miR-126-3p在猪卵巢颗粒细胞中的应用

摘要

本发明公开一种miR-126-3p在猪卵巢颗粒细胞中的应用，属于细胞工程和基因工程技术领域。本发明以miR-126-3p为研究对象，采用了细胞生物学方法研究其在猪卵巢颗粒细胞中的应用。本发明第一次证实miR-126-3p、PIK3R2在猪卵巢颗粒细胞中的应用，以及在猪卵巢颗粒细胞中miR-126-3p与基因PIK3R2和TSC1之间的靶向关系；补充外源干扰的PIK3R2和TSC1能够回复由miR-126-3p引起的细胞功能表型，进一步表明PIK3R2和TSC1在颗粒细胞中是miR-126-3p的一个重要功能靶标，miR-126-3p可以通过PIK3R2和TSC1来调节颗粒细胞的发育。

说明书

技术领域

本发明属于细胞工程和基因工程技术领域，具体涉及一种miR-126-3p在猪卵巢颗粒细胞中的应用。

背景技术

在商品猪肉生产中，母猪的利用年限直接关系到猪场的经济效益。影响母猪利用年限的因素主要有繁殖障碍、自然环境、品种、营养、疾病等，其中繁殖障碍是导致母猪过早从猪群中淘汰的最主要原因之一。在母猪繁殖障碍中卵巢的疾病是一个重要诱因。

卵巢是哺乳动物重要的生殖腺，是卵泡发育和排卵的重要繁殖器官。卵泡作为卵巢的基本组成单位，维持着卵子的存在、发育与闭锁。颗粒细胞是卵泡周围扁平或立方状细胞，其生长与分化在卵泡的发育过程中起着重要的调控作用。雌性哺乳卵巢中仅有少数卵泡能够发育成熟并排卵，而绝大部分卵泡在发育的各个阶段发生闭锁退化，其重要且直接原因来自于颗粒细胞的凋亡。颗粒细胞的凋亡是启动卵泡闭锁的重要机制。

MicroRNAs(miRNAs)是在真核生物中发现的一类内源的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20～25个核苷酸。它主要通过与靶基因mRNA的3′端非翻译区(UTR)完全或不完全配对而降解靶mRNA或抑制mRNA的正常翻译，进而对基因转录后表达进行调控。近年来，关于哺乳动物卵巢发育的miRNA调控也受到研究者关注，多项研究表明miRNA广泛参与卵子发生、卵泡发育、闭锁和黄体形成、退化等多个生物学过程。MiRNA还参与一些卵巢疾病的调控，主要有卵巢癌和卵巢早衰。

本发明前期研究中，通过Solexa高通量测序技术，鉴定不同发育时期(3月龄青年母猪，3胎龄母猪，繁殖障碍母猪)母猪卵巢组织miRNA表达谱，其中miR-126-3p呈显著差异表达，推测其可能在颗粒细胞中发挥重要调控作用。

目前研究中，由于miRNA与靶基因之间的关系是多对多，且动物的一种表型变化，很难通过一个miRNA和其靶基因调控来控制，基本很难进行活体猪个体水平验证；另外，在没有较高把握成功的实验情况下，用猪做活体实验的成本太高。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种miR-126-3p在猪卵巢颗粒细胞中的应用。

通过基因工程技术改变该miRNA在颗粒细胞的表达量，进而影响其对颗粒细胞的凋亡；通过生物信息学软件预测该miRNA靶基因，研究靶基因的功能，来达到该miRNA在猪卵巢颗粒细胞中应用的目的。

本发明的另一目的在于提供所述的miR-126-3p的靶基因。

本发明的再一目的在于通过所述的靶基因的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供一种miR-126-3p在猪卵巢颗粒细胞中的应用。

