；
50%甲醇乙腈溶液：取甲醇50mL，用乙腈溶解并稀释至100mL。
二、样品前处理方法：
1、取1克待测牛奶样品，加入10mL乙腈，涡旋混合2分钟，再于9000转/分钟离心4分钟，取上清液；
2、向离心后的残渣中加入乙腈10毫升，涡旋混合2分钟，再于9000转/分钟离心4分钟，取上清液；合并两次所得的上清液；
3、将合并后的上清液置于旋蒸瓶中，在45℃下旋转蒸发至干；再依次用0.15mol/L盐酸水溶液2mL、0.15mol/L盐酸水溶液2mL、正己烷4mL和正己烷4mL分别清洗旋蒸瓶；所得清洗液合并至同一离心管中，涡旋混合60秒，再于10000转/分钟离心4分钟；离心后弃正己烷层，取下层液；
4、将下层液用MCX固相萃取柱净化，得到净化液，具体步骤如下：
4.1先将MCX固相萃取柱依次用甲醇5mL和0.1mol/L盐酸水溶液3mL活化；
4.2将下层液过活化后的MCX固相萃取柱，控制流速1.5mL/分钟；
4.3依次用0.15mol/L盐酸水溶液1.5mL和50%甲醇乙腈溶液2mL淋洗MCX固相萃取柱；
4.4最后用4mL洗脱液洗脱；
5、将净化液于45℃氮气吹干，再用0.1%甲酸乙腈溶液4mL溶解，滤膜过滤，得到待测液，供高效液相色谱测定。
三、高效液相色谱法（HPLC）检测。
使用戴安公司高效液相色谱仪，配紫外检测器。设定色谱条件如下：
柱温箱：45℃；
紫外检测器检测波长：270nm；
进样量：20μL；
色谱柱：C18，规格为250×4.6mm，5μm；
流动相：0.1%甲酸水溶液和乙腈；
流速：1.5mL/分钟；
洗脱梯度：
检测目标物质：磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺噁唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺异噁唑、磺胺甲噁唑、苯酰磺胺和磺胺二甲氧哒嗪。
标准溶液浓度梯度：12种磺胺类标准品的浓度均为100μg/kg、200μg/kg、300μg/kg、400μg/kg、500μg/kg，稀释溶剂为0.1%甲酸乙腈溶液。
利用HPLC对12种磺胺类药物标准溶液进行检测，制订磺胺浓度与峰面积之间对应关系的标准曲线，12种磺胺类药物标准曲线的R2均大于0.999。根据标准曲线及对待测液的检测结果计算待测牛奶样品中12种磺胺类药物的含量。
回收率、精密度和检出限实验。
回收率测定方法：向牛奶样品中加入12种磺胺类药物标准品，制得加标样本。12种磺胺类药物的加标浓度均为50μg/kg。用实施例1-5的方法对加标样本进行检测，并计算加标回收率。
精密度测定方法：向牛奶样品中加入12种磺胺类药物标准品，制得加标样本。12种磺胺类药物的加标浓度均为50μg/kg。用实施例1-5的方法对加标样本重复检测6次，并计算检测结果的相对标准偏差。
检出限测定方法：将空白样本（不含12种磺胺的正常牛奶样品）通过实施例1-5的方法进行检测，计算3倍噪音的响应值所对应的浓度即为检出限，同时考虑回收率的影响。
同时设置一个对比例，具体方法为：首先按照GB29694-2013《动物性食品中13种磺胺类药物多残留的测定》中“7.1提取”和“7.2净化”的方法对待测牛奶样品进行前处理；然后按照实施例1的“三、高效液相色谱法（HPLC）检测”进行检测。
回收率测定结果：
由此可见，实施例1-5的回收率均能满足GB/T27404中的要求，在60%-120%之间，对比例回收率无法满足要求，而实施例1-5的方法较好。
精密度测定结果：
由此可见，实施例1-5的精密度在15%以内，对比例中磺胺醋酰、磺胺二甲氧哒嗪和磺胺吡啶精密度超出15%，实施例1-5精密度好。
检出限测定结果，单位为μg/kg：
由此可见，实施例1-5中检出限为3.25-10.03之间。从上述试验数据涉及的12种磺胺药物来看，对比例的检出限全部高于本发明实施例1-5的检出限，所以实施例1-5方法具有显著的进步。
在本文中，“示意性”表示“充当实例、例子或说明”，不应将在本文中被描述为“示意性”的任何实施方式解释为一种更优选的或更具优点的技术方案。
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应当理解，虽然本说明书是按照各个实施例描述的，但并非每个实施例仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
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机译： 样品（变体）中一种或多种分析物的特异性检测方法，样品中至少一种细胞类型或有机物的鉴定或价值的方法，样品中至少一种分析物的存在或价值的检测方法，方法跟踪细胞或有机体的方法，用于识别或评估潜在药物制剂的指标
机译： 青霉素结合蛋白，核酸，抗体或抗体片段，药物，药物组合物，至少一种青霉素结合蛋白或其片段或变异体或片段，至少一种核酸和至少一种抗体或抗体片段的用途，针对脑膜炎奈瑟菌的青霉素结合蛋白，核酸，抗体或抗体片段感染的体外抗体检测方法，至少一种青霉素结合蛋白或其片段或变异体或变异体，至少一种核酸的药物组合物酸和至少一种针对哺乳动物生物样品中脑膜炎奈瑟氏菌感染的抗体以及来自哺乳动物生物样品中的矿业性奈瑟氏球菌感染的体外诊断和单克隆抗体
机译： 牛奶样品中乳腺病原菌的检测方法
