CYP3A5基因的检测引物组、其构成的反应体系及应用

摘要

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种CYP3A5基因的检测引物组及其构成的反应体系，所述检测引物组如下：正向外侧引物F3A：SEQIDNO:1；反向外侧引物B3A：SEQIDNO:2；正向内侧引物FIPA：SEQIDNO:3；反向内侧引物BIPA：SEQIDNO:4；正向外侧引物F3G：SEQIDNO:5；反向外侧引物B3G：SEQIDNO:6；正向内侧引物FIPG：SEQIDNO:7；反向内侧引物BIPG：SEQIDNO:8。本发明步骤简单、扩增反应快速、高效、特异性高、鉴定简便，使该技术有着更广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种CYP3A5基因的检测引物组、其构成 的反应体系及应用。

背景技术

细胞色素P450(cytochromeP450或CYP450)简称CYP450，主要存在于肝脏、肠道中 的单加氧酶，是人体内参与内源性物质和外源性化合物代谢过程的一组超家族酶类，尤其 在药物的体内代谢过程中扮演重要角色。其中，CYP3A5参与他克莫司、咪达唑仑、氨苯砜、可 的松、尼菲地平等多种药物的代谢。该基因的一个SNP，rs776746(CYP3A5*3，6986A>G)，会导 致CYP3A5基因的mRNA过短地剪切，形成一个“不完整的”CYP3A5蛋白，从而导致CYP3A5酶蛋 白活性的降低甚至消失。

据统计，CYP3A5*3等位基因在中国人群中出现的频率约为75％，而携带突变型等 位基因的患者在临床药物治疗过程中的表现与野生型携带者大相径庭。例如，在临床器官 移植术后使用的主要免疫抑制剂类药物他克莫司(tacrolimus，FK506)，其代谢过程主要由 CYP3A5进行调控。如果CYP3A5基因出现突变，则会导致病人体内他克莫司的血药浓度大幅 度增高，并出现肾毒性、神经毒性、高血压和胃肠道紊乱等一系列药物毒副作用。因此，在临 床中检测CYP3A5基因分型对于临床治疗，特别是器官移植术后病人的临床用药治疗实现个 体化安全用药具有重要的指导作用。

目前，关于CYP3A5基因分型的检测多采用荧光定量PCR，基因测序以及基因芯片等 技术手段。CN104498592A公开了一种人CYP3A5基因检测方法，包括提供待测样品、核酸 扩增体系和荧光检测体系混合物；通过扩增反应循环扩增靶多核苷酸；使荧光发生基团与 被扩增的靶多核苷酸序列间接结合；测定荧光量；所述核酸扩增体系至少分别包含CYP3A5 基因CYP3A5*1和CYP3A5*3多态性的特异性正向引物和反向引物。使用这些方法进行CYP3A5 基因分型检测均不同程度存在购买仪器成本高，操作程序复杂，检测周期较长等问题，不利 于提高检测效率并实现临床推广普及。然而，从目前来看，这种检测需求又非常巨大，因此， 寻找一种高效且价格容易被患者接受的检测手段，对于CYP3A5基因分型检测有着重要的现 实意义。

环介导的等温扩增(LAMP)技术是日本科学家于2000年提出的一种等温扩增技术， 其主要特点是针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，在链置换DNA聚合酶(BstDNA polymerase)的作用下进行恒温扩增，仅需15-90分钟即可产生10⁹-10¹⁰数量级的产物。具有 敏感性高、特异性好、操作简便、成本低廉且结果易于判定的优点。

发明内容

本发明为了克服上述方法的缺陷，提供一种CYP3A5基因的检测引物组、其构成的 反应体系及应用，所述检测体系具有敏感性高、特异性好和操作简便等优点。

为达到此发明的目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种CYP3A5基因的检测引物组，所述检测引物组如下：

正向外侧引物F3A：SEQIDNO:1：ATTATGGAGAGTGGCATAGG；

反向外侧引物B3A：SEQIDNO:2：TTAGGGTGTGACACACAG；

正向内侧引物FIPA：SEQIDNO:3：TTTAAAGACAAAAGAGCTCTTTAAAGAGAAGATACCCA CGTATGTACCA；

反向内侧引物BIPA：SEQIDNO:4：TGGTCATGGGTAATATGCTTCGTGGTAAGAAAGCCCCAA TGGTACT；

正向外侧引物F3G：SEQIDNO:5：GAGTGGCATAGGAGATACC；

反向外侧引物B3G：SEQIDNO:6：TTAGGGTGTGACACACAG；

正向内侧引物FIPG：SEQIDNO:7：CTTAAAGACAAAAGAGCTCTTTAAAGAACGTATGTACCA CCCAGC；

反向内侧引物BIPG：SEQIDNO:8：CCTGTTTGGACCACATTACCCCAAGAGTCTCACACAGGAG。

优选地，所述SEQIDNO:1-4所示的序列是用于检测rs776746位点的A等位基因。

优选地，所述SEQIDNO:5-8所示的序列是用于检测rs776746位点的G等位基因。

本发明中，4条引物的外侧引物记为正向外侧引物F3和反向外侧引物B3，内侧引物 记为正向内侧引物FIP和反向内侧引物BIP，其中FIP包含了F1c和F2，BIP包含了B1c和B2，上 述引物均由在线软件PrimerExplorerV4设计。本发明在普通LAMP的基础上，以特异性要求 最严格的F1c的5’端针对rs776746位点设计等位基因特异引物，分别检测rs776746的A等位 基因和rs776746的G等位基因。通过分别在FIPA和FIPG的5’端第三位引进额外突变，进一步 降低非特异性扩增的可能性。

