Oct4在调控IL-31基因表达中的应用

摘要

本发明公开了Oct4在调控IL-31基因表达中的应用。本发明是基于本发明发明人首次发现转录因子Oct4在间充质干细胞内能结合并活化其新靶基因IL-31的成果。本发明采用染色质免疫共沉淀和双荧光素酶报告基因系统检测的方法证明了在间充质干细胞内转录因子Oct4能够与IL-31基因的启动子特异性结合，并能够活化IL-31基因的转录。因此，这些研究结果将为研究转录因子Oct4对其新靶基因IL-31的表达调控机理提供理论基础，将为Oct4和IL-31应用于皮肤炎症等疾病的治疗中奠定必要基础。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学及基因工程领域，具体涉及Oct4在调控IL-31基因 表达中的应用。

背景技术

白细胞介素31(Interleukin31，IL-31)是由Dillon等于2004年发现的具有 4个螺旋结构的多肽链细胞因子，归类于白细胞介素6细胞因子家族，主要由活 化的CD⁴⁺Th2细胞产生。人的IL-31基因位于12q24.31，含有904bp，开放阅 读框为495bp，编码一条由164个氨基酸残基组成的多肽链，成熟的IL-31蛋白 质含有141个氨基酸。IL-31通过与IL-31RA和OSMRβ两个亚基组成的异源二 聚体复合物结合，从而激活JAK-STAT、MAPK、PI3K/AKT三条信号通路，发 挥生物学功能。IL-31的受体主要分布于上皮细胞、淋巴细胞、支气管和皮肤等 组织中，所以目前关于IL-31的研究主要集中于IL-31在皮肤炎症反应中的作用。

Oct4又称为Oct3或Oct3/4，属于POU转录因子家族中的成员，由Pou5f1 基因编码，主要在胚胎干细胞及生殖干细胞中表达，维持胚胎干细胞的自我更 新和多分化潜能。人Oct4基因位于第6号染色体上(6p21.31)，含有16.4kb。 Oct4具有不同的亚型(Isoforms)，其中Isoform1是具有功能的Oct4亚型，具 有5个外显子，4个内含子，翻译的蛋白质含有一个保守的DNA结合结构域(POU 结合域)，能与含八聚体基序(Octamermotif)的DNA结合从而调控下游靶基 因的转录。目前关于Oct4的靶基因研究的比较多，大多数是多分化潜能有关的 基因，如：Nanog和Sox2等。在细胞分化的过程中Oct4的表达逐渐下调，在完 全分化的细胞中基本检测不到Oct4的表达，然而最近发现很多成体干细胞也表 达Oct4。间充质干细胞(Mesenchymalstemcells，MSCs)是成体干细胞中的一 种，来源于多种组织，如：骨髓、脐带和脂肪组织等。最近很多文章报道Oct4 也能促进MSCs的自我更新和多向分化潜能，但其分子调控机制目前还不清楚。 在MSCs中Oct4可以直接调控其靶基因MBD6、Dnmt1和CD49f等的表达，从 而促进MSCs的自我更新和多向分化潜能。但Oct4是否对IL-31基因表达起调 控作用目前还不清楚。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供Oct4在调控IL-31基 因表达中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：Oct4在调控IL-31基因表达中的应 用，该技术方案的提出是基于本发明发明人首次发现转录因子Oct4在MSCs内 对IL-31表达有调节作用。

所述的IL-31基因的核苷酸序列如下所示：

ATGGCCTCTCACTCAGGCCCCTCGACGTCTGTGCTCTTTCTGTTCTGCTGCCTGGGAGGCTGGCTGGCCTCCCACA CGTTGCCCGTCCGTTTACTACGACCAAGTGATGATGTACAGAAAATAGTCGAGGAATTACAGTCCCTCTCGAAGATGCTT TTGAAAGATGTGGAGGAAGAGAAGGGCGTGCTCGTGTCCCAGAATTACACGCTGCCGTGTCTCAGCCCTGACGCCCAGCC GCCAAACAACATCCACAGCCCAGCCATCCGGGCATATCTCAAGACAATCAGACAGCTAGACAACAAATCTGTTATTGATG AGATCATAGAGCACCTCGACAAACTCATATTTCAAGATGCACCAGAAACAAACATTTCTGTGCCAACAGACACCCATGAA TGTAAACGCTTCATCCTGACTATTTCTCAACAGTTTTCAGAGTGCATGGACCTCGCACTAAAATCATTGACCTCTGGAGC CCAACAGGCCACCACTTAA。

