转SmMYB75基因提高丹参毛状根中丹酚酸含量的方法

摘要

本发明公开了一种转SmMYB75基因提高丹参毛状根中丹酚酸含量的方法，通过基因克隆的方法从丹参中克隆得到了645bp的SmMYB75基因，构建了SmMYB75基因原核表达和亚细胞定位的载体；构建了植物高效表达载体，遗传转化丹参叶片获得了SmMYB75基因过表达的丹参毛状根，并通过一系列的生物技术的手段筛选得到了丹酚酸含量明显提高的转SmMYB75基因的丹参毛状根。本发明的方法为生产具有重要临床需求的丹酚酸提供了一种新型优质原料，对缓解丹酚酸药源的紧缺性问题具有积极的促进意义和应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术，特别涉及一种转SmMYB75基因提高丹参毛状根中丹酚酸含量的方法。

背景技术

心脑血管疾病是目前威胁全人类健康与生命的“头号杀手”。据统计，全世界每年大约有1700万人死于心脑血管疾病，约占全球总死亡人数的1/3，我国每年大约有300万人死于心脑血管疾病，因此，积极研究高效、低毒和廉价的治疗心脑血管疾病的临床药物对提高人类健康水平具有十分深远的意义。

丹参(Salviamiltiorrhiza)，为唇形科(Labiatae)鼠尾草属多年生草本植株，以其干燥的根或块茎入药，被广泛地应用于治疗心脑血管疾病，是一种传统的中草药植株。丹参的生物活性成分主要分为两大类：一类为水溶性的酚酸类化合物，主要包括丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C、咖啡酸、迷迭香素、丹参素等；另一类为脂溶性的丹参酮类化合物，主要包括丹参酮I、丹参酮IIA、隐丹参酮、二氢丹参酮等。

丹参中的丹酚酸在预防人类疾病方面发挥着重要的作用，其生物学活性主要包括抗氧化、抗凝活性、肾脏功能的调节、肝脏的保护、心血管的保护、抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎症等。除此之外，丹酚酸还具有抗缺血再灌注、抗血栓、降血压和抗纤维化的作用。在中国，丹参通常被制作为药剂，如片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂、口服液、喷雾、滴丸等，具有极高的药用和经济价值。然而，在传统的栽培模式下，丹参长期栽培时品质退化严重、活性成分含量降低、生长周期长及易受栽培区域和环境等制约；在化学合成过程中，丹酚酸的化学合成过程十分繁琐，成本较高且易造成环境污染；在离体条件下通过细胞培养方法获得的细胞，其药用活性成分积累量很低而且稳定性很差，远达不到商业化开发利用的要求。因此，为了缓解具有重要临床需求的丹酚酸药源的紧缺性问题，亟待发明一种提高丹酚酸含量的新方法，代谢工程的迅速发展与毛状根培养技术的日益成熟为提高丹参毛状根中丹酚酸成分的含量，解决丹参酮药源紧缺性问题提供了一条新思路。

已有研究表明，植物中的R2R3-MYB转录因子广泛参与到植物的次生代谢过程，因此挖掘丹参自身的R2R3-MYB转录因子来提高丹酚酸的含量具有重大的意义。利用基因工程手段，将丹参转录因子SmMYB75基因遗传转化丹参叶片获得SmMYB75过表达的转基因丹参毛状根，同时上调丹酚酸的生物合成，获得丹酚酸高产的丹参毛状根根系，为商业化生产丹酚酸提供新型优质药源。目前尚未发现通过SmMYB75基因过表达策略提高丹参毛状根中丹酚酸含量的相关报道。

