Enterobacter cloacae制备生物纳米单质硒的方法及应用

摘要

本发明公开了Enterobacter？cloacae制备生物纳米单质硒的方法及应用。一种Enterobacter？cloacae制备生物纳米单质硒的方法，以亚硒酸盐为原料，以Enterobacter？cloacae？Z0206为发酵菌，发酵生产生物纳米单质硒；包括以下步骤：（1）活化的Enterobacter？cloacae？接种于发酵培养基中，加入亚硒酸钠溶液；（2）振荡培养；（3）收集发酵液处理得到生物纳米单质硒或者生物纳米单质硒-多糖复合物。本发明对于制备的各种参数和条件等做了优化，克服了产品潜在的缺陷和生产的不确定性，易于大规模的应用和生产。本发明制备的生物纳米单质硒或者复合物添加至猪饲料中替代亚硒酸钠，达到促进生长，改善抗氧化功能和免疫功能的效果。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物应用、纳米单质硒合成及生物饲料添加剂领域，具体地，涉及利 用细菌合成生物纳米单质硒及其在猪上的应用。

背景技术

硒是人和动物所必需的一种微量元素，对机体健康至关重要。缺硒会影响人体神 经系统、生殖系统、免疫系统和心血管系统功能，而畜禽动物缺硒则表现为生殖系统功能障 碍，繁殖性能下降，生长抑制，肌肉病变（白肌病，心肌和骨骼肌病）等。人和动物通过食物链 从土壤中获得硒以维持机体对硒的需求，而我国72%的土壤缺硒（≤0.6mg/kg），平均有1亿 左右的人口因为硒摄取量不足而存在健康风险。目前公认的最安全、有效的补硒产品是硒 代蛋氨酸，而单质硒被认为是既没有活性也没有毒性的生物惰性硒形式。不过近年来研究 表明，与硒代蛋氨酸相比，纳米尺寸单质硒具有相当的生物活性和更低的毒性。

纳米硒的制备大部分是利用抗坏血酸、硫代硫酸钠、亚硫酸钠和肼等还原剂，还原 二氧化硒、亚硒酸盐或硒酸盐来制得纳米硒。所得纳米硒易转变成灰黑色的具有毒性的单 质硒，一般需要加入表面活性剂或稳定剂才可维持理化性质。而且制备过程容易引入毒性 物质，危害生态环境。而已有研究表明，细菌可将硒氧化物还原为生物纳米单质硒，相对于 化学合成的纳米硒，这种由细菌合成的生物纳米单质硒形状规则，粒径均匀，稳定性强，此 外，细菌发酵不受季节、气候影响，生产能力强，生产周期短。所以，利用细菌制备生物纳米 单质硒可能是未来制备纳米硒的一种安全、高效的的方法。

CN104774875所公开的利用水生拉恩氏菌制备生物纳米硒的方法中，所涉及的菌 种分离自土壤，对葡萄根癌病具有防治作用，但将其转化得到的生物纳米单质硒直接应用 于人或动物，可能存在一定的风险。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供一种Enterobactercloacae制备生物纳米 单质硒的方法及应用。

Enterobactercloacae制备生物纳米单质硒的方法，以亚硒酸盐为原料，以 EnterobactercloacaeZ0206为发酵菌，发酵生产生物纳米单质硒；

包括以下步骤：

（1）活化的Enterobactercloacae接种于发酵培养基中，加入亚硒酸钠溶液；

（2）振荡培养；

（3a）收集发酵液，离心后保留上清，将上清再次离心，沉淀以双蒸水重悬后超声处理， 向液体中加入正己烷，混匀后静置分层，生物纳米单质硒存在于下层红色水相中；其中，第 一次离心条件为4℃，5000×g，15分钟，第二次离心条件为4℃，25000×g，15分钟，超声处理 条件为25W，5sON/5sOFF，15分钟，正己烷加入量为液体体积的二分之一；或者（3b）收集 发酵液，离心后保留上清，向上清中加入预冷无水乙醇，即为生物纳米单质硒-多糖复合物； 其中，离心条件为5000×g，15分钟，无水乙醇加入量为上清液体积的3倍。

