用于合浦珠母贝微卫星家系鉴定的微卫星标记引物及鉴定方法和应用

摘要

本发明公开了一种用于合浦珠母贝微卫星家系鉴定的微卫星标记引物，所述微卫星标记引物共有9个引物对，分别为PF-3、PF-4、PF-11、PF-13、PF-16、PF-27、PF-30、PF-44和PF-48，还公开了一种合浦珠母贝微卫星家系的鉴定方法及上述微卫星标记引物在合浦珠母贝家系鉴定中的应用。采用本发明中的微卫星标记引物，首次在合浦珠母贝上利用荧光标记的多态微卫星标记建立了亲子鉴定平台，其鉴定准确率达到了90.24％；本发明方法能快速、有效地鉴别合浦珠母贝不同家系及来源，为合浦珠母贝的选育，繁殖配组和增殖放流评估提供了依据。

说明书

技术领域

本发明属于贝类遗传育种的分子标记技术领域，具体涉及一种用于合浦珠母贝微卫星家系鉴定的微卫星标记引物及鉴定方法和应用。

背景技术

合浦珠母贝(Pinctadafucata)亦称"马氏珠母贝"，双壳纲，珍珠贝科，附着生活在水质澄清有珊瑚礁或多沙砾的浅海底，分布于南海，日本亦产，除产珍珠外，肉可食，壳可制纽扣，是中国及世界上海水珍珠培育的主要种类之一，我国华南沿海合浦珠母贝所产珍珠即为举世闻名的“南珠”。

由于在长期的养殖过程中不注重选育种，并且养殖模式陈旧，养殖场地老化，育珠技术落后，致使养殖合浦珠母贝生长缓慢，珍珠质分泌能力下降，育珠能力降低，导致人工养殖珍珠质量和产量都明显下降，珠粒小，珠层薄，色泽差，珍珠养殖效益低下，许多养殖户放弃养殖珍珠而改养其它品种，严重限制了“南珠”养殖产业的发展。因此，尽快开展合浦珠母贝良种选育工作是促进其养殖业稳定、健康发展的必要手段。

在贝类遗传育种研究中，清晰的系谱信息对于家系的选育和亲本的管理至关重要，同时也是明确个体间亲缘关系，建立正确系谱的重要手段。通过亲缘关系鉴定，开展家系分析研究可以阐明繁殖成功率，增殖放流幼体扩散等许多有关遗传学方面和繁殖生态学的科学问题。在合浦珠母贝育种过程中，亲本的数量都不会很多，加之逐代人工繁殖，导致了很多苗种出现了衰退现象。

因此有效的系谱鉴定可以了解育种亲本的育种价值，同时对提高育种效率和生产实践都有重要意义。以微卫星分型为基础的亲子鉴定技术是目前水产动物系谱确认中应用最广泛最可靠的手段之一。已应用到扇贝、太平洋牡蛎、耳鲍、凡纳滨对虾、中国对虾、牙鲆等水产经济动物育种中。

目前，关于将微卫星标记应用于合浦珠母贝家系鉴定研究的报道甚少。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种用于合浦珠母贝微卫星家系鉴定的微卫星标记引物。

本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种利用上述微卫星标记引物进行合浦珠母贝微卫星家系的鉴定方法，该方法易于同时分型检测，可以用于合浦珠母贝的群体遗传结构，遗传育种学评估及亲子鉴定等，同时可大幅度节约实验成本。

本发明所要解决的最后一个技术问题是提供一种利用上述用于合浦珠母贝微卫星家系鉴定的微卫星标记引物在合浦珠母贝家系鉴定中的应用。

本发明所要解决的第一个技术问题是通过以下技术方案来实现的：一种用于合浦珠母贝微卫星家系鉴定的微卫星标记引物，所述微卫星标记引物共有9个引物对，分别为PF-3、PF-4、PF-11、PF-13、PF-16、PF-27、PF-30、PF-44和PF-48，其中：

引物对PF-3的核苷酸序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2中所示；

引物对PF-4的核苷酸序列如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4中所示；

引物对PF-11的核苷酸序列如SEQIDNO：5和SEQIDNO：6中所示；

引物对PF-13的核苷酸序列如SEQIDNO：7和SEQIDNO：8中所示；

引物对PF-16的核苷酸序列如SEQIDNO：9和SEQIDNO：10中所示；

引物对PF-27的核苷酸序列如SEQIDNO：11和SEQIDNO：12中所示；

引物对PF-30的核苷酸序列如SEQIDNO：13和SEQIDNO：14中所示；

引物对PF-44的核苷酸序列如SEQIDNO：15和SEQIDNO：16中所示；

引物对PF-48的核苷酸序列如SEQIDNO：17和SEQIDNO：18中所示。

本发明所要解决的第二个技术问题是通过以下技术方案来实现的：上述合浦珠母贝微卫星家系的鉴定方法，包括以下步骤：

(1)合浦珠母贝亲本及子代DNA提取：选取合浦珠母贝作为亲本进行全同胞家系繁殖，繁殖后选取亲本及子代肌肉组织，采用Magen动物DNA提取试剂盒提取，获得合浦珠母贝亲本及子代的DNA作为模板待用；