发明内容

本发明的目的，就是为了克服上述现有技术存在的缺陷，提供一种转SmMYB75基因来提高丹参毛状根中丹酚酸含量的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明从丹参中克隆得到645bp的SmMYB75基因，构建原核表达的载体，在大肠杆菌中表达SmMYB75基因重组蛋白；定量PCR分析其在不同组织和甲基茉莉酸诱导后的基因的表达量；构建亚细胞定位的载体，瞬时转化烟草叶片，激光共聚焦显微镜观察定量SmMYB75基因在细胞中的定位情况；构建植物表达载体，发根农杆菌C58C1介导遗传转化丹参叶片获得转基因的毛状根；PCR检测目的基因SmMYB75的整合情况；定量PCR分析插入基因SmMYB75及丹酚酸生物合成相关基因在毛状根中的表达情况；高效液相色谱测定转基因毛状根中丹酚酸的含量。

一种转SmMYB75基因提高丹参毛状根中丹酚酸含量的方法，包括以下步骤：

(1)采用基因克隆方法从丹参中克隆获得基因SmMYB75，所述的SmMYB75基因序列如SEQID:1所示，对其进行序列分析。

(2)根据丹参SmMYB75基因序列，把SmMYB75基因可操作性地构建于原核表达的载体，在大肠杆菌中进行表达，重组蛋白进行SDS-PAGE电泳检测；所述的载体为pET-30a(+)，大肠杆菌为菌株Rosetta(DE3)。

(3)根据丹参SmMYB75基因序列，设计定量PCR的引物，对SmMYB75在丹参的不同组织中的表达量及其对甲基茉莉酸调控的诱导表达进行分析。

(4)将SmMYB75基因构建于亚细胞定位的载体，转化根瘤农杆菌，进行烟草叶片的瞬时转化，对SmMYB75基因进行亚细胞定位分析；所述的载体为pMON530，根瘤农杆菌为菌株Ase。

(5)把SmMYB75基因可操作性地构建于表达调控序列，形成含SmMYB75基因的植物表达载体；植物表达载体为经过改造获得的pCAMBIA2300⁺载体，包含CaMV35S启动子和终止子、多克隆位点、复制起始点及卡那霉素抗性位点。

(6)将步骤(5)所得的含SmMYB75基因的植物表达载体转化发根农杆菌C58C1，获得用于转化丹参的含SmMYB75基因植物表达载体的发根农杆菌菌株。

(7)利用步骤(6)所构建的发根农杆菌菌株遗传转化丹参叶片，获得经PCR检测为阳性的转基因毛状根克隆；所述的经PCR检测的阳性转基因丹参毛状根是指：设计发根位点基因BrolB的上下游引物和在插入基因SmMYB75内部及NOS终止子内部设计上游及下游特异性引物，进行DNA扩增，紫外线下观察到目的条带的根系即为阳性转基因丹参毛状根根系。

(8)定量PCR测定步骤(7)获得的丹参转基因毛状根中SmMYB75基因及丹酚酸生物合成途径相关基因的相对表达量，并筛选出过表达SmMYB75基因根系中SmMYB75基因的表达量提高的根系；具体方法为：对PCR鉴定为阳性的毛状根克隆进行总RNA的提取，统一定量到0.5μgRNA，反转录成25μl体系的cDNA，分别设计插入目的基因及看家基因SmActin的定量引物，以相同量的cDNA为模板进行定量PCR分析SmMYB75及丹酚酸生物合成相关基因的相对表达量情况。

(9)高效液相色谱法测定步骤(8)中丹参转SmMYB75基因毛状根中丹酚酸的含量，筛选丹酚酸含量显著提高的丹参转基因毛状根根系；所述的方法为：色谱柱C-18反相硅胶柱，流动相为体积比30：70的乙腈和水，并用磷酸调节pH至2.03；检测波长281nm，柱温35℃，流速1ml/min，进样量20μl。

本发明综合应用生物学和基因技术方法如载体构建、遗传转化、分子检测、定量PCR分析、丹酚酸的提取及含量测定等，发明了一种利用丹参的R2R3-MYB转录因子SmMYB75基因提高丹参毛状根中丹酚酸的方法。本发明获得的过表达SmMYB75转基因丹参毛状根根系中最高表达量为总丹酚酸含量为167.25mg/g干重，是对照组(73.7mg/g干重)的2.26倍。本发明为商业化大量生产丹酚酸及降低药品价格提供了可能，也为大量生产丹酚酸临床药物的大量需求提供了重要来源。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、显著提高丹参毛状根中丹酚酸的含量。

