一种植物非生物胁迫诱导表达启动子pTaPIP1A及其应用

摘要

本发明公开了一种植物非生物胁迫诱导表达启动子pTaPIP1A，所述植物非生物胁迫诱导表达启动子pTaPIP1A的核苷酸序列如SEQ？ID？NO？:？1所示；还公开了一种含有所述启动子pTaPIP1A的重组表达载体以及该启动子pTaPIP1A在植物育种中的应用；其应用是将核苷酸序列如SEQ？ID？NO？:1所示的启动子pTaPIP1A与目的基因融合，构建重组诱导表达载体，将所述重组诱导表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育，在非生物胁迫条件下，诱导植物地上部表达目的基因，从而培育出在非生物胁迫、特别是在干旱高盐胁迫下表达目的基因的植物新品种，这对植物特别是小麦基因工程育种具有重要的意义。

说明书

技术领域

本发明涉及生物基因工程技术领域，具体地说是一种植物非生物胁迫诱导表达启动子pTaPIP1A及其应用。

背景技术

非生物胁迫对农作物的产量影响较大，在各种非生物胁迫中，盐胁迫和旱胁迫经常同时发生，引起植物细胞脱水、离子平衡被打破，进而导致作物产量降低。因此，通过基因工程培育抗旱耐盐农作物新品种已经成为当前迫切任务之一。

在基因工程育种过程中，比较常用的启动子有组成型启动子和诱导型启动子。其中组成型启动子有CaMV35S启动子、Ubiqitin启动子等。组成型启动子可以使目的基因在植物整个生长发育过程中高效表达，但是伴随大量营养消耗，影响植物的发育，表现为植物生长缓慢、矮小、产量降低等。而诱导型启动子在某些信号刺激或植物生长发育的特定组织或阶段启动外源基因转录，它不仅能使目的基因在特定时间或组织部位实现表达，还可以减少由于外源基因表达对植物发育的负面影响。可见，诱导型启动子在基因工程育种过程中的应用更为理想。

小麦是世界上重要的粮食作物之一，且小麦抗旱或/和耐盐研究日益受到人们的关注，因此，非生物胁迫尤其是旱胁迫或/和盐胁迫诱导性启动子的分离和鉴定对于小麦抗旱耐盐遗传改良显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物非生物胁迫诱导表达启动子pTaPIP1A及其应用，培育出在非生物胁迫条件下、诱导植物地上部表达目的基因的植物新品种。

本发明是这样实现的：一种植物非生物胁迫诱导表达启动子pTaPIP1A，所述植物非生物胁迫诱导表达启动子pTaPIP1A的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。

本发明还公开了一种重组表达载体，所述重组表达载体包含权利要求1所述的植物非生物胁迫诱导表达启动子pTaPIP1A，在所述重组表达载体中，所述植物非生物胁迫诱导表达启动子pTaPIP1A连接于载体中目的基因序列的上游；所述目的基因为GUS基因，所述重组表达载体为pTaPIP1A::GUS。

本发明提供的一种植物非生物胁迫诱导表达启动子pTaPIP1A在植物育种中的应用，是将核苷酸序列如SEQIDNO:1所示的启动子pTaPIP1A与目的基因融合，构建重组诱导表达载体，将所述重组诱导表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育，获得在非生物胁迫条件下诱导目的基因在植株地上部实现表达的植物新品种。

所述植物为单子叶植物，例如小麦、水稻、玉米、大麦、燕麦或高粱，优选小麦。

所述启动子pTaPIP1A与目的基因融合是指将植物非生物胁迫诱导表达启动子pTaPIP1A连接于载体中目的基因序列的上游。

所述非生物胁迫为盐胁迫、旱胁迫或盐和旱同时胁迫。

特别地，一种植物非生物胁迫诱导表达启动子pTaPIP1A在培育抗旱耐盐小麦品种中的应用，是将核苷酸序列如SEQIDNO:1所示的启动子pTaPIP1A与目的基因融合，构建重组诱导表达载体，将所述重组表达载体转化到小麦细胞、组织或器官中培育出能够在抗旱或/和耐盐的胁迫下、在小麦地上部表达目的基因的抗旱耐盐品种；或者在含有核苷酸序列如SEQIDNO:1所示的启动子pTaPIP1A的小麦的不同生育时期，利用干旱或/和盐胁迫处理，使所述启动子pTaPIP1A下游的目的基因获得特异表达，通过基因工程的方法，对小麦性状进行改良。