(2)微卫星标记引物荧光修饰：选取权利要求1中的9个引物对，分成3组，其中PF-4、PF-11和PF-30为一组，PF-13、PF-27和PF-44为一组，PF-3、PF-16和PF-48为一组，在每组引物的正向引物5’端分别用FAM、HEX和ROX三种不同的荧光基团进行修饰，用于PCR分析；

(3)荧光PCR：采用荧光PCR反应利用步骤(2)中荧光基团修饰过的9个引物对分别对步骤(1)中的亲本及子代的DNA进行PCR扩增，扩增产物按照步骤(2)中分组的方法进行混合，混合物作为上机待测样品；

(4)合浦珠母贝微卫星家系鉴定：将上机待测样品采用基因分析仪进行分析，读取每个样品的基因型，对亲本基因型和子代基因型进行分析，判定子代个体的父母本，获得合浦珠母贝的微卫星家系。

在上述合浦珠母贝微卫星家系的鉴定方法中：

步骤(3)中荧光PCR反应时，20μL反应体系优选包括15.2μL双蒸水，2μL10×PCR缓冲液，浓度为10μm/L的正、反引物各0.6μL，浓度为10mm/L的dNTP0.3μL，浓度为5U/μL的Taq酶0.3μL，1μLDNA模板。

步骤(3)中荧光PCR反应时，优选95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，反应进行30个循环，最后72℃再延伸10min。

步骤(4)中优选采用软件CERVUS3.0软件对亲本基因型和子代基因型进行分析，判定子代个体的父母本。

采用软件CERVUS3.0可计算亲本和子代在各微卫星座位上等位基因频率、杂合度、期望杂合度、多态信息含量、平均排除概率、Hardy-Weinberg平衡及无效等位基因频率等信息，从而判定子代个体的父母本。

进一步的，本发明提供的一种合浦珠母贝微卫星家系的鉴定方法，包括以下步骤：

(1)合浦珠母贝DNA提取

选取健康发育良好的合浦珠母贝作为亲本进行全同胞家系繁殖，剪取亲本及子代闭壳肌组织样品放于无水乙醇中，采用Magen软体动物DNA提取试剂盒来操作，检测质量和浓度后，稀释至100ng/μL，存放于-20℃保存备用；

(2)多态性微卫星标记引物的筛选和引物合成

选取9对微卫星引物，按照片段大小分成3组，其中，引物PF-4，PF-11，PF-30，为一组，引物PF-13，PF-27，PF-44，为一组，引物PF-3，PF-16，PF-48，为一组；在正向引物5’端分别用FAM，HEX，ROX三种不同的荧光基团进行修饰，用于PCR分析；

(3)荧光PCR

采用荧光PCR反应对亲本和子代DNA样品进行PCR扩增，扩增产物按照步骤(2)中所选微卫星引物分组的方法进行混合，作为上机检测的样品；

(3)微卫星位点基因分型以及斑节合浦珠母贝微卫星家系鉴定

样品在ABI3730XL基因分析仪上进行分型，用GS-500作为内参，用GeneMapperV3.2软件读取每个样品的基因型，采用CERVUS3.0软件对亲本基因型和子代基因型进行分析，判定子代个体的父母本。

本发明所要解决的第三个技术问题是通过以下技术方案来实现的：上述用于合浦珠母贝微卫星家系鉴定的微卫星标记引物在合浦珠母贝家系鉴定中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)采用本发明中的引物，首次在合浦珠母贝上利用荧光标记的多态微卫星标记建立了亲子鉴定平台，其鉴定准确率达到了90.24％；

(2)本发明方法能快速、有效地鉴别合浦珠母贝不同家系及来源，为合浦珠母贝的选育，繁殖配组和增殖放流评估提供了依据；

(3)本发明按照微卫星引物扩增片段大小和荧光标记的颜色不同进行组合，将3个微卫星引物分别PCR扩增之后的DNA产物混合在一起上样检测，比普通PCR检测方法提高了3倍效率，同时节约了成本和时间；

(4)本发明选择的微卫星位点等位基因数目较多，多态性高，可以用于合浦珠母贝的群体遗传结构，遗传育种学评估及亲子鉴定等，同时可大幅度节约实验成本。

具体实施方式

以下结合具体实施方法对本发明进行详细说明。

实施例1用于合浦珠母贝微卫星家系鉴定的微卫星标记引物的筛选与合成

通过转录组测序筛选到含有合浦珠母贝微卫星重复序列的unigene，然后从合浦珠母贝转录组文库将其中检测到含有微卫星位点的序列设计微卫星特异性引物，检测其多态性，经过筛选之后最终选择了9对条带清晰，多态性高的引物作为家系鉴定的引物，引物在上海生工生物工程股份有限公司合成。