2、发明方法效果可靠。

3、获取丹酚酸的成本低。

4、生产过程无环境污染。

附图说明

图1为pCAMBIA2300⁺::SmMYB75载体构建示意图。

图2为重组蛋白SmMYB75的SDS-PAGE分析。

图3为丹参SmMYB75的组织表达分析。

图4为丹参SmMYB75在甲基茉莉酸处理下的表达分析。其中，Control为乙醇对照组诱导，MJ为甲基茉莉酸诱导。

图5为SmMYB75的亚细胞定位的分析结果图。GFP，绿色荧光蛋白；Bright，明场；Merged，绿色荧光蛋白与明场的合并图；pMON530::GFP，空载体荧光表达；pMON530::SmMYB75-GFP，SmMYB75的瞬时荧光表达。

图6为SmMYB75在转基因丹参毛状根中的表达分析结果图。其中，Control为C58C1侵染获得的毛状根。

图7为丹酚酸生物合成相关基因的表达分析结果图。其中，Emptyvector是空载体。

图8为SmMYB75转基因丹参毛状根中丹酚酸的含量检测结果图。其中，Emptyvector是空载体。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。图1为pCAMBIA2300⁺::SmMYB75载体构建示意图。图2为重组蛋白SmMYB75的SDS-PAGE分析。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆(Sambrook等)中所述的条件，或按照制造厂商所提供的试剂或试剂盒所附带的说明书建议的条件。

实施例1

丹参SmMYB75基因的克隆

1.1.丹参总RNA的提取

取少量丹参幼嫩叶片，用液氮速冻后，迅速用研钵研碎，然后按照TIANGEN公司提供的RNAprepPurePlantKit使用说明书提取总RNA。用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：胶浓度1.2％；0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15min)检测RNA的完整性。用NanoDrop2000c超微量分光光度计检测其纯度和浓度。

1.2.丹参SmMYB75基因的克隆

以所获的0.5μg丹参总RNA为起始量，用反转录酶XL(AMV)进行第一链cDNA的合成(操作步骤参照Promega公司提供的相关说明书)。根据所述SmMYB75基因的编码序列(SEQIDNO.1)，设计扩增出完整编码框的上下游引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建载体。以所述的第一链cDNA为模板，经PCR扩增后进行测序。DNA序列测定由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。测序结果见SEQNO.1。

实施例2

丹参SmMYB75基因的原核表达分析

2.1.pET-30a(+)::SmMYB75载体的构建

根据已经克隆获得的丹参SmMYB75的ORF序列，设计亚细胞定位载体构建的引物，构建pET-30a(+)::SmMYB75，并将pET-30a(+)::SmMYB75质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)，挑取单克隆菌落进行PCR验证。结果表明，含有SmMYB75的亚细胞定位载体pET-30a(+)::SmMYB75已经成功转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中，可以用于后续的烟草瞬时表达实验。

2.2.SmMYB75重组蛋白的SDS-PAGE分析

将构建成功的含有pET-30a(+)::SmMYB75的大肠杆菌Rosetta(DE3)接种于含有卡那霉素(75mg/mL)的LB培养基中，培养2-3小时(OD₆₀₀＝0.4-0.5)。加入0.5毫摩尔的IPTG诱导剂诱导表达，分别在0小时、0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时收集菌液，12000转/分钟，离心1分钟收获菌体，加入蛋白上样缓冲液，沸水煮沸10分钟，进行SDS-PAGE电泳分析。结果显示，表达蛋白的大小约为30KD，从SDS-PAGE电泳图可以看到，在IPTG诱导后，在30KD处与未诱导时相比有明显的的目的条带，说明SmMYB75在此表达体系中成功表达，且随着诱导时间的增长其诱导表达量明显提高。

