一种控制高粱芒有无基因SbAn-1以及SNP突变位点和应用

摘要

本发明公开了一种控制高粱有芒无芒基因SbAn-1的功能，属于分子生物学和高粱育种领域，本发明的控制高粱有无基因SbAn-1是通过全基因组关联分析所获得，该技术能够一次性检测到多个核苷酸多态位点，从而有利于大批量地挖掘与简单性状的基因。选择基因以PCR技术为基础，可以直接用于高粱芒的有无基因SbAn-1及其等位基因的鉴别，从而实现分子标记辅助育种。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及保护控制高粱有芒无芒基因SbAn-1和该基 因的应用，属于分子生物学和高粱育种领域。

背景技术

高粱(Sorghumbicolor(L.)Moench)属于单子叶植物纲禾本科高粱属，是一年生 高大草本植物，表皮覆盖蜡质，具典型的C₄植物特化光合作用器官、高光合效率功能和高产 潜力，具有耐旱、耐涝、耐贫瘠、耐盐碱，种植面积在世界粮食作物中占第5位(前4位依次为 玉米、小麦、水稻、大麦)，主要分布在非洲、亚洲、美洲的干旱和半干旱地区，是世界上最古 老的栽培作物之一。高粱的主要产物籽粒除用作食品和饲料外，还可以制酒、制淀粉、制醋、 制饴糖等。因为穗的各项表型特征都有可能影响到高粱籽粒的产量，所以与穗型相关的研 究在高粱各项研究中占很大比例。芒是高粱上的性状之一，并且高粱芒位于小花内稃顶端 中肋延伸而成，位于籽粒最顶部，接受充足的光能和CO₂，并且防止鸟类的侵害，可间接提高 籽粒的收获量。

全基因组关联分析(Genome-wideAssociationStudy，GWAS)是一种对全基因组范 围内的常见遗传变异(单核苷酸多态性和拷贝数)总体关联分析的方法，它能够在全基因组 范围内进行整体研究，能够一次性对疾病进行轮廓性概览，适用于复杂疾病的研究。在全基 因组层面上，开展大样本、反复验证的基因与疾病的关联研究，可以全面揭示疾病发生、发 展与治疗相关的遗传基础。与图位克隆法(map-basedcloning)相比，全基因组关联分析具 有以下几个方面优点：1)GWAS研究不再需要在研究之前构建任何假设；2)可用自然群体，无 需一定是遗传群体，大大缩短了研究年限；3)能够一次性通过监测成千上万个SNPs，对全基 因组范围内整体研究；4)GWAS研究的精度大大提高，例如由玉米的作图精度10-30cM (Salvi，2005)提高到GWAS的精度1500bp(Remington，2001)。随着基因组测序技术的提高及 测序成本的降低，并结合生物信息学的高度发展，GWAS成为挖掘和剖析高粱有无芒基因及 其相关遗传机制最有效的方法之一。

芒是禾本科植物主要性状之一，基因组内发生何种变化导致芒的有无及长短等的 变化呢？早在1898年，就有人对禾谷类作物的芒进行过研究，发现其具有气孔且可以固定 CO₂，相继禾谷类作物中大麦和水稻的芒基因研究则较多。2011年，Hu等精细定位水稻芒相 关基因Awn4.1到第4号染色体一个330kb的区间范围内；2013年，Luo等克隆到基因SbAn-1， 并证实该基因不仅控制水稻芒的有无，还影响水稻籽粒的数量和形状。2015年孙传清教授 课题组发现，控制野生稻长、刺芒的基因LABA1(LONGANDBARBEDAWN1)，位于水稻第4染 色体长臂上，编码一个细胞分裂素激活酶。该基因在芒原基的特异表达提高了芒原基活性 细胞分裂素含量，增强了芒原基细胞分裂活性，最终引起芒的伸长和芒刺形成。高粱芒基因 的精细定位国内外均鲜见报道，在2014年翟国伟等精细定位在第3条染色体115Kb范围内， 但没有克隆到基因。

发明内容

为解决上述现有技术的不足，本发明的首要目的在于提供一种控制高粱芒的有无 基因SbAn-1功能。

本发明的另一目的在于提供上述控制高粱有芒或无芒的SbAn-1基因的检测方法。

本发明的再一目的在于提供上述控制高粱芒的有无基因SbAn-1的应用。

本发明目的是通过如下技术方案来实现的：

本发明公开了一种控制高粱芒的有无基因SbAn-1，以BTx623参考基因组来看，当 无芒时为Sobic.003G417700该基因正常序列，而有芒高粱该基因发生三个位点的突变，第 一个点72367561，T突变为C即TTT(苯丙氨酸)突变为TTC(苯丙氨酸)为同义突变，另外两个 位点发生了非同义突变。非同义突变SNP位点位于高粱基因组3号染色体第72367415位核苷 酸和72367368位核苷酸，该两个位点核苷酸分别由G突变为A，C突变为T，氨基酸分别都由精 氨酸(Arg/R)突变为组氨酸(His/H)和半胱氨酸(Cys/C)，由引物对Sb03g045130F和 Sb03g045130R从高粱基因组DNA中扩增出来的核苷酸序列，经电泳检测测序后，与区分高粱 芒的有无。