所述的miR-126-3p的靶基因为PIK3R2和TSC1。

所述的靶基因PIK3R2和TSC1在猪卵巢颗粒细胞中的应用。

在颗粒细胞中补充外源干扰的靶基因PIK3R2和TSC1后，能回复由miR-126-3p引起的细胞功能表型。

所述的miR-126-3p的序列为5′-UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG-3′；

本发明的验证结果如下：

1、制备miR-126-3p模拟物(mimic)和抑制剂(inhibitor)及检测转染效率。在颗粒细胞中转染miR-126-3pmimic和miR-126-3pinhibitor，通过qRT-PCR手段，检测其转染效率，其中分别转染浓度为50nM的miR-126-3pmimics，以及100nM的miR-126-3pinhibitor后，相对于各自转染的对照组NC，实验组的转染效率分别能达到超表达2000多倍和抑制10多倍。

2、通过转染达上述效率的miR-126-3pmimic和miR-126-3pinhibitor后，检测标记基因的表达量，以及颗粒细胞凋亡的变化。通过qRT-PCR手段，检测miR-126-3p介导的凋亡标记基因的表达，发现过表达miR-126-3p(即转染miR-126-3pmimic)抑制了促凋亡标记基因Caspase-3的表达，促进了抑凋亡标记基因BCL2的表达。并通过AnnexinV-FITC法检测miR-126-3p对颗粒细胞凋亡影响，结果显示过表达miR-126-3p抑制颗粒细胞凋亡，而抑制miR-126-3p促进颗粒细胞凋亡。

3、生物信息学软件预测猪miR-126-3p的靶基因，实验证实其靶基因为PIK3R2和TSC1。TargetScan、MiRanda、RNAhybrid3个生物信息学软件预测miR-126-3p靶基因，运用KOBAS2.0软件，对预测的靶基因进行作用通路分析，发现其靶向PI3K(磷脂酰肌醇3-激酶)-AKT(丝氨酸蛋白激酶)通路中关键PIK3R2(磷酸酯酶基因)、TSC1(3-磷酸肌醇依赖激酶)基因，发现PIK3R2和TSC13′UTR中含有miR-126-3p序列结合位点，将PIK3R2和TSC1野生型3′UTR和含有种子序列突变的3′UTR构建到真核表达载体pmirGLO中，通过双荧光素酶报告分析，发现PIK3R2和TSC1野生型3′UTR上游报告基因受到miR-126-3p调控，而突变型不受miR-126-3p调控。还采用qRT-PCR和Westernblotting在转录水平和翻译水平验证miR-126-3p调控PIK3R2和TSC1的表达，发现miR-126-3p在转录及翻译水平下调PIK3R2表达，只在翻译水平下调TSC1表达。

4、合成3对靶基因PIK3R2和TSC1干扰小片段/对照(siRNA-PIK3R2，siRNA-TSC1/siRNA-NC)，筛选并检测其干扰效率。转染基因干扰小片段到颗粒细胞中，通过qRT-PCR手段，最终筛选干扰效果较好的siRNA-PIK3R2-1和siRNA-TSC1-3小片段进行后续实验。

5、PIK3R2和TSC1干扰小片段(siRNA-PIK3R2-1和siRNA-TSC1-3)转染颗粒细胞，研究靶基因PIK3R2和TSC1对猪卵巢颗粒细胞凋亡的应用。通过AnnexinV-FITC法检测PIK3R2和TSC1受到siRNA-PIK3R2-1和siRNA-TSC1-3小片段干扰后的颗粒细胞凋亡情况，发现PIK3R2和TSC1促进颗粒细胞凋亡。

6、miR-126-3p靶基因PIK3R2和TSC1功能回复验证。在颗粒细胞中补充外源干扰的靶基因PIK3R2和TSC1后，能否回复由miR-126-3p引起的细胞功能表型。颗粒细胞共转染miR-126-3pinhibitor/NC和PIK3R2和TSC1干扰小片段(siRNA-PIK3R2-1和siRNA-TSC1-3)/siRNA-NC，通过AnnexinV-FITC法检测颗粒细胞凋亡情况，发现，miR-126-3p引起的抑制颗粒细胞凋亡的功能能够被PIK3R2和TSC1回复。

