基于ITS序列位点的鉴别桃仁与苦杏仁的PCR方法及试剂盒

摘要

本发明公开了一种基于ITS序列位点的鉴别桃仁与苦杏仁的PCR方法及试剂盒。本发明提供了一种鉴别桃仁或苦杏仁的引物，为能扩增出序列表中序列1所示的核苷酸和序列表中序列2所示的核苷酸的扩增产物的引物对。本发明的实验证明，通过引物筛选与条件优化，确定引物G4-7可将桃仁与苦杏仁鉴别开，且其灵敏度高，稳定性好，可用于桃仁与苦杏仁的分子鉴别。相比于传统鉴别，其可信度较高，可用于桃仁药材分子鉴定的推广与应用，且为桃仁药材的快速现场鉴别提供了依据。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于ITS序列位点的鉴别桃仁与苦杏仁 的PCR方法及试剂盒。

背景技术

桃仁为蔷薇科植物桃Prunuspersica(L.)Batsch或山桃P.davidiana(Carr.) Franch.的干燥成熟种子，具有活血祛瘀、润肠通便、止咳平喘的功效。用于经闭痛 经、症瘕痞块、肺痈肠痈、跌扑损伤、肠燥便秘、咳嗽气喘等症的治疗。苦杏仁为蔷 薇科同属植物山杏P.armeniacaL.var.ansuMaxim.、西伯利亚杏P.sibiricaL.、 东北杏P.mandshurica(Maxim)Koehne、或杏P.armeniacaL.的干燥成熟种子。桃 仁与苦杏仁在外观上非常相似，经脱皮、炮制加工后更难区分，但二者功效不同，桃 仁主用于活血化瘀，而苦杏仁为止咳平喘药。由于桃仁货源较少，价钱较贵，市场上 常掺以苦杏仁混充出售。苦杏仁中苦杏仁苷含量较高，苦杏仁苷会释放出含氰的有毒 物质，具有较大毒性，混用容易引起潜在的用药风险。因此，建立一种快速、简易、 准确鉴定桃仁和苦杏仁及其近缘种的分子鉴定体系，对于控制桃仁的药材质量以及用 药安全都具有十分重要的意义。

由于科技的飞速发展，分子鉴定技术逐渐应用于中药鉴定中来。林韵涵等利用DNA 条形码技术，通过序列拼接，数据处理，NJ树构建等方法对药材桃仁及其近缘种进行 ITS2分子鉴定，结果显示桃种内变异位点为6个，山桃为3个，种内平均K2P距离 均为0.009，种间平均K2P距离为0.021，说明桃仁药材的ITS2序列变异小，较为 保守和稳定。桃仁药材的两个基原物种的种内平均K2P距离(0.009)小于其与近缘 种的种间平均遗传距离(0.037)。表明ITS2序列作为DNA条形码可以有效地鉴定药材 桃仁及其近缘种。而特异性PCR技术是一种错配扩增突变分析技术，是根据正品、伪 品药材特定区域的DNA序列，设计有高度特异性的正品鉴别引物，此引物能有效扩增 来自正品药材DNA模板中的特定区域。鉴定样品时，用鉴别引物对所提取样品的DNA 进行PCR扩增经凝胶电泳检测鉴别样品真伪。特异性PCR技术具有以下优势：操作简 单、成本低、重复性好；使用特异性引物可极大地降低PCR假阳性率，保证鉴定的准 确性；对DNA质量要求不高，所需的DNA量少；PCR鉴定条带单一，真伪药材判定标 准简单可靠，无需进行测序及软件分析。特别是近年来快速PCR技术迅速发展，使得 中药材分子鉴定在现场快速鉴定上的应用成为了可能。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种鉴别桃仁或苦杏仁的引物。

本发明提供的引物，能扩增出DNA片段A的引物对；

所述DNA片段A是以桃仁为模板，用序列1和序列2所示引物对进行扩增得到的 产物。

实际应用中，可能因为模板的不同，扩出的产物存在个别碱基或几个碱基的差异， 但这都属于DNA片段A的范畴。

上述引物中，所述引物对由引物1和引物2组成；

所述引物1为如下1)或2)：

1)为序列1所示的单链DNA分子；

2)为序列1删除和/或增加和/或改变一个或几个核苷酸得到的单链DNA分子；

所述引物2为如下3)或4)：

3)为序列2所示的单链DNA分子；

4)为序列2删除和/或增加和/或改变一个或几个核苷酸得到的单链DNA分子。

上述引物中，所述引物1和所述引物2的摩尔比为1:1。

本发明另一个目的是提供一种用于鉴别或辅助鉴别桃仁或苦杏仁的PCR试剂。

本发明提供的PCR试剂，包括上述的引物；

所述引物中每条引物在所述PCR试剂中的终浓度均为0.2μmol·L^-1。

本发明第三个目的是提供一种鉴别或辅助鉴别桃仁或苦杏仁的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括上述的引物或上述的PCR试剂。