（1）中，发酵培养基成分为蔗糖25g/l，酵母提取物5g/l，胰蛋白胨5g/l，三水合磷 酸氢二钾2.62g/l，磷酸二氢钾1g/l，硫酸镁0.5g/l；初始pH=7.5。

所述步骤（1）中，培养基中亚硒酸钠终浓度为10mM。

所述步骤（2）中，培养温度为32℃，转速为250rpm，培养时间为144小时。

一种所述的方法得到的生物纳米单质硒的应用，作为猪饲料的添加剂，用来替代 亚硒酸钠。

本发明公开了利用E.cloacaeZ0206制备生物纳米单质硒及其多糖复合物的方 法，对于制备的各种参数和条件等做了优化，克服了产品潜在的缺陷和生产的不确定性，易 于大规模的应用和生产。

本发明制备的生物纳米单质硒或者复合物添加至猪饲料中替代亚硒酸钠，达到促 进生长，改善抗氧化功能和免疫功能的效果。

附图说明

图1不同浓度亚硒酸钠对E.cloacaeZ0206生长的影响；

图2不同浓度亚硒酸钠条件下E.cloacaeZ0206发酵液亚硒酸钠残留量变化；

图3不同亚硒酸钠浓度条件下E.cloacaeZ0206对亚硒酸钠的平均消耗速率；

图4E.cloacaeZ0206与生物纳米单质硒场发射扫描电镜及能谱分析。分为A-E部分， 其中，A、场发射扫描电镜照片；B、碳元素分布图与硒元素分布图合并；C、碳元素分布图；D、 硒元素分布图；E、能谱分析图；

图5E.cloacaeZ0206与生物纳米单质硒透射电镜与能谱分析。分为A-E部分，其中， A、透射电镜照片，B、颗粒1能谱分析结果；C、颗粒2能谱分析结果；D、颗粒3能谱分析结果；E、 颗粒4能谱分析结果；

图6纯化生物纳米单质硒透射电镜；

图7纯化生物纳米单质硒粒径分析。

具体实施方式

实施例1不同浓度亚硒酸钠对E.cloacaeZ0206菌株生长及亚硒酸钠还原效率 的影响

1.培养基配制

LB液体培养基：NaCl10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，去离子水1L，121℃高温灭菌 20min。

LB平板培养基：NaCl10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，琼脂15g，去离子水1L，121 ℃高温灭菌20min。

发酵培养基：蔗糖25g，胰蛋白胨5g，酵母提取物5g，K₂HPO₄·3H₂O2.62g，KH₂PO₄1g，MgSO₄0.5g，去离子水1L，初始pH为7.5，115℃高温灭菌30min。

菌种活化

将冻存于-80℃的E.cloacaeZ0206菌种常温解冻，取一环在LB平板培养基划线，于32 ℃培养24h。

从平板培养基挑取单菌落接种于LB液体培养基中，于32℃，250rpm培养18h作为种 子液。

接种与发酵

将活化的E.cloacaeZ0206菌液以PBS稀释至OD₆₀₀=0.5，以1%接种量接种至含0mM， 0.5mM，1mM，5mM，10mM，15mM亚硒酸钠的发酵培养基中，每个浓度梯度三个重复。于32℃， 250rpm培养。并在培养的第4h，8h，12h，16h，20h，24h，36h，48h，72h和96h采集菌液样品，检 测菌体蛋白质含量，用于表征细菌数；在培养的第0h，12h，24h，36h，48h，72h，96h，120h， 144h，168h采集样品，检测亚硒酸钠残留量。

结果

亚硒酸钠对E.cloacaeZ0206生长的影响如图1所示，无亚硒酸钠的对照组在培养的 第12小时即达到平台期，而添加亚硒酸钠导致E.cloacaeZ0206生长速度显著降低，且抑 制作用随着亚硒酸钠浓度的升高而增强。