本发明所用科农9204（KN9204）为审定品种，于2002年通过河北省农作物品种审定委员会审定；2003年通过全国品种审定，品种审定编号为国审麦2003037。

本发明应用了植物基因工程技术，首次从小麦科农9204中获得了启动子pTaPIP1A，通过实验证明，该启动子为植物非生物胁迫诱导表达启动子，将该启动子与下游的目的基因融合，构建诱导表达载体，尤其在高盐和/或干旱的非生物胁迫下，可以诱导植物地上部表达下游目的基因，或对含有启动子pTaPIP1A的小麦的不同生育时期，利用干旱或/和盐处理，特异诱导目的基因在小麦地上部的表达，对小麦性状进行改良；由此实现抗旱耐盐植物新品种的培育，对植物特别是小麦基因工程育种具有重要的意义。

附图说明

图1为在小麦KN9204不同组织中启动子pTaPIP1A诱导表达下游基因组织表达特异性qRT-PCR分析结果。

图2为小麦KN9204在干旱胁迫下启动子pTaPIP1A诱导表达下游基因的结果。

图3为小麦KN9204在盐胁迫下启动子pTaPIP1A诱导表达下游基因的结果。

图4为启动子pTaPIP1A连接GUS基因与转录因子TaWRKY71和TaMYB1分别连接GFP共同转化烟草组织，启动子激活下游基因GUS化学染色的结果。

图5为启动子pTaPIP1A连接GUS基因与转录因子TaWRKY71和TaMYB1分别连接GFP共同转化烟草组织，启动子激活下游基因GUS的酶活性测定结果。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。文中单位M表示mol/L。

实施例1启动子pTaPIP1A的克隆

（1）提取小麦科农9204的gDNA

利用植物基因组DNA提取试剂盒（天根，DP305）提取DNA，具体步骤如下：①取小麦科农9204的叶片约100mg，加入液氮充分碾磨；②将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700μl、65℃预热缓冲液GP1的离心管中（实验前在预热的GP1中加入β-巯基乙醇，使其最终体积百分比浓度为0.1%），迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次；③加入700μl氯仿，充分混匀，12000rpm离心5min；④小心地将上一步所得上层水相转入一个新的离心管中，加入700μl缓冲液GP2，充分混匀；⑤将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12000rpm离心30s，弃掉废液；⑥向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；⑦向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；⑧重复操作步骤⑦；⑨将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；⑩将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，即得小麦科农9204的gDNA。

（2）设计扩增引物

以小麦科农9204的gDNA为模板，在ATG上游设计基因特异引物，如下：

上游引物PstI-PIP1：5’-CTGCAGGCACACAAGTATTTATCGGTG-3’，

下游引物NcoI-PIP1：5’-CCATGGGGCCGGTGCTTCTCTGAG-3’。

（3）聚合酶链式反应（PCR）反应进行序列扩增

用上游引物PstI-PIP1和下游引物NcoI-PIP1分别对小麦gDNA进行PCR扩增；其PCR扩增体系为50μl：包括：5×PrimeSTARGXLBuffer10μl，dNTPMixture4μl、上游引物PstI-PIP1（10μM）2.5μl、下游引物NcoI-PIP1（10μM）2.5μl、模板gDNA2μl、PrimeSTARGXLDNAPolymerase（TaKaRa，R050Q）0.5μl、ddH₂O28.5μl；其PCR扩增反应程序：98℃预变性2min；98℃变性10s，58℃退火15s，68℃延伸3min，30个循环；68℃延伸10min；4℃保存；得PCR扩增产物。

（4）将PCR扩增产物纯化回收

使用琼脂糖凝胶回收试剂盒（天根，DP209），具体步骤如下：①柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500μl平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；②将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量；③向胶块中加入等倍体积溶液PN，50℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解；④将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2min，12000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中；⑤向吸附柱CA2中加入600μl漂洗液PW，12000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中；重复操作该步骤；⑥将吸附柱CA2放回收集管中，12000rpm离心2min，尽量除尽漂洗液；将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干；⑦将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB，室温放置2min；12000rpm离心2min收集DNA溶液，得PCR纯化回收产物。

（5）重组质粒的PCR鉴定及测序

取4μlPCR纯化回收产物，加入1μlpEASY-BluntCloning载体（全式金，CB101-01），轻轻混合，在温度为20-37℃下反应5min，完成连接；将连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，在表面涂有8μlIPTG（500mM），40μlX-gal（20mg/ml）的卡那霉素（50μg/ml）LB平板37℃生长过夜；挑选白色菌落，通过快速PCR挑选阳性克隆测序；得到了启动子pTaPIP1A的核苷酸序列，该启动子为小麦水通道蛋白启动子，其序列大小为1996bp。