所述引物对的核苷酸序列如下所示：

上游引物：Sb03g045130FATGGCATCAAGTTCAACCACACA

下游引物：Sb03g045130RTTAGTCTCTACCATCTTGCTGGTTG

所述的控制高粱芒的有无基因SbAn-1鉴定方法，包含以下步骤：

(1)通过常规PCR法扩增，获得高粱有芒无芒基因SbAn-1基因序列；

(2)利用多序列比对软件工具(如MegAlign或DNAMAN软件)，将步骤(1)所获得的序列翻 译成蛋白质序列后进行比对，得到高粱有芒无芒基因SbAn-1所特异的3处单碱基差异，该差 异位于该基因的外显子，最终导致功能特异性氨基酸的改变；

(3)对步骤(2)所获得的序列在不同的高粱自然群体中进行验证，从而确定高粱芒的有 无基因SbAn-1的功能。经测定有芒样品236份和无芒高粱样品182份，有芒和无芒的基因序 列三个位点发生突变从而区分高粱种质的有芒或无芒，该基因的功能正确率达72％以上。 为了进一步证实该基因SbAn-1为控制芒的有无基因，利用有芒L361和无芒BTx623的F₁表型 为无芒，杂交后代F₂代高粱株系，867株F₂单株中，无芒为654株，有芒213株，卡方检验表明， F₂群体中无芒与有芒单株数量符合3:1分离模型。从F₁单株表型和F₂群体的表型分离情况可 以判定，本研究中双亲芒性受一核质单基因控制，且无芒对有芒为显性。该SbAn-1基因在这 些F₂群体中所有654株的该基因三个突变位点SNP为杂合(TC,AG,CT)或未突变(T,G,C)，213 株有芒样品全部为纯合的(C,A,T)。因此，我们确定该基因SbAn-1即为控制芒的有无的功 能。

进一步的，所述SbAn-1的PCR扩增反应体系如下：

高粱基因组DNA1ul,上下游引物各1ul，2×TaqPCRMasterMix12.5ul,ddH₂O 9.5ul总体积25ul；

反应在BIO-RADT100^TMThermalcyclerPCR仪进行扩增，反应流程如下：94℃预 变性3分种；94℃30秒、55℃30秒、72℃50秒，34个循环；72℃5分种；4℃保存。

所述高粱芒的有无基因SbAn-1的应用，包括对高粱种质资源的筛选和鉴定，以及 作为分子标记辅助育种。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明的控制高粱有无基因SbAn-1是通 过全基因组关联分析所获得，该技术能够一次性检测到多个核苷酸多态位点，从而有利于 大批量地挖掘与简单性状的基因。选择基因以PCR技术为基础，可以直接用于高粱芒的有无 基因SbAn-1及其等位基因的鉴别，从而实现分子标记辅助育种。

附图说明

图1为全基因组关联分析cMLM方法获得高粱芒的有无基因定位的Mahattan图；

图2为全基因组关联分析获得不同分析方法获得的QQ-plot图；

图3为具有该基因功能特异性SNP的高粱芒有无基因SbAn-1的CDS序列比对图；

图4为无芒BTx623与有芒L361高粱基因组SbAn-1氨基酸比对图。

图5为具有该基因功能特异性SNP的高粱芒有无基因SbAn-1的氨基酸比对图；

图6为高粱芒基因SbAn-1分离群体中的测序图。

实施例1

控制高粱芒的有无基因SbAn-1以BTx623参考基因组来看，当无芒时为 Sobic.003G417700该基因正常序列，而有芒高粱该基因发生三个位点的突变，第一个点 72367561，T突变为C即TTT(苯丙氨酸)突变为TTC(苯丙氨酸)为同义突变，另外两个位点发 生了非同义突变。非同义突变SNP位点位于高粱基因组3号染色体第72367415位核苷酸和 72367368位核苷酸，该两个位点核苷酸分别由G突变为A，C突变为T，氨基酸分别都由精氨酸 (Arg/R)突变为组氨酸(His/H)和半胱氨酸(Cys/C)，由引物对Sb03g045130F和 Sb03g045130R从高粱基因组DNA中扩增出来的核苷酸序列，经电泳检测测序后，与区分高粱 芒的有无。