不同浓度亚硒酸钠条件下E.cloacaeZ0206对亚硒酸钠还原效率如图2和图3所 示，细菌在生长的最初阶段即开始消耗亚硒酸钠，且0.5mM组、1mM组、5mM组和10mM组亚硒酸 钠分别在第48h、48h、72h和144h消耗尽，而15mM组在监测结束时（第168h）亚硒酸钠消耗率 为91.35%±1.40%。

实施例2以E.cloacaeZ0206和亚硒酸钠合成生物纳米单质硒

将活化的E.cloacaeZ0206菌液稀释至OD₆₀₀=0.5，以1%接种量接种至发酵培养基，加 入亚硒酸钠使其终浓度为10mM，于32℃，250rpm条件下培养144小时。

CN104774875所公开的生物纳米硒制备方法仅说明了制备生物纳米硒的菌种，亚 硒酸钠/硒酸钠浓度梯度和时间梯度设置，并未说明生物纳米硒制备的最优条件。而本发明 根据实施例1中不同亚硒酸钠浓度条件下，E.cloacaeZ0206（CGMCCNO.2279，现有技术） 菌种生长以及亚硒酸钠转化效率差异，筛选得到最优亚硒酸钠添加量和培养时间。

而本研究组自主分离的E.cloacaeZ0206，源于肉灵芝，胞外多糖产量高，耐硒性 能强。实验证明其分泌的胞外多糖可以显著增强动物抗氧化功能、免疫功能，显著促进动物 生长。以E.cloacaeZ0206制备生物纳米单质硒可以得到生物纳米单质硒-多糖复合产物， 可以发挥双重功效，在畜牧生产中具有广阔的应用前景。

实施例3细菌与生物纳米单质硒的电镜观察及能谱分析

取实施例2中的发酵液1mL离心弃上清，将沉淀以PBS清洗3遍后，加入2.5%戊二醛固定 过夜。以PBS清洗3遍后，依次通过1%锇酸固定，酒精梯度脱水，醋酸异戊酯处理，临界点干燥 后，镀膜，在场发射扫描电镜下观察，并进行能谱分析。

结果如图4所示：E.cloacaeZ0206将亚硒酸钠还原为规则的球形纳米颗粒（图4 A中箭头所指），且颗粒大小集中在100-200nm之间，粒径较均一，分散度较好，通过能谱分析 进一步确认胞外纳米颗粒为纳米硒，且生物纳米单质硒颗粒外可能包裹一层含碳有机质。

取实施例2中的发酵液1mL离心弃上清，将沉淀以PBS清洗3遍后，加入2.5%戊二醛 固定过夜。以PBS清洗3遍后，进行预包埋。依次通过1%锇酸固定，酒精梯度脱水，包埋剂处 理，70℃加热，切片染色后，在透射电镜下观察，并进行能谱分析。

结果如图5所示，E.cloacaeZ0206将亚硒酸钠还原形成规则球形纳米颗粒，分布 于胞外，粒度较为均匀，在100-200nm之间，通过能谱分析进一步确认球状颗粒为纳米硒。

实施例4生物纳米单质硒的分离纯化与分析

1.将实施例2中的发酵液于5000×g离心15分钟，保留上清，去除菌体沉淀；

2.将上述上清于4℃，25000×g离心15min，弃上清，保留沉淀。

3.将上述沉淀用双蒸水重悬，于25W，5sON/5sOFF，超声破碎15min。

4.向上述破碎液体中加入1/2体积的正己烷，搅拌均匀，室温静置分层后取下层 水相，生物纳米单质硒存在于水相中。

5.吸取纳米单质硒滴加于铜网上，用滤纸吸去多余水分，晾干后在透射电镜下观 察。

6.吸取纳米单质硒水溶液，通过纳米粒度仪测定生物纳米单质硒粒径。

结果如图6所示，透射电镜下观察到生物纳米单质硒颗粒呈规则球形，粒径在100- 200nm之间，在水中均匀分散。纳米粒度仪测定结果（图7）表明，生物纳米单质硒粒径在80- 250nm之间，平均粒径为144.10±1.14nm。