实施例2启动子pTaPIP1A诱导下游基因TaPIP1A在小麦组织中表达的特异性分析

（1）材料培养：田间种植小麦，抽穗期分别取根（root）、茎（stem）、旗叶（flagleaf）、叶轴（rachis）、穗（headingspike）、穗轴（cob）、外稃（lemma）、內稃（glumelle）、雄蕊（stamen）、雌蕊（pistil）、芒（awn）各组织，液氮冷冻后-80℃保存。

（2）利用Trizol（Invitrogen）提取总RNA，具体步骤如下：①液氮研磨50-100mg小麦组织，研碎后转移到含1mlTrizol试剂的EP管中，充分混匀，室温静置5min；②加入0.2ml氯仿，充分混匀，室温静置2-3min；在4℃下，12000g离心15min；③把上层无色的水相转移到一个洁净的1.5mlEP管中，加入0.5ml异丙醇，混匀后室温放置10min；在4℃下，12000g离心10min；④去上清，将沉淀用1ml体积百分比浓度75%乙醇清洗，在4℃下，7500g离心5min，之后将沉淀风干；⑤将沉淀溶于适量RNase-free的去离子水中，60℃促溶10min；即得所需总RNA；紫外可见超微量分光光度计NanoDropND-2000Spectrotometer定量检测，电泳分析RNA的完整性。

（3）利用PrimeScript^TMRTreagentKitwithgDNAEraser（TaKaRa，RR047A）进行第一链cDNA合成；①去除基因组DNA，反应体系：5×gDNAEraserBuffer2μl，gDNAEraser1μl，TotalRNA5μl（200ng/μl），RNaseFreedH₂O₂μl；反应程序：42℃孵育2min，4℃保存；②反转录，反应体系：步骤①的反应液10μl，PrimeScriptRTEnzymeMixI1μl，RTPrimerMix1μl，5×PrimeScriptBuffer24μl，RNaseFreedH₂O4μl；反应程序：37℃孵育15min，85℃5s终止反应，4℃保存。

（4）使用SYBR^?PremixExTaqII（TaKaRa，RR820A）试剂盒进行实时荧光定量PCR分析，具体步骤：①混匀如下反应体系，然后分装于96孔光学版中，并覆盖上光学膜，扩增使用的仪器为ABIPRISM7500real-timePCR仪；②PCR反应程序：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火并延伸34s，40个循环；③20μl的PCR反应体系配制如下：SYBR^?PremixExTaqII（2×）10μl，上游引物TaPIP1A-F2（10μM）0.8μl，下游引物TaPIP1A-R2（10μM）0.8μl，ROXReferenceDyeII（50×）0.4μl，cDNA模板2μl，ddH₂O6μl；其引物序列为：

上游引物TaPIP1A-F2：5’-CGGGCTAGGGGCTGAGATCG-3’，

下游引物TaPIP1A-R2：5’-CGCTTGGCGTCGGTGGC-3’；

内参TaActin引物TaActin-F2：5’-TGCTATCCTTCGTTTGGACCTT-3’，

内参TaActin引物TaActin-R2：5’-AGCGGTTGTTGTGAGGGAGT-3’。

（5）实验结果：如图1所示，从图中可以证明启动子pTaPIP1A可诱导在小麦地上部组织表达目的基因，尤其在叶片中高效表达，在根和雄蕊及雌蕊中较低表达。

实施例3启动子pTaPIP1A在干旱胁迫下诱导下游目的基因表达

（1）材料培养及PEG-6000人工模拟干旱处理：

科农9204小麦种子播种于铺有2层滤纸的培养皿中，ddH₂O浸湿，萌发4天，去胚乳，Hogland培养至第10天，挑选长势一致的幼苗进行质量百分比浓度为20%的PEG-6000处理，0h、1h、3h、6h、12h、24h、48h、72h分别取样，液氮冷冻后-80℃保存；

（2）利用Trizol提取总RNA，具体步骤参见实施例2的第（2）步；

（3）利用PrimeScript^TMRTreagentKitwithgDNAEraser（TaKaRa，RR047A）进行第一链cDNA合成，具体步骤参见实施例2的第（3）步；