所述的Oct4在调控IL-31基因表达中的应用，是Oct4蛋白能够与IL-31基 因的启动子特异性结合，并能够活化IL-31基因的转录。

所述调控为正调控。

从而，所述的Oct4在调控IL-31基因表达中的应用，是将Oct4蛋白或是能 表达Oct4的核酸序列制备成活化IL-31基因转录的药物。

所述的Oct4在调控IL-31基因表达中的应用，是将Oct4蛋白或是能表达 Oct4的核酸序列制备成治疗皮肤炎症的药物。

所述的核酸序列为DNA序列。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明是本发明首次发现 转录因子Oct4在MSCs内对其新靶基因IL-31表达有调节作用而提出的。本发 明采用染色质免疫共沉淀和双荧光素酶报告基因系统方法证明了在MSCs内转 录因子Oct4能够与IL-31基因的启动子特异性结合，并能够活化IL-31基因的 转录。本发明揭示了转录因子Oct4对其新靶基因IL-31表达的调控机制，并为 将Oct4和IL-31应用于皮肤炎症等疾病的治疗中奠定必要基础。

附图说明

图1是本发明实施例1中将含有Oct4、shOct4和空质粒的慢病毒分别感染 UC-MSCs后采用RT-PCR方法确认IL-31表达的结果图。

图2是本发明实施例2中采用CHIP(染色质免疫共沉淀)方法证实在不同 代数的UC-MSCs中，Oct4与IL-31基因的启动子DNA结合的结果图；其中， *P<0.01相对于各自的对照抗体；P3、P6、P9分别代表UC-MSCs培养传代至 第3代、第6代、第9代。

图3是本发明实施例3中采用双荧光素酶报告基因系统检测Oct4在 UC-MSCs中对IL-31基因表达调控作用的结果图；其中，*P<0.01相对于各自 的空质粒的对照。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步的详细描述，但不用来限制本发 明的范围。若未特别指出，实施例均参照常规实验条件，或者参照试剂盒制造 厂商的说明书进行。实施例中所用到的工程菌、细胞株均为商业化的菌株或细 胞株。大肠杆菌感受态细胞的制备按照《分子克隆》进行制备。

实施例1采用RT-PCR方法确认转录因子Oct4对IL-31基因表达的影响。

(1)Oct4和shOct4慢病毒表达载体的构建。

1)Oct4基因引物的设计。

用Primer5.0软件设计扩增Oct4基因开放阅读框的引物，引物两端酶切位 点分别为XhoⅠ和NcoⅠ，引物由上海生工生物有限公司合成，引物的序列如下：

Oct4正向引物：5’-CCGCTCGAGAGGATGGCGGGACACCTGGCTT-3’

Oct4反向引物：5’-CATGCCATGGAAGGGCAGGCACCTCAGTTTG-3’。

2)扩增Oct4基因。

以人胚胎干细胞的cDNA(购自上海斯丹赛生物技术有限公司)为模板扩增 Oct4基因。

PCR扩增的反应体系如下：

PCR扩增的反应条件如下：

3)Oct4基因的回收。

将上述PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，并用GelExtractionKit(Omega) 对PCR产物回收，实验步骤对试剂盒说明书略有改动，步骤如下：

A、用手术刀片切下含有目的DNA片段的琼脂糖胶，尽量切除DNA片段 周围多余的琼脂糖胶以减少凝胶体积。

B、将凝胶块置于1.5ml微量离心管中，加入与凝胶等体积的Bindingbuffer (×p2)。将混合物置于50-55℃，7min，直到凝胶完全溶解。

C、将HiBindDNA离心柱置于随附的2ml收集管中，将700μlDNA/琼脂 糖溶液加至HiBindDNA离心柱，室温下，10,000×g离心1min。

D、弃去液体，将HiBindDNA离心柱重新放回相同的收集管。向HiBindDNA 离心柱中加入300μlBindingbuffer(×p2)，室温下，10,000×g离心1min，洗 HiBindDNA离心柱。弃去流出液并重新使用收集管。

E、加入700μl无水乙醇稀释的洗涤缓冲液洗涤HiBindDNA离心柱。室温 下10,000×g离心1min。

F、弃去液体并最大转速空柱离心2min以干燥离心柱基膜。

G、将HiBindDNA离心柱置于干净的1.5ml离心管。向离心柱基膜中间滴 加15-30μl洗脱缓冲液，室温放置1min后以13,000g离心1min洗脱DNA。