本发明中选择的微卫星标记引物多态性丰富、片段大小间隔适宜且标记间不连锁，易于同时分型检测，可以用于合浦珠母贝的群体遗传结构，遗传育种学评估及亲子鉴定等，同时可大幅度节约实验成本。

表1用于合浦珠母贝家系鉴定的微卫星引物信息

实施例2合浦珠母贝微卫星家系的鉴定方法

(一)合浦珠母贝亲本及子代DNA提取

(1)合浦珠母贝家系的建立

选取合浦珠母贝四种壳色品系和1个快速生长品系中挑选合浦珠母贝雌雄各12个，进行人工繁殖，雌雄配比1:1，建立12个全同胞家系。剪取每个家系亲本的闭壳肌组织放于无水乙醇中，并做好家系信息记录，于-20℃保存。将12个家系分别放在不同的笼具饲养，待半年之后，从每个家系中随机选取14个贝，取其闭壳肌用无水乙醇固定，作为家系鉴定的样本。

(2)合浦珠母贝亲本和子代基因组DNA的提取

采用Magen软体动物组织DNA提取试剂盒，把20-50mg组织样品处理成尽量小的碎片，并转移至1.5mL离心管中。加入550μLBufferMTL和20μL蛋白酶K，涡旋混匀。55℃振荡温育3h或过夜消化样品。加入5μLRNaseSolution至消化液中，颠倒混匀。室温静置30-60min消化RNA。13000xg离心3min。转移上清液至新的2.0mL离心管中。加入500μLBufferDL至消化液中，涡旋混匀20s,70℃水浴10min。加入500μL无水乙醇至消化液中，涡旋混匀20s。把HipuregDNAMiniColumn装在2mL收集管中。转移混合液至柱子中，10000xg离心1min。倒出流出液，把柱子重新装回收集管中，加入500μLBufferGW1至柱子上，10000xg离心1min。倒出流出液，把柱子重新装回收集管中，加入650μLBufferGW2至柱子上，10000xg离心1min。倒出流出液，把柱子重新装回收集管中，10000xg离心2min。将柱子装在新的1.5mL离心管中。加入30-200μL预热至55℃BufferAE至柱子的膜中央。放置2min，10000xg离心1min。丢弃DNA结合柱，用NanoDropND-1000紫外分光光度计检测DNA浓度和质量，将各DNA样品稀释至100ng/μL，把DNA保存-20℃备用。

(二)微卫星标记引物荧光修饰

选取实施例1中的9个引物对，分成3组，其中PF-4、PF-11和PF-30为一组，PF-13、PF-27和PF-44为一组，PF-3、PF-16和PF-48为一组，在每组引物的正向引物5’端分别用FAM、HEX和ROX三种不同的荧光基团进行修饰，具体如表1中所示，用于PCR分析；

采用荧光PCR反应利用上述荧光基团修饰过的9个引物对分别对上述亲本及子代的DNA进行PCR扩增，扩增产物按照上述分组的方法进行混合，混合物作为上机待测样品。

PCR反应体系为20μL：含有15.2μL双蒸水，2μL10×PCR缓冲液，正、反引物各0.6μL(10μm/L)，dNTP0.3μL(10mm/L)，0.3μLTaq酶(5U/μL)，1μLDNA模板。

扩增反应PCR程序为95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，反应进行30个循环；最后72℃再延伸10min。

(三)微卫星位点基因分型及家系鉴定

(1)微卫星位点基因分型

扩增产物在ABI3730XL基因分析仪上进行分型，用GS-500LIZ作为内参，用GeneMapperV3.2软件读取个体的基因型。

采用软件CERVUS3.0计算亲本和子代在各微卫星座位上等位基因频率、杂合度、期望杂合度、多态信息含量、平均排除概率、Hardy-Weinberg平衡及无效等位基因频率(见表2)。

表29个微卫星位点引物的遗传多样性统计及排除概率

注：k为等位基因数目，Ho为观察杂合度，H_E为期望杂合度，PIC为多态含量，Excl1为双亲未知时排除率，Excl2为已知单亲时排除率，HW为哈迪温伯格平衡检验，ND表示未做检验，***表示偏离极显著，NS表示偏离不显著，F(Null)表示无效等位基因频率。

(2)家系鉴定结果

在模拟分析中(使用CERVUS3.0)，用12对亲本模拟产生10000个子代，在85％和90％的置信区间范围内亲子鉴定成功率均可达到97％。

在实际鉴定的12个家系164个个体中，有16例没有找到真正的父母本。从候选亲本中找到真正父母亲的概率为90.24％，能够满足遗传育种中系谱分析和增殖放流评估的要求。

显然，上述内容只是为了说明本发明的特点，而并非对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员根据本发明在相应的技术领域做出的变化应属于本发明的保护范畴。