第二方面，本发明提供一种检测CYP3A5基因的反应体系，所述反应体系包括第一 方面所述的引物组，反应缓冲液，dNTPs，羟基萘酚蓝，甜菜碱，BstDNA聚合酶，待检样品基 因组DNA和去离子水。

优选地，所述反应缓冲液包括Tris-HCl，KCl，(NH₄)₂SO₄，MgSO₄和Tween-20。

优选地，所述Tris-HCl的浓度为10-30mM，例如可以是10mM、11mM、12mM、13mM、 15mM、16mM、18mM、20mM、22mM、23mM、25mM、26mM、28mM或30mM，优选为15-25mM，进一步优选为 20mM。

优选地，所述KCl的浓度为10-60mM，例如可以是10mM、11mM、12mM、15mM、18mM、 20mM、23mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、51mM、52mM、53mM、54mM、55mM或60mM，优选为 50-55mM，进一步优选为50mM。

优选地，所述(NH₄)₂SO₄的浓度为5-13mM，例如可以是5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、 11mM、12mM或13mM，优选为8-12mM，进一步优选为10mM。

优选地，所述MgSO₄的浓度为2-8mM，例如可以是2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM或8mM， 优选为2-6mM，进一步优选为4mM。

优选地，所述Tween-20的体积分数为0.1-1％，例如可以是0.1％、0.2％、0.3％、 0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％，优选为0.1％。

优选地，所述dNTPs的浓度为1-2mM，例如可以是1mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、 1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM或2mM，优选为1.2-1.8mM，进一步优选为1.4mM。

优选地，所述羟基萘酚蓝的浓度为108-130μM，例如可以是108μM、109μM、110μM、 111μM、112μM、115μM、116μM、118μM、120μM、122μM、125μM、126μM、128μM或130μM，优选为115- 123μM，进一步优选为120μM。

优选地，所述甜菜碱的浓度为0.1-1M，例如可以是0.1M、0.2M、0.4M、0.6M、0.8M或 1M，优选为0.5-0.8M，进一步优选为0.8M。

作为优选技术方案，所述反应体系包括反应体系A和反应体系G，其中每个25μL反 应体系含有以下组分：

缓冲液：

第三方面，本发明提供一种如第二方面所述的反应体系的使用方法，所述方法包 括如下步骤：

将反应体系A和反应体系G所需各组分混合完毕，放置于恒温水浴锅进行反应，反 应后升温进行灭活处理，再根据体系颜色变化判定结果。

优选地，所述恒温水浴锅的温度为55-68℃，例如可以是55℃、56℃、57℃、58℃、59 ℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃或68℃，优选为58-61℃，进一步优选为60℃。

优选地，所述反应时间为15-90min，例如可以是15min、20min、25min、30min、 35min、40min、45min、50min、55min、60min、65min、70min、75min、80min、85min或90min，优选 为45-90min，进一步优选为60min。

优选地，所述升温后的温度为78-90℃，例如可以是78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、 83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃或90℃，优选为80-85℃，进一步优选为80℃。

优选地，所述升温后的反应时间为15-30min，例如可以是15min、16min、17min、 18min、19min、20min、22min、25min、26min、28min或30min，优选为18-26min，进一步优选为 20min。

优选地，所述根据体系颜色变化判定结果为：

反应体系A为紫罗兰，反应体系G为天蓝色，则待测位点基因型为GG；

反应体系A为天蓝色，反应体系G为紫罗兰，则待测位点基因型为AA；

反应体系A为天蓝色，反应体系G为天蓝色，则待测位点基因型为AG。

第四方面，本发明提供一种检测CYP3A5基因的检测试剂盒，所述试剂盒包含如第 二方面所述的反应体系。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)步骤简单：扩增DNA只需反应体系配置完毕后放置在恒温水浴锅中进行反应扩 增即可，不需要预先进行双链DNA的变性及类似于PCR循环反应中的反复变性、退火、延伸等 变温过程；

(2)高特异性：扩增的特异性很高，可以根据是否扩增就能判断目标基因的存在 与否，可应用于检测CYP3A5基因分型，提前预知CYP3A5基因是否出现突变；

(3)扩增反应快速、高效：整个扩增2h内即可完成，且产率高；

(4)鉴定简便：反应完成后通过肉眼观察颜色变化即可判定结果，结果的观察可以 脱离凝胶成像的操作要求和仪器限制，加上扩增是等温进行，不用依赖PCR仪复杂的循环温 度变化来完成，在水浴锅中就能进行，使该技术有着更广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明引物组的示意图；