上述的引物或上述的PCR试剂或权利要求5所述的试剂盒在如下(A1)或(A2) 中的应用也是本发明保护的范围：

(A1)鉴别或辅助鉴别桃仁或苦杏仁；

(A2)鉴定或辅助鉴定待测样品是桃仁或苦杏仁。

本发明第四个目的是提供一种鉴别或辅助鉴别桃仁或苦杏仁的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：检测待测样品中是否含有DNA片段A；如果 含有，则待测样品为或候选为桃仁；如果不含有，则待测样品为或候选为苦杏仁；

所述DNA片段A是以桃仁为模板，用序列1和序列2所示引物对进行扩增得到的 产物。

上述方法中，所述检测待测样品中是否含有DNA片段A的方法包括如下步骤：用 上述的引物对待测样品进行PCR扩增，得到DNA片段A。

上述方法中，所述DNA片段A的大小为300-350bp。

上述方法中，所述PCR扩增的模板为待测样品的基因组DNA；

所述PCR扩增的退火温度为55℃-63℃。

本发明的实验证明，通过引物筛选与条件优化，确定引物G4-7可将桃仁与苦杏仁 鉴别开，且其灵敏度高，稳定性好，可用于桃仁与苦杏仁的分子鉴别。相比于传统鉴 别，其可信度较高，可用于桃仁药材分子鉴定的推广与应用，且为桃仁药材的快速现 场鉴别提供了依据。

附图说明

图1为桃仁与苦杏仁样品性状图。

图2为桃仁与杏仁ITS2与G4-7的PCR扩增结果。

图3为基于ITS2序列构建的桃仁与杏仁药材的邻接(NJ)树。

图4为DNA模板浓度优化结果。

图5为退火温度考查结果。

图6为不同酶考查结果。

图7为不同PCR仪考查结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

PCR仪(Veriti,GENE)；PCR仪(6325YM00261,EppendorfAG)；微量核酸定量仪 (NO2000C,GENE)；台式离心机(SIGMA)；离心机(SCILOGEXD1008,IKAMS3basic)；漩 涡混匀仪(SCILOGEXMX-E)；电热恒温水浴锅(DK-S220)；高级荧光化学发光系统 (FUSION-SL)；电脑三恒多用电泳仪(DYY-12,北京六一仪器厂)。

植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型DP305-2TIANGEN)；2×EasyTaqPCR SuperMix(TRAN)；2×TaqPCRStarMix(A112GenStar)；ExTaqDNA聚合酶(RR53AM TakaRa)；Phusion超保真PCRMasterMix(M0531,BioLaba)；2KDNAMarker(E110， TRAN)；5KDNAMarker(E110，TRAN)；6×DNALoadingBuffer(D026，TRAN)； 10000×GeneGreenNucleicDye(RT210，TIANFEN)，琼脂糖(G-10，BIOWEST)，其他 试剂均为分析纯。

选取于河北安国药材市场购买，产于西藏、四川阿坝、河北安国、山西荷花池等 地的8份桃仁，4份苦杏仁。实验材料信息见表1，部分样品性状见图1。

表1实验材料

实施例1、鉴别桃仁或苦杏仁的引物设计及合成

取桃仁与苦杏仁约100mg，经粉碎后，采用植物DNA提取试剂盒提取各药材总DNA， 用50μL无菌水溶解。用通用引物ITS2F和ITS3R以高保真酶扩增样品DNA并进行双 向测序。基于ITS2序列，利用MEGA6通过邻接法(NJ)所构建的系统聚类树图(图3) 表明，桃仁与苦杏仁序列分别聚集成枝。表明ITS2序列能把桃仁药材与苦杏仁药材 明显区分开。

将所测得的序列与GenBank中的桃仁与杏仁ITS序列用BioEdit软件进行比对分 析，找出具有稳定差异的特异性片段，筛选获得变异位点，通过该位点运用Premier Primer5.0软件针对桃仁的特异性片段设计多对鉴别引物，设计的特异引物扩增后的 片段大小为333bp,特异性引物G4-6F/G4-7R序列见表2。各引物由睿博兴科生物技术 有限公司合成。

表2引物及PCR反应条件

实施例2、引物在鉴别桃仁或苦杏仁中的应用

一、引物特异性鉴定

提取桃仁和苦杏仁的基因组DNA，稀释20倍，分别加入如下反应体系中进行PCR 扩增，

反应体系为25μL，包括2×EasyTaqPCRSuperMix(TRAN)12.5μL,G4-6F和 G4-7R各0.5μl(0.2μmol·L-1),DNA(终浓度为1ng/μL)1μL,用无菌水补足体 积。