所述引物对的核苷酸序列如下所示：

上游引物：Sb03g045130FATGGCATCAAGTTCAACCACACA

下游引物：Sb03g045130RTTAGTCTCTACCATCTTGCTGGTTG

所述的控制高粱芒的有无基因SbAn-1鉴定方法，包含以下步骤：

(1)通过常规PCR法扩增，获得高粱有芒无芒基因SbAn-1基因序列；

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(2)利用多序列比对软件工具(如MegAlign或DNAMAN软件)，将步骤(1)所获得的序列翻 译成蛋白质序列后进行比对，得到高粱有芒无芒基因SbAn-1所特异的3处单碱基差异，该差 异位于该基因的外显子，最终导致功能特异性氨基酸的改变；

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(3)对步骤(2)所获得的序列在不同的高粱自然群体中进行验证，从而确定高粱芒的有 无基因SbAn-1的功能。经测定有芒样品236份和无芒高粱样品182份，有芒和无芒的基因序 列三个位点发生突变从而区分高粱种质的有芒或无芒，该基因的功能正确率达72％以上。 为了进一步证实该基因SbAn-1为控制芒的有无基因，利用有芒L361和无芒BTx623的F₁表型 为无芒，杂交后代F₂代高粱株系，867株F₂单株中，无芒为654株，有芒213株，卡方检验表明， F₂群体中无芒与有芒单株数量符合3:1分离模型。从F₁单株表型和F₂群体的表型分离情况可 以判定，本研究中双亲芒性受一核质单基因控制，且无芒对有芒为显性。该SbAn-1基因在这 些F₂群体中所有654株的该基因三个突变位点SNP为杂合(TC,AG,CT)或未突变(T,G,C)，213 株有芒样品全部为纯合的(C,A,T)。因此，我们确定该基因SbAn-1即为控制芒的有无的功 能。图4注释:BTx623，9-5，L180为无芒，L361，L007，8-10位有芒。

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BTx623样品序列GenomicSequence911bp第3染色体

>Sobic.003G417700|Chr03:72367285..72368195reverse蓝色区域为CDS区

ATGTTGCGGTATTGGTAAGAAGACCGATTTATATACATATAATGATTAAAAAAATATAATGTGAATATTTCCC TCAGCAACTAAAA

TATATAATTTGGATATATATACAGAGGGACAAAAGACTGATATTTTCCCGACAAGCTGTATATTTAACAATTA GAAAGACGAATAA

AATGTAGGGCCACAATTTTTTGTTTTATATTTATGGAATCATTAACATGTATGGTATGGTGTGGTGGACAACT TCAGTTGCCCTAC

CTCTTGACATAACATGGTACACTTTTTTTGAGAGAACCAAGAAAGTTCAAGGAACAAGTCAAAAAAGCCTTTG TGTGTCTCTATGC

GTAAACAAGGCTTACCTTCACTTCAAAACAGTCGGAATTGAAGATAGCTTTGTGTCCTAAGCATGAGGCTATA TAGCCTGTGGAGG

TTTTGCCCAATCAAGACAGCCTCAACCCCAAAGCCACTCTATGGCATCAAGTTCAACCACACAGGATGCCAAC AATGGTGTTAGGC

ATGACAACAACCTCCTGCCCATTGCCAACGTTGGGCGGATCATGAAGGATGCCCTCCCTCCACAGGCCAAGAT TTCAAAGCATGCT

AAGGAGACCATCCAGGAGTGTGCAACTGAGTTTGTGGGCTTCGTCACTGGCGAGGCCTCCGAGCGGTGCCGCC GAGAGCGGCGGAA

GACCATCAACGGTGATGACATCTGTCATGCTATGAGGAGCCTTGGCCTCGACCACTACGCCGACTCCATGCAC AGGTACCTGCAGA

GGTATCGCGAGACTGAGGAGCTAGCGGCAACACTCAACAACGGCGGCGGCGGCCGTGATGGACGGGCCATTCA GATTGATGTGAGG

GCTGAGCTGTCCATTTTCAAGGGCAGCAACCAGCAAGATGGTAGAGACTAA

上游引物：Sb03g045130FATGGCATCAAGTTCAACCACACA退火温度69.8

下游引物：Sb03g045130RTTAGTCTCTACCATCTTGCTGGTTG退火温度67.4

所述SbAn-1的PCR扩增反应体系如下：高粱基因组DNA1ul,上下游引物各1ul，2×Taq PCRMasterMix12.5ul,ddH2O9.5ul总体积25ul；反应在BIO-RADT100TMThermal cyclerPCR仪进行扩增，反应流程如下：94℃预变性3分种；94℃30秒、55℃30秒、72℃50秒， 34个循环；72℃5分种；4℃保存。