本发明以miR-126-3p为研究对象，采用了细胞生物学方法研究其在猪卵巢颗粒细胞中的应用。关键点和欲保护点：(1)miR-126-3p在猪卵巢颗粒细胞凋亡中的应用；(2)在猪卵巢颗粒细胞中miR-126-3p与基因PIK3R2和TSC1靶向关系；(3)基因PIK3R2和TSC1在猪卵巢颗粒细胞凋亡中的应用；(4)通过靶基因回复实验，即在颗粒细胞中补充外源干扰的靶基因PIK3R2和TSC1后，验证能否回复由miR-126-3p引起的细胞功能表型。

颗粒细胞的凋亡是启动卵泡闭锁的重要机制，本发明第一次证实miR-126-3p、PIK3R2在猪卵巢颗粒细胞中的应用，以及在猪卵巢颗粒细胞中miR-126-3p与基因PIK3R2和TSC1之间的靶向关系；现在的发明关于靶基因功能回复实验仅有少量报道，出现这样的原因主要是一种表型的变化受到多方面的影响，并且miRNA与靶基因之间的关系是多对多，即一个miRNA可以靶向多个基因，一个基因也可以是多个miRNA的靶标，所以靶基因的回复实验很难得到结果，不过，本发明补充外源干扰的PIK3R2和TSC1能够回复由miR-126-3p引起的细胞功能表型，进一步表明PIK3R2和TSC1在颗粒细胞中是miR-126-3p的重要功能靶标，miR-126-3p可以通过PIK3R2和TSC1来调节颗粒细胞的发育。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

本发明设计周详，结果可靠。为证明miR-126-3p在颗粒细胞中的应用，本发明除了研究其自身功能以外还通过靶基因以及靶基因在颗粒细胞中的功能进行研究；本发明还通过靶基因回复实验，即在颗粒细胞中补充外源干扰的靶基因PIK3R2和TSC1后，验证能否回复由miR-126-3p引起的细胞功能表型。

附图说明

图1是qRT-PCR检测miR-126-3pmimic和miR-126-3pinhibitor转染效率的结果图。

图2是qRT-PCR检测miR-126-3p介导的细胞凋亡标记基因BCL2和Caspase-3的表达量的结果图；其中，图2A、图2B图表示的是BCL2的表达量；图2C、图2D图表示的是Caspase-3的表达量。

图3是AnnexinV-FITC法检测miR-126-3p调控颗粒细胞凋亡的结果图。

图4是验证miR-126-3p靶向PIK3R2；其中，图4A、图4B、图4C分别表示双荧光报告基因验证、qRT-PCR和Westernblotting验证。

图5是验证miR-126-3p靶向TSC1；其中，图5A、图5B、图5C分别表示双荧光报告基因验证、qRT-PCR和Westernblotting验证。

图6是qRT-PCR检测3对PIK3R2和TSC1干扰小片段干扰效率；其中，图6A表示PIK3R2干扰小片段干扰效率；图6B表示TSC1干扰小片段干扰效率。

图7是PIK3R2和TSC1干扰小片段调控颗粒细胞凋亡；图7A为PIK3R2干扰小片段调控结果；图7B为TSC1干扰小片段调控结果。

图8是PIK3R2回复miR-126-3p抑制颗粒细胞凋亡的结果。

图9是TSC1回复miR-126-3p抑制颗粒细胞凋亡的结果。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。