PCR反应条件如表2所示。以用通用引物ITS2F和ITS3R为对照。

结果如图2所示，1-8为表1对应所示的桃仁，9-12为表1对应所示的苦杏仁； 可以看出，桃仁样品扩增呈阳性，条带整齐、清晰明亮，大小333bp，而苦杏仁均呈 阴性，无条带扩增。由此证明该引物具有良好的特异性。

鉴别桃仁和苦杏仁的PCR试剂由2×EasyTaqPCRSuperMix、G4-6F、G4-7R和水 组成。

含有G4-6F和G4-7R或鉴别桃仁和苦杏仁的PCR试剂的试剂盒可用来鉴别桃仁和 苦杏仁。

二、灵敏度检测

将桃仁和苦杏仁的基因组DNA分别进行稀释加入如下反应体系中进行PCR扩增，

反应体系为25μL，包括2×EasyTaqPCRSuperMix(TRAN)12.5μL,G4-6F和 G4-7R各0.5μl(终浓度为0.2μmol·L-1),基因组DNA浓度分别为0.05ng/μL-2 ng/μL(1ng/μL)1μL,用无菌水补足体积。

PCR反应条件见表2。

结果如图4所示，1-8为表1对应所示的桃仁，9-12为表1对应所示的苦杏仁； 可以看出，确定DNA模板浓度为0.05ng/μL-2ng/μL，DNA模板浓度在2ng/μL 时苦杏仁出现假阳性条带，而在0.02ng/μL时桃仁并不能出现清晰、明亮条带，且 其引物二聚体明显增多，灵敏度为0.05ng/μLDNA模板。

三、退火温度的考察

将桃仁和苦杏仁的基因组DNA分别进行稀释加入如下反应体系中进行PCR扩增，

反应体系为25μL，包括2×EasyTaqPCRSuperMix(TRAN)12.5μL,G4-6F和 G4-7R各0.5μl(终浓度为0.2μmol·L^-1),基因组DNA浓度为1ng/μL1μL,用无 菌水补足体积。

在如下不同退火温度的PCR反应条件下反应，与表2基本相同，不同的是退火温 度分别为55℃-63℃。

结果如图5所示，1-8为表1对应所示的桃仁，9-12为表1对应所示的苦杏仁； 退火温度在55℃-63℃时桃仁均出现整齐、清晰条带，而苦杏仁均无条带；表明退火 温度对其无明显影响，建议可将退火温度设为55-63℃。

四、DNA聚合酶的广谱性

将桃仁和苦杏仁的基因组DNA分别进行稀释加入如下反应体系1)和2)中进行 PCR扩增，

1)：反应体系为25μL，包括ExTaqDNA聚合酶(RR53AMTakaRa)12.5μL,G4-6F 和G4-7R各0.5μl(终浓度为0.2μmol·L-1),基因组DNA浓度为1ng/μL1μL, 用无菌水补足体积。

2)：反应体系为25μL，包括2×TaqPCRStarMix(A112GenStar)12.5μL,G4-6F 和G4-7R各0.5μl(终浓度为0.2μmol·L-1),基因组DNA浓度为1ng/μL(终浓 度为1ng/μL)1μL,用无菌水补足体积。

3)：反应体系为25μL，包括2×EasyTaqPCRSuperMix(TRAN)12.5μL,G4-6F 和G4-7R各0.5μl(终浓度为0.2μmol·L-1),基因组DNA浓度为1ng/μL1μL, 用无菌水补足体积。

PCR反应条件见表2。

结果如图6所示，1-8为表1对应所示的桃仁，9-12为表1对应所示的苦杏仁；a 为ExTaqDNA聚合酶，b为2×TaqPCRStarMix，c为2×EasyTaqPCRSuperMix； 可以看出，结果桃仁均出现整齐、明亮清晰的条带，苦杏仁均无条带出现；表明DNA 聚合酶对其无明显影响。

五、PCR仪的广谱性

将桃仁和苦杏仁的基因组DNA分别进行稀释加入如下反应体系中进行PCR扩增，

反应体系为25μL，包括2×EasyTaqPCRSuperMix(TRAN)12.5μL,G4-6F和 G4-7R各0.5μl(终浓度为0.2μmol·L-1),基因组DNA浓度为1ng/μL1μL,用 无菌水补足体积。

PCR反应条件见表2。

PCR扩增选用了三台不同PCR仪器(LifeTechnologies公司，型号Veriti；德 国EppendorfAG22331Hamburg；德国EppendorfMastercyclerpro)及同一仪器多 次实验。

结果如图7所示，1-8为表1对应所示的桃仁，9-12为表1对应所示的苦杏仁； a为EppendorfAGPCR仪(6325YM00261)，b为GENEPCR仪(Veriti)；结果桃仁均 出现整齐、明亮清晰的条带，苦杏仁均无条带出现，表明PCR仪不影响桃仁及苦杏仁 的鉴定。