（4）使用SYBR^?PremixExTaqII（TaKaRa，RR820A）试剂盒进行实时荧光定量PCR分析，具体步骤及所用上下游引物、内参引物均与实施例2的第（4）步相同；

（5）实验结果：如图2所示，随着处理时间的推移，pTaPIP1A启动子启动的目的基因在小麦叶片中的表达受干旱诱导明显上调，在叶片中6小时达到最高峰，而在根中则不被明显的诱导，说明启动子pTaPIP1A可以在干旱条件下，特异的在地上部分诱导目的基因高表达。在小麦中利用启动子pTaPIP1A过表达目的基因，可以在小麦不同生育时期，利用干旱条件，特异表达目的基因，进而通过基因工程的方法，对小麦性状进行改良。

实施例4启动子pTaPIP1A在盐胁迫下诱导下游目的基因表达

（1）材料培养及NaCl处理：科农9204小麦种子播种于铺有2层滤纸的培养皿中，dH₂O浸湿，萌发4天，去胚乳，Hogland培养至第10天，挑选长势一致的幼苗进行100mMNaCl处理，0h、1h、3h、6h、12h、24h、48h、72h分别取样，液氮冷冻后-80℃保存；

（2）利用Trizol提取总RNA，具体步骤参见实施例2的第（2）步；

（3）利用PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser（TaKaRa，RR047A）进行第一链cDNA合成，具体步骤参见实施例2的第（3）步；

（4）使用SYBR^?PremixExTaqII（TaKaRa，RR820A）试剂盒进行实时荧光定量PCR分析，具体步骤及所用上下游引物、内参引物均与实施例2的第（4）步相同；

（5）实验结果：如图3所示，启动子pTaPIP1A启动的目的基因在小麦叶片中的表达均受盐诱导表达上调，在叶片中6小时达到最高峰，而在根中则不被明显的诱导，说明启动子pTaPIP1A可以在盐胁迫条件下，特异的在地上部分诱导目的基因高表达。在小麦中利用启动子pTaPIP1A过表达目的基因，可以在小麦不同生育时期，利用NaCl处理，特异表达目的基因，进而通过基因工程的方法，对小麦性状进行改良。

实施例5小麦胁迫相关转录因子TaWRKY71和TaMYB1分别与pTaPIP1A启动子结合，激活下游基因表达

（1）pTaPIP1A::GUS表达载体构建：①将实施例1中的PCR产物，用PstI和NcoI进行酶切，根据实施例1中步骤（4）的方法纯化回收。同时，用PstI和NcoI将pCAMBIA1391载体进行双酶切，酶切产物跑琼脂糖凝胶电泳检测并回收。②在10μl体系中，将回收的pCAMBIA1391载体片段和步骤①回收的PCR产物用T4连接酶4℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。③将筛选得到的阳性克隆用PstI和NcoI进行酶切鉴定，获得重组质粒，从而使pTaPIP1A启动子与GUS基因融合，获得pTaPIP1A::GUS植物表达载体。

（2）TaWRKY71::GFP和TaMYB1::GFP植物表达载体构建：①利用实施例2中步骤（2）中的方法提取科农9204总RNA；②按照RNAPCRKit(AMV)Ver.3.0试剂盒(TaKaRa,DRR019A)的说明书进行cDNA反转录。采用的两对引物如下：

上游引物BglII-WRKY71：5’-AGATCTATGGATCCATGGGTCAGCAG-3’，

下游引物XbaI-WRKY71:5’-TCTAGAGCCGCTGACGGCGGCC-3’；

上游引物BamHI-MYB1：5’-GGATCCATGGGGAGGTCGCCGTGC-3’，

下游引物XbaI-MYB1：5’-TCTAGATCATTTCATCTCGATGCTTCTG-3’；

根据实施例1步骤（3）的步骤进行PCR扩增TaWRKY71和TaMYB1的全长cDNA，分别利用BglII和XbaI酶切TaWRKY71的PCR产物；BamHI和XbaI酶切TaMYB1的PCR产物，根据实施例1中步骤（4）的方法回收。同时，分别用BglII/XbaI和BamHI/XbaI将pEGAD载体进行双酶切，酶切产物跑琼脂糖凝胶电泳检测并回收；③在10μl体系中，将回收的pEGAD载体片段和回收的PCR产物用T4连接酶4℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；④将筛选得到的阳性克隆分别用BglII/XbaI和BamHI/XbaI进行酶切鉴定，获得重组质粒；从而使TaWRKY71和TaMYB1与GFP基因融合，获得了TaWRKY71::GFP和TaMYB1::GFP植物表达载体。