4)Oct4基因表达载体的构建。

将回收的Oct4DNA片段和pGL3-Basic真核表达载体(Promega公司)经 过XhoⅠ和NcoⅠ双酶切处理，用T4DNA连接酶将双酶切后的Oct4DNA片段 克隆至经双酶切的pGL3-Basic真核表达载体中，然后转染大肠杆菌DH5α感受 态细胞，使用正向引物和反向引物对克隆进行筛选，将筛选得到的阳性克隆送 去测序，DNA测序表明序列正确，命名为pGL3-Oct4。

5)Oct4慢病毒质粒的构建。

使用XhoⅠ单酶切pGL3-Oct4及慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1(购买于 汉恒生物科技有限公司)，使用T4DNA连接酶将经过XhoⅠ单酶切后的Oct4 DNA片段克隆入XhoⅠ单酶切线性化慢病毒转移质粒pLVX-IRES-ZsGreen1，然 后转染大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过限制性内切酶NcoⅠ单酶切初步鉴定重 组质粒，将鉴定正确的克隆送上海生工生物有限公司进行DNA测序，命名为 pLVX-Oct4-ZsGreen1。将测序正确的克隆大量提取质粒以备转染用。

6)shOct4慢病毒质粒的构建。

在上海生工生物有限公司合成Oct4shRNA颈环结构对应的DNA序列(含 有XhoⅠ和NcoⅠ酶切位点)，使用XhoⅠ单酶切Oct4shRNA颈环结构对应的 DNA序列及慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1，使用T4DNA连接酶将Oct4 shRNA颈环结构对应的DNA序列克隆入线性化慢病毒质粒载体 pLVX-IRES-ZsGreen1，命名为pLVX-shOct4-ZsGreen1。

Oct4shRNA颈环结构对应的DNA序列如下：

5’-CTCGAGCCCTCACTTCACTGCACTGCCATTG-3’。

(2)将含有目的基因的慢病毒转染UC-MSCs。

1)慢病毒的制备。

A、接种人肾上皮细胞系293T细胞(购自上海酶研生物科技有限公司)于 多聚赖氨酸处理的100mm培养皿中，当细胞融合度达到80％时换液，将三质粒 (pspax2，pMD2G，pLVX-Oct4-ZsGreen1或者pLVX-shOct4-ZsGreen1)共转染 293T细胞，培养6h后更换培养基；pspax2和pMD2G购买于优宝生物；

B、转染48h后收集病毒上清液，于4℃、4000r/min离心10min；收集离 心后的上清液并过滤；

C、4℃、25000r/min离心2h后用无血清培养液溶解病毒沉淀；

D、使用有限稀释法测定病毒滴度，分装保存于-80℃冰箱中备用。

2)慢病毒的转染。

将脐带间充质干细胞(UC-MSCs，上海拜力生物科技有限公司)接种于六 孔板中，当单层细胞生长密度达到80％～90％时加入1ml步骤1)得到的慢病 毒颗粒(滴度为6×10⁷TU/ml)，并加入聚凝胺至终浓度为8μg/ml以促进病毒 吸附。按照以下3组进行转染：对照为转染空质粒的UC-MSCs，Oct4为转染 Oct4质粒(即pLVX-Oct4-ZsGreen1)的UC-MSCs，shOct4为转染Oct4shRNA 的UC-MSCs(即pLVX-shOct4-ZsGreen1)。

(3)RT-PCR方法检测IL-31基因表达。

1)抽提细胞总RNA。

转染72小时后，分别从上述3组UC-MSCs中抽提细胞总RNA，按E.Z.N.A. TotalRNAKitI试剂盒(购自广州飞扬生物有限公司)使用步骤完成。

2)总RNA反转录得到cDNA。

反转录试剂盒购自大连宝生物工程有限公司，反转录体系如下：

70℃上加热10min后迅速置冰上至少2min。接着在上述混合液中加入如下 体系的混合液10μl，42℃保温1h，70℃保温15min，得到cDNA。

3)PCR检测IL-31的表达。

扩增IL-31的引物序列如下：

IL-31上游引物：5’-CACGTTGCCCGTCCGTTTA-3’；

IL-31下游引物：5’-TTTAGTGCGAGGTCCATG-3’。

PCR扩增的反应体系如下：

PCR扩增的反应条件如下：

最后对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定并拍照。

实验结果显示：UC-MSCs能够表达IL-31mRNA，Oct4基因能够增加IL-31 的表达，shOct4通过降解细胞内源性Oct4mRNA，导致细胞内IL-31表达的降 低(图1)。