CN104774875所公开的生物纳米硒制备方法中，纯化生物纳米硒的透射电镜照片 显示生物纳米硒的粒径均小于100nm，与其菌体、生物纳米硒混合样品透射电镜显示的生物 纳米硒粒径范围（100-200nm）存在较大差异，而若生物纳米硒粒径小于100nm，10000rpm离 心不足以将生物纳米硒离心下来，所以该制备方法可能会造成误导。

实施例5生物纳米单质硒-多糖复合物的分离

1.将实施例2中的发酵液于5000×g离心15分钟，保留上清，去除菌体沉淀；

2.向上清中加入3倍体积预冷无水乙醇，产生的红色沉淀即为生物纳米单质硒-多糖 复合物。

实施例6生物纳米单质硒在猪上的应用

1.试验方案和分组

实验选用90头28日龄“杜×长×大”三元杂交断奶仔猪，随机分成3组，每组3个重复，每 个重复10头猪。对照组饲喂基础日粮，试验1组在基础日粮中添加0.3mg/kgNa₂SeO₃（硒含量 为0.14mg/kg），试验2组在基础日粮中添加0.14mg/kg生物纳米单质硒。基础日粮组成和营 养水平见表1。

2.饲养管理

试验期间仔猪饲养于半漏缝地板上，猪栏采用自动喂料槽，鸭嘴式饮水器，自由采食、 饮水，按照猪场仔猪常规管理程序进行驱虫和免疫。

生长性能测定

分别在28日龄、67日龄以重复为单位进行群体称重，并统计耗料量，计算平均日采食 量、平均日增重和料重比。

样品收集

实验结束空腹12h后，用真空促凝管取血，在4℃，3000×g条件下离心15分钟，收集上清 分装保存于-80℃冰箱备用。

血清抗氧化、免疫指标测定

血清总抗氧化能力、谷胱甘肽还原酶活力、超氧化物歧化酶活力和丙二醛含量检测采 用南京建成生物工程研究所试剂盒，操作步骤按照说明书。

血清免疫球蛋白IgG和IgM含量的测定采用免疫比浊法。

血清细胞因子α肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素-2（IL-2）和白介素-6（IL-6）的测定 采用南京建成生物工程研究所试剂盒，操作步骤按照说明书。

数据统计

利用SPSS17.0软件进行单因素方差分析，数据以P<0.05为显著水平。以平均数±标 准差表示。

实验结果

（1）生物纳米单质硒对仔猪生长性能的影响

表2.生物纳米单质硒对仔猪生长性能的影响

如表2所示，虽然各组平均日采食量无显著差异，但生物纳米单质硒（试验2组）显著提 高了仔猪的平均日增重，显著降低仔猪的料重比，促生长效果优于亚硒酸钠（试验1组）。

（2）生物纳米单质硒对仔猪抗氧化功能的影响

如表3所示，相对于对照组和试验1组（Na₂SeO₃）相比，实验2组（生物纳米单质硒）仔猪 血清总抗氧化能力，谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物酶活力显著提高，血清丙二醛水平显 著降低。而试验1组与对照组各项指标差异不显著。

（3）生物纳米单质硒对仔猪血清免疫因子水平的影响

如表4所示，相对于对照组，试验1组（Na₂SeO₃）和试验2组（生物纳米单质硒）仔猪血清 免疫球蛋白IgG和IgM，细胞因子TNF-α、IL-2和IL-6水平明显提高，且生物纳米单质硒组各 项指标提高程度达到显著水平。

结论

仔猪日粮中添加生物纳米单质硒可以显著提高仔猪日增重，降低料重比，提高仔猪生 长性能；提高仔猪抗氧化能力和免疫因子水平，增强仔猪免疫功能。且效果显著优于亚硒酸 钠。