图2为本发明引物组中的FIP和BIP的示意图；

图3为本发明实施例1中的M1-4的反应产物的电泳图；

其中，M-DNAmarker，从上致下依次为5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、 900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp和100bp；1^A-M1组的A反应体系；1^G- M1组的G反应体系；2^A-M2组的A反应体系；2^G-M2组的G反应体系；3^A-M3组的A反应体系；3^G-M3 组的G反应体系；4^A-M4组的A反应体系；4^G-M4组的G反应体系；

图4是本发明实施例1中M1组的测序图谱；

图5是本发明实施例1中M2组的测序图谱；

图6是本发明实施例1中M3组的测序图谱；

图7是本发明实施例1中M4组的测序图谱。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施 例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件， 或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购 获得的常规产品。

实施例1

抽取4人1ml静脉血以EDTA抗凝管保存，每管取200ul血液，用全式金或者其它公司 的DNA提取试剂盒，参照试剂盒说明书提取全基因组DNA作为检测的模板，分别标记为M1、 M2、M3和M4。用本发明中的相对应的引物组进行反应，验证本发明的实施效果。

对模板M采用Allele-SpecificLAMP技术，使待检测的核酸进行LAMP反应，分为两 组反应体系，一组针对A等位基因的体系A，一组针对G等位基因的体系G。将模板Mn(n为组别 编号1-4)分别加入到体系A和体系G中，得到反应体系A和G。

首先，选用如本申请第一方面所述的引物组对样本的序列进行反应，所述引物组 如下：

正向外侧引物F3A：SEQIDNO:1：ATTATGGAGAGTGGCATAGG；

反向外侧引物B3A：SEQIDNO:2：TTAGGGTGTGACACACAG；

正向内侧引物FIPA：SEQIDNO:3：TTTAAAGACAAAAGAGCTCTTTAAAGAGAAGATACCCACG TATGTACCA；

反向内侧引物BIPA：SEQIDNO:4：TGGTCATGGGTAATATGCTTCGTGGTAAGAAAGCCCCAAT GGTACT；

正向外侧引物F3G：SEQIDNO:5：GAGTGGCATAGGAGATACC；

反向外侧引物B3G：SEQIDNO:6：TTAGGGTGTGACACACAG；

正向内侧引物FIPG：SEQIDNO:7：CTTAAAGACAAAAGAGCTCTTTAAAGAACGTATGTACCA CCCAGC；

反向内侧引物BIPG：SEQIDNO:8：CCTGTTTGGACCACATTACCCCAAGAGTCTCACACAGGAG。

所有反应均设置同一种反应体系，组成如下：

反应体系A：

反应体系G：

两个反应体系反应时，于60℃下反应60min，之后升温至80℃保持20min进行灭活 处理，之后降温，观察体系颜色变化即可。

反应按照上述的检测方法进行，反应前，体系颜色均为紫罗兰色，反应后，各组别 反应体系的颜色及基因型判断如表1所示：

表1

由表1可以看出，编号为1和3的样本反应体系A均变为天蓝色，反应体系G也均变为 天蓝色，证明两个反应体系中均发生阳性反应，表明这两个个样本在rs776746位点处基因 型为AG；2和4样本则是体系A保持紫罗兰色，体系G变为天蓝色，判定为GG基因型。

为进一步验证反应的准确性，对上述组别的LAMP产物进行电泳，用2％的琼脂糖凝 胶电泳鉴定，6v/cm电压下电泳30min。得到的电泳图如图3所示。1和3组的反应体系A、G均呈 现典型的梯状条带。第3和第4组反应体系G呈现典型的梯状条带，而反应体系A则没有条带。 与本发明的检测方法的结果相同。

再将上述3个实验组别的模板(阳性对照组除外)分别用PCR-测序法进行分型，得 到的测序图谱如图4-7所示，对比基因测序图谱和本发明提供的检测引物组的检测结果可 知，二者的检测吻合率100％，可验证本发明的结果精准。

综上所述，本发明反应体系能够准确的判断反应样本的基因型，且本发明步骤简 单：扩增DNA只需反应体系配置完毕后放置在恒温水浴锅中进行反应扩增即可，不需要预先 进行双链DNA的变性及类似于PCR循环反应中的反复变性、退火、延伸等变温过程；扩增反应 快速、高效、特异性高：整个扩增2h内即可完成，且产率高；鉴定简便：反应完成后通过肉眼 观察颜色变化即可判定结果，结果的可视观察可以脱离凝胶成像的操作要求和仪器限制， 加上扩增是等温进行，不用依赖PCR仪复杂的循环温度变化来完成，在水浴锅中就能进行， 使该技术有着更广阔的应用前景。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局 限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的 技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的 添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。