实施例2采用CHIP(染色质免疫共沉淀)方法鉴定在不同代数的MSCs 中Oct4与IL-31基因的启动子结合情况。

实验步骤按CHIP试剂盒说明书进行，略有改动，CHIP试剂盒购自武汉艾 美捷科技有限公司

(1)将不同代数的UC-MSCs(P3、P6、P9)分别经过1％甲醛交联固定， 室温下放置10min，用甘氨酸溶液中止反应；

(2)然后用预冷的PBS洗涤细胞两次，离心去上清后加入1ml含蛋白酶 抑制剂的SDS裂解液裂解细胞；

(3)超声断裂细胞裂解液中的染色质DNA，采用蛋白G磁珠去除非特异 性结合的DNA片段；

(4)在剩余上清液中加入抗Oct4抗体，加入小鼠IgG抗体作为阴性对照；

(5)加入蛋白G磁珠，收集蛋白G磁珠/抗Oct4抗体/Oct4/DNA片段的 复合物；

(6)经过解交联后获得游离DNA片段，用DNA纯化柱回收DNA片段。

(7)然后以回收的DNA为模板，采用Real-timePCR的方法扩增IL-31基 因的启动子片段，IL-31启动子上下游引物用Primer5.0软件设计，由上海生工 生物公司合成，引物的序列如下：

IL-31启动子上游引物：5’-CGCTGACTGCTCTTTCTCCT-3’；

IL-31启动子下游引物：5’-GGGGGTAGTGCTTCCAGAAT-3’。

Real-timePCR反应体系如下：

Real-timePCR反应程序如下：

(8)用ΔΔCt值进行相对定量。

实验结果显示：采用抗Oct4抗体沉淀的UC-MSCs的染色质DNA片段中， 能特异性地扩增出含有Oct4结合位点的IL-31基因启动子片段，采用正常小鼠 IgG抗体作为阴性对照组则不能扩增此片段。随着UC-MSCs传代数增加，PCR 扩增量也减少。此结果表明：Oct4能够与IL-31基因启动子结合，从而调节IL-31 的表达，IL-31是Oct4的新靶基因(图2)。

实施例3采用双荧光素酶报告基因系统检测Oct4对IL-31基因表达的调控 作用。

(1)构建含IL-31启动子的质粒。

1)合成含有XhoI(tcgag)和HindIII(agctt)酶切位点的IL-31启动子 DNA，模板链(正义链)的序列如下：

5’-GCTCGAGAGGCGAACACATCTGGCTCCAAGCTTCG-3’。

2)将IL-31启动子DNA和pGL3-Luciferase质粒(Promega)分别进行XhoI 和HindIII双酶切，IL-31启动子DNA双酶切条件如下：

pGL3-Luciferase质粒双酶切条件如下：

3)37℃酶切过夜后，于1％琼脂糖凝胶电泳，并分别回收酶切后的IL-31 启动子DNA和pGL3-Luciferase质粒；

4)将IL-31启动子双酶切回收产物连接到pGL3-Luciferase双酶切回收产物 内，得到重组的pGL3-IL-31启动子-Luciferase质粒。16℃连接2h，连接体系如 下：

5)将此重组的pGL3-IL-31启动子-Luciferase质粒转化大肠杆菌DH5α感受 态细胞，获得DH5α重组克隆，挑取一些克隆进行阳性鉴定，将挑选的阳性克 隆于上海生工生物公司进行测序。测序结果显示其核苷酸序列全部正确，得到 pGL3-IL-31启动子-Luciferase。

(2)双荧光素酶报告基因系统检测Oct4对IL-31基因表达的调控作用。

1)将含有Oct4、shOct4和空质粒的慢病毒分别转染至UC-MSCs，同时转 入萤火虫荧光素酶质粒pGL3-IL-31启动子-Luciferase和海肾荧光素酶质粒 pGL4-Renilla(pGL3-Luciferase和pGL4-Renilla购买于广州佰路生物技术有限公 司)，pGL4-Renilla作为转染效率内参对照。采用不含有IL-31启动子的质粒 pGL3-Luciferase作为对照。

2)24h后分别收集转染细胞，用被动裂解液(Promega公司)裂解细胞， 使用Promega公司的双荧光素酶报告基因分析试剂盒和GloMax2/20发光检测仪 测定荧光值。结果代表萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶活性比率的平均值。

实验结果显示：在UC-MSCs内转录因子Oct4能够与IL-31基因的启动子 结合，从而促进萤火虫荧光素酶的表达。shOct4通过降解细胞内源性Oct4 mRNA，从而抑制萤火虫荧光素酶的表达(图3)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实 施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、 替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。