实施例1卵巢颗粒细胞的培养

(1)在屠宰场采集卵巢，用PBS或者生理盐水(含1％双抗)置于37℃保温瓶迅速运回实验室；

(2)将收集的卵巢在无菌培养室用预热过的PBS(含1％双抗)清洗3遍后，迅速转入超净工作台；用1mL无菌一次性注射器浅插入卵巢有腔卵泡中吸取卵泡液；

(3)吸取的卵泡液置于含有适量DMEM的15mL离心管中，1000rpm室温离心6min；

(4)弃去上清，再用DMEM重悬、离心，重复清洗细胞2次；配制DMEM完全培养基：89％DMEM+10％FBS+1％双抗；

(5)吸取细胞重悬液和完全培养基接种于75mL培养瓶；置于37℃，5％CO₂培养箱中静置培养。

所述的双抗为青霉素和链霉素。

实施例2卵巢颗粒细胞的接种和转染

(1)颗粒细胞长至90％左右，倒掉培养基，用预热的含1％双抗(所述的双抗为青霉素和链霉素)的PBS洗3遍；

(2)加入胰蛋白酶消化，放入培养箱3min左右，显微镜下观察至大部分细胞漂起，立即加入等量终止液终止消化；

(3)DMEM清洗2遍，期间1000rpm离心5min；

(4)用完全培养基轻轻重悬细胞沉淀，均匀分到每个孔中，用完全培养基补充体积，轻轻摇匀，放培养箱中培养；

(5)24h左右，观察颗粒细胞状态，待细胞汇合度达80％左右时准备转染；

(6)转染方法按Invitrogen公司的3000试剂盒说明书进

行；每组设置3个重复；

(7)转染后的孔板置于37℃，5％CO₂培养箱中培养；

(8)转染后1～3天，观察细胞状态，生长良好即可收集细胞。

实施例3qRT-PCR

本发明中基因和miRNA的qRT-PCR检测分别采用TaKaRa公司的SYBRPremixExTaq试剂盒和SYBRPrimeScriptmiRNART-PCRKit。实验采用比较Ct值法检测样品miRNA或基因的含量，具体计算公式如下：

基因相对表达量＝2^{-{〈﹙实验组目的基因Ct值﹚-﹙实验组内参基因Ct值﹚〉-〈﹙对照组目的基因Ct值﹚-﹙对照组内参基因Ct值﹚〉}}

其中的内参基因，对miRNA检测用U6做内参，对基因检测用GAPDH做内参，本发明所用到的qRT-PCR引物为：

qRT-PCR-BCL2Forward：5′-GAAACCCCTAGTGCCATCAA-3′；

Reverse：5′-GGGACGTCAGGTCACTGAAT-3′；

qRT-PCR-Caspase3Forward：5′-GACTGTGGGATTGAGACG-3′；

Reverse：5′-ACCCGAGTAAGAATGTGC-3′；

qRT-PCR-PIK3R2Forward：5′-GGCAAGATCAACCGCACACAAG-3′；

Reverse：5′-CACCACCACAGAGCAGGCAT-3′；

qRT-PCR-TSC1Forward：5′-GACCCATATCTATGCGGACCC-3′；

Reverse：5′-TGCTGGTACTGAAGCGGTTG-3′；

qRT-PCR-GAPDHForward：5′-ACGCCTGCCCTGTGTCCCAA-3′；

Reverse：5′-GAAGCACGCCCTCTCGCCTC-3′；

qRT-PCR-U6Forward：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；

Reverse：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；

细胞的总RNA提取参照Takara公司TRIzol操作说明书，具体提取步骤如下：

(1)颗粒细胞直接加入TRIzol；

(2)室温下放置10min以充分裂解细胞，12000g离心5min，弃沉淀吸上清于新RNase-free管中；

(3)加入0.2mL氯仿(每1mLTRIzol)剧烈震荡15～30s，室温下放置5min后4℃12000g离心15min；

(4)吸取上层水相置于新RNase-freeEP管中；

(5)加入0.5mL异丙醇(每1mLTRIzol)，轻轻地上下颠倒混匀后在室温放置10min，4℃12000g离心10min；

(6)弃上清后置于室温，沿管壁加入1mL75％乙醇-DEPC(每1mLTRIzol)以洗涤RNA，4℃12000g离心5min后尽量弃上清；

(7)真空干燥5～10min，注意避免RNA沉淀干燥过度；

(8)加入DEPC水以溶解RNA沉淀。

mRNA和miRNA反转录PCR分别采用Thermo公司的ThermoScientificRevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit和TOYOBO公司ReverTraAceqPCRRTKit。

实施例4WesternBlotting

(1)单层贴壁细胞总蛋白的提取：倒掉细胞培养液，加入适量预冷的PBS洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。6孔板细胞每孔加入100～200μL蛋白裂解液和10μL100mM的PMSF，裂解细胞30min。收集细胞裂解液移至1.5mL离心管中，4℃14000rpm离心5min。取部分上清加入上样buffer，煮沸10min。缓慢恢复室温后，稍离心，放于-20℃保存；