实施例3

丹参SmMYB75的组织表达谱分析

为了研究SmMYB75的组织表达模式，分别提取丹参两年生的主根、须根、茎、叶、叶柄、花瓣、花萼、花丝八个组织的总RNA，并分别进行纯度和浓度检测。然后反转录成cDNA，用于定量PCR分析SmMYB75的组织表达谱，反应体系用TIANGEN公司提供的SuperRealPreMix(SYBRGreen)试剂盒，用SmActin作为内参基因。定量PCR引物为：

结果显示，SmMYB75在所检测的所有组织中，在茎、叶和叶柄中表达较强，其次在花丝和主根中表达较高，在须根、花瓣、花萼中表达较弱(见图3)。

实施例4

丹参SmMYB75对甲基茉莉酸处理的响应分析

为了验证SmMYB75是否响应甲基茉莉酸的诱导，对在摇瓶中培养了60左右大小的丹参毛状根进行甲基茉莉酸处理，提取经处理不同时间后的丹参毛状根的总RNA，并分别进行纯度和浓度检测，然后反转录成cDNA，用于定量PCR分析SmMYB75的组织表达谱，定量引物同实施例3，定量PCR结果显示，在一定的时间范围内，随着甲基茉莉酸的诱导，SmMYB75的表达量明显上调，在4h时达到最高值，随后表达量下降(见图4)。

实施例5

丹参SmMYB75基因的亚细胞定位分析

5.1.pMON530::MYB75载体的构建

根据已经克隆获得的丹参SmMYB75的ORF序列，设计亚细胞定位载体构建的引物，构建pMON530::SmMYB75，并将pMON530::SmMYB75质粒转化农杆菌Ase，挑取单克隆菌落进行PCR验证。结果表明，含有SmMYB75的亚细胞定位载体pMON530::SmMYB75已经成功转化到农杆菌Ase中，可以用于后续的烟草瞬时表达实验。

5.2.在烟草中的瞬时表达

用无菌注射器吸取构建好的含有载体pMON530::SmMYB75和空载体的pMON530的工程菌Ase对生长良好的烟草叶片进行瞬时转化，光照培养，40-48小时后取叶片于载玻片上，背面朝上，用双蒸水浸润，用盖玻片固定叶片(避免产生气泡)，于激光共聚焦显微镜下观察。结果显示，SmMYB75在细胞核中表达，与它们作为转录因子的功能是一致的(见图5)。

实施例6

含丹参SmMYB75基因的植物过表达载体的构建

载体构建模式图见图1。以pCAMBIA2300⁺为表达载体，将克隆得到的SmMYB75基因替换pCAMBIA2300⁺上的gus基因。具体地，SpeI/BstPI双酶切pMD18-T::SmMYB75和pCAMBIA2300⁺；回收SmMYB75基因和pCAMBIA2300⁺大片段；连接转化，挑取单克隆菌落PCR筛选阳性克隆；提取质粒进一步酶切验证。结果表明，SmMYB75基因已被成功构建到植物表达载体pCAMBIA2300⁺中，从而获得含SmMYB75基因的植物过表达载体pCAMBIA2300⁺::SmMYB75。

本实施例将转录因子SmMYB75基因可操作性地连接于表达调控序列，形成含SmMYB75基因的植物过表达载体pCAMBIA2300⁺::SmMYB75，该表达载体可用于通过代谢工程策略来提高丹参中丹酚酸的含量。

本实施例中以pCAMBIA2300⁺为中间表达载体是一种优选实施方式，在实际构建载体的过程中，可以根据具体情况选择其他合适载体，在选用不同的载体时，引入限制性内切酶位点不同。

实施例7

发根农杆菌介导的丹参SmMYB75基因遗传转化丹参获得转基因丹参毛状根

7.1.含植物表达载体的发根农杆菌工程菌的获得

将实施例2中含SmMYB75基因的植物过表达载体pCAMBIA2300⁺::SmMYB75转入发根农杆菌C58C1中，挑取单克隆菌落进行PCR验证。结果表明，含SmMYB75基因的植物过表达载体pCAMBIA2300⁺::SmMYB75已经成功转化到发根农杆菌C58C1中。