（3）农杆菌感受态准备及转化

①挑取GV3101单菌落接种到5ml菌液中（含利福平浓度为50mg/ml），过夜培养；②500μL菌液接种于50mlYEB中（含利福平浓度为50mg/ml）；28℃，200rpm培养至OD₆₀₀=0.6-0.8；③将菌液转入50mL离心管中，冰浴30min，5000rpm，4℃，离心5min，收集菌体；④沉淀用10mL0.15mol/L的NaCl重悬；4℃，5000g，离心5min，收集菌体，；⑤用1mL20mmol/L的CaCl₂重悬；⑥每管100μL/管分装；液氮冷冻5min；-70℃保存。⑦将步骤（1）和步骤（2）中构建的表达载体pTaPIP1A::GUS、TaWRKY71::GFP和TaMYB1::GFP转化到农杆菌GV3101中。

（4）烟草叶片注射转化

①将检测成功转化的农杆菌菌液28℃，200rpm过夜摇培，菌液浓度达到OD₆₀₀值为0.8-1.0；②4000g，10min，沉淀菌体(室温)，去上清，加渗透液（10mMMES；10mMMgSO₄；200μM乙酰丁香酮溶液），悬浮菌体；③调节农杆菌悬浮物到OD₆₀₀为0.5-0.6，并将需要混合的农杆菌混合（1:1）；④用微量注射器将100μL菌体悬浮物注射到2-4周烟草叶片的叶脉间，保湿，在22℃、16h光照的培养室中培养24-48h；⑤用打孔器从注射农杆菌的叶片上打取材料；⑥材料浸在GUS显色液中进行染色，37℃反应过夜，质量百分比浓度为75%酒精脱色，观察结果。⑦或者将步骤⑤中的材料进行GUS活定量分析。

（5）GUS活性的组织化学染色

①GUS染色底物的配制：50mM磷酸缓冲液（pH7.2）,0.1%TritonX-100,2mMK₃Fe(CN)₆,2mMK₄[Fe(CN)₆]·3H₂O,10mMEDTA,2mMX-Gluc；

②染色步骤：加入适量配制好的GUS染液于24孔板的孔中，将待测样品浸到GUS染液中，将24孔板置于37℃保温箱中放置6h；先后用质量百分比浓度为50%、70%、100%的乙醇漂洗样品，每次浸泡5分钟；加入100%乙醇浸泡直至完全脱色。

（6）GUS活性定量分析

①GUS粗体液提取：取100mg转化后的烟草样品在液氮中研磨成粉末，将粉末装入1.5ml离心管，加入3倍体积的GUS提取缓冲液（50mM磷酸钠缓冲液(PH7.0),10mMEDTA,0.1%TritonX-100,0.1%SDS,10mMβ-疏基乙醇），摇动5min，12,000rpm，4℃离心10min，取上清4℃保存备用；②Bradford法测定GUS粗体液蛋白含量；③制作4-MU标准：先配制4-MU梯度浓度液（由反应终止液配制）10μM、2.5μM、1μM、500nM、100nM、10nM，在激发光365nm，发射光455nm，测定各样品的荧光值，绘制标准曲线；④酶反应：取40μl的GUS粗体液，加入400μl反应缓冲液里（2mMMUG，37℃预热），立即取100μl加入到900μl反应终止液（0.2MNa₂CO₃）(空白对照)，37℃温浴，严格定时，10min、30min和60min各取100μl，加入900μl反应终止液；测定荧光值。根据标准曲线，计算各样品酶活。

（7）实验结果分析：TaWRKY71(Xu,Fengetal.2013)和TaMYB1(Lee,Jangetal.2007)均为参与植物耐盐和耐旱的重要转录因子。将pTaPIP1A::GUS/TaWRKY71::GFP和pTaPIP1A::GUS/TaMYB1::GFP分别共转烟草叶片，GUS组织化学染色结果如图4所示；图中表明：与对照pTaPIP1A::GUS/pEGAD相比，共转pTaPIP1A::GUS/TaWRKY71::GFP和pTaPIP1A::GUS/TaMYB1::GFP烟草叶片染色更蓝；其GUS酶活性定量结果见图5，图中表明TaWRKY71和TaMYB1分别提高启动子pTaPIP1A连接的GUS酶活性达显著水平（p<0.05）和极显著水平(p<0.01)。由此可见，启动子pTaPIP1A可以受盐和旱诱导表达下游目的基因。

上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件。