7.2.发根农杆菌介导SmMYB75基因遗传转化丹参

7.2.1外植体的预培养

剪取丹参健壮无菌苗叶片(0.5cm²)，接种到预培养培养基(1/2MS)上，25℃暗培养2天。

7.2.2农杆菌与外植体的共培养

将上述预培养的丹参叶片外植体，放入含活化好的上述发根农杆菌工程菌的1/2MS悬液中浸泡10分钟(轻轻摇晃是外植体与菌液充分接触)后，取出浸染后的丹参叶片用无菌吸水纸吸干表面菌液，转到共培养培养基1/2MS中，暗培养2-3天。

7.2.3毛状根的诱导和继代培养

将上述的共培养2-3天的丹参外植体转接到除菌固体培养基(1/2MS+Cb300mg/L)中，25℃暗培养2-3周左右，可从外植体伤口处长出毛状根。将已经发根的丹参外植体转接到除菌固体培养基(1/2MS+Cb200mg/L)上，25℃暗培养2周待毛状根长至3cm以上时剪取单克隆毛状根作为一个无性系，继续接种于除菌培养基(1/2MS+Cb100mg/L)中暗培养两周，直至无溢菌现象。将单克隆毛状根转接到无抗生素的1/2MS培养基上继续暗培养。

7.3.转基因丹参毛状根的PCR检测

7.3.1转基因毛状根基因组DNA的提取

采用CTAB法提取转基因毛状根基因组DNA。剪取3.2.3中除菌完毕的转基因毛状根5cm左右放入1.5mL离心管中，加入600μLCTAB裂解液(65℃预热，含1％β-巯基乙醇)，用组织研磨仪充分研磨。置于65℃水浴锅中40-50分钟，其间多次混匀样品(次/15min)，冷却至室温后加入等体积的苯酚/氯仿(1:1)，轻轻颠倒混匀乳化10min，1200rpm离心15min，小心吸取上清于新EP管中，加入等体积的氯仿混匀，12000rpm离心15min，缓慢吸取上清于新EP管中，加2倍体积预冷的无水乙醇(于-20℃放30min)，析出沉淀，12000rpm离心15min，弃上清，加入75％乙醇洗涤两次，吸出上清，室温晾干，加入30-50μL水溶解沉淀，用RNA酶处理后于-80℃超低温冰箱冻存，备用。

7.3.2引物设计及PCR检测

在pCAMBIA2300⁺::SmMYB75载体的插入基因(SmMYB75)及NOS终止子上分别设计特异性上游及下游引物，同时在发根位点基因BrolB上设计特异性上下游引物。同时用PCR方法对上述毛状根的总DNA进行分子检测。结果表明，转基因毛状根根系中检测到和阳性对照(pCAMBIA2300⁺::SmMYB75质粒为模板)大小相当的PCR产物；而以农杆菌C58C1空菌侵染丹参所得的毛状根的基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段，结果说明SmMYB75基因已经整合到丹参基因组中。

本实施例将所述的植物表达载体转化发根农杆菌，获得用于转化丹参的植物表达载体的发根农杆菌菌株C58C1，利用所构建的发根农杆菌菌株遗传转化丹参叶片，获得经PCR检测为阳性克隆的转基因毛状根。转基因丹参毛状根的获得为筛选高产丹酚酸的毛状根提供了直接素材。

本实施例中选择发根农杆菌C58C1是一种优选实施方式，在实际选择上，发根农杆菌的菌株不限于C58C1，可以根据具体情况选择其他菌株。

实施例8

定量PCR检测转基因丹参毛状根中相关基因的表达

8.1.毛状根液体培养

选择实施例7中生长快、分枝好的毛状根，在超净工作台上剪取2-3cm用无菌蒸馏水冲洗掉其表面上的琼脂后接入装有100mL的1/2MS液体培养基继代一次，60天后收获，取适量新鲜毛状根用吸水纸吸干表面水分后，用锡箔纸包装好进入液氮中冷冻后保存于-80℃用于RNA提取，其余毛状根烘干后用于丹参酮丹酚酸含量的提取。

8.2.RNA的提取及cDNA第一链的合成

方法同实施例1中的步骤1.1

8.3引物的设计和合成

根据丹参基因SmMYB75及丹参酮与丹酚酸生物合成相关基因的编码序列分别用Primer5.0设计引物用于检测丹参毛状根中相关基因的表达情况，看家基因Actin用来作为内参。所用引物由上海生工生物工程公司合成。

定量PCR的引物如下：

8.4.转基因丹参毛状根的定量PCR检测

以相同量的上述cDNA(稀释10倍)第一链为模板，分别用上述设计的引物进行定量PCR扩增。参照美国AppliedBiosystem公司生产的BiosystemStepOne仪器的说明书进行定量PCR操作，采用全式金公司的定量PCR试剂盒。定量PCR反应体系如下：

PCR反应条件：94℃5分钟，40个循环(94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒),72℃10分钟。目的基因及看家基因各做三次重复。

定量PCR结果显示：相比空载体根系，SmMYB75基因在过表达根系中的表达量明显提高，但不同克隆之间的表达量有一定的差异,其中表达量较高的为克隆9、14、18、19、23号(见图6)。与此同时，SmMYB75在丹参毛状根中过表达后，丹酚酸代谢途径中的关键酶基因的表达量均明显提高，说明SmMYB75能促进丹酚酸生物合成途径中相关基因的表达(见图7)。

据文献报道，MYB转录因子可通过结合下游靶基因启动子上的顺式作用元件来调控下游靶基因的表达。对丹酚酸合成途径中的关键酶基因启动子进行分析，发现受SmMYB75响应的基因启动子上含有MYB的顺式作用元件，因此推测SmMYB75通过结合启动子上的顺式作用元件来调控关键酶基因的表达，从而调控丹酚酸的合成。

实施例9

利用HPLC测定转基因丹参毛状根中丹酚酸含量

9.1.毛状根中丹酚酸含量的提取

将实施例4收获的毛状根烘干至恒重，研磨成粉末，准确称取0.1g毛状根粉末于50mL离心管中，加入10mL乙醇：水(4：1，v/v)，超声20min，8000rpm，离心10min，吸取上清萃取液于旋转蒸发仪中70℃真空干燥，残余物重新用2mL的双蒸水溶解，将样品用0.22μm的滤膜过滤后待测。

9.2.毛状根中丹酚酸含量的HPLC测定

精密称取丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸和咖啡酸标准品用甲醇分别配置成浓度为1mM的标准品贮备液，保存于-20℃备用。

色谱条件：色谱柱为C-18反相硅胶柱，流动相为乙腈：水(30：70)，水用磷酸调节PH为2.03，检测波长281nm，柱温35℃，流速1mL/min。

将上述标准品贮备液分别取5μl，10μl，20μl，30μl，40μl在相应色谱条件下进样，四种水溶性成分完全分离，且峰型良好，记录图谱及色谱参数，分别以峰面积(Y)对标准品浓度(X，mg/mL)进行回归分析。

上述0.22μm滤膜过滤后的丹酚酸粗提物各取10μL，用高效液相色谱仪检测，记录各组分峰面积，代入线性回归方程，计算即得样品水溶性成分的含量。

在本发明中，除咖啡酸的含量无明显的上下调关系外，相对于对照组，迷迭香酸、丹酚酸A、丹酚酸B三种丹酚酸的含量明显上调，总丹酚酸的含量也明显提高。其中，表达量最高的转基因毛状根中丹酚酸的含量(167.25)为对照组(73.7)的2.26倍(见图8)。

本发明采用转SmMYB75基因的代谢工程策略获得了高产丹酚酸的丹参转基因毛状根根系，为大量生产丹酚酸、缓解丹酚酸药源紧缺问题提供了一种新型有效方法。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。