(2)SDS-PAGE电泳：BCA法蛋白样品初步定量后，每组取20μg总蛋白和5×上样缓冲液按5:1混合，煮沸5min。SDS-PAGE电泳至溴酚蓝刚出胶底部止；

(3)蛋白质转移：PVDF膜甲醇预处理3～5s，放至转印液浸润30min。取出凝胶，将其放至滤纸上，形成凝胶转印堆积层“三明治”结构。此操作必须将气泡完全去除。100V恒压60～120min；

(4)免疫印记：取出杂交膜，TBST漂洗5min，重复三次。5％脱脂奶粉溶液室温封闭90min，TBST漂洗5min，重复三次。加入PIK3R2和TSC1一抗(PIK3R2一抗：PIK3R2/p85Beta，购自LSBio公司；TSC1一抗：Hamartin，购自biorbyt公司)(1:2000)4℃孵育过夜，TBST洗膜5min，三次。加入二抗稀释液(二抗：辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)，购自碧云天公司)(1:10000)室温孵育1h，TBST洗膜5min，三次。蒸馏水漂洗膜2min，三次。擦干PVDF膜上的液体，加入化学发光剂放于一胶片上，放入X射线暗盒置于暗房。在暗房内打开暗盒，放入胶片，5min后打开暗盒，拿出胶片。采用ImagePlus软件分析胶片中的蛋白条带。

实施例5颗粒细胞凋亡检测

本发明中AnnexinV-FITC技术检测细胞凋亡，参照BioVision公司AnnexinV-FITCApoptosisDetectionKit操作说明书，具体操作步骤如下：

(1)将细胞培养板放置在室温，用2mLPBS溶液轻轻润洗培养板内细胞，去除PBS溶液；

(2)加入不含EDTA的胰酶消化细胞，将细胞轻轻重悬于步骤(1)中的培养基使其密度大约为1×10⁶细胞/mL；

(3)将0.5mL细胞悬液从细胞培养板中(约5×10⁵个细胞)转移到一个干净的离心管内，加入500μL1×BindingBuffer；

(4)加5μLAnnexinV-FITC和室温5μLpropidiumiodide；

(5)室温避光反应5min；

(6)立即用FACSCalibur流式细胞仪检测分析(每组三个重复)。

实施例6荧光素酶报告基因活性检测

荧光素酶报告基因活性检测，参照Promega公司的Dual-LuciferaseReporterAssaySystem试剂盒，具体操作步骤如下：

(1)转染48h后，吸去旧的培养基，用PBS清洗两次，每孔细胞加入100μL的GloLysisBuffer，室温轻微振摇5min，收集细胞裂解液；

(2)将30μL细胞裂解液加入96孔发光板后，在其中加入75μLDual-LuciferaseAssayReagent，混匀后在20～25℃静置15～30min。在BioTek公司Synergy2多功能酶标仪上检测发光值，对应于萤火虫荧光素酶的表达水平；

(3)再加入75μLStop&Reagent试剂，混匀后在20～25℃静置15～30min。检测发光值，对应于海肾荧光素酶的表达水平；

(4)萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶表达量的比值为萤火虫荧光素酶相对活性，即为对应靶基因活性(三个重复)。

结果分析：

1、制备miR-126-3p模拟物(mimic)和抑制剂(inhibitor)及检测转染效率。在颗粒细胞中转染miR-126-3pmimic和miR-126-3pinhibitor，通过qRT-PCR手段，检测其转染效率，其中分别转染浓度为50nM的miR-126-3pmimics，以及100nM的miR-126-3pinhibitor后，相对于各自转染的对照组NC，实验组的转染效率分别能达到超表达2000多倍和抑制10多倍。结果如图1所示。

2、通过转染上述效率的miR-126-3pmimic和miR-126-3pinhibitor后，检测标记基因的表达量，以及颗粒细胞凋亡的变化。通过qRT-PCR手段，检测miR-126-3p介导的凋亡标记基因的表达，发现过表达miR-126-3p(即转染miR-126-3pmimic)抑制了促凋亡标记基因Caspase-3的表达，促进了抑凋亡标记基因BCL2的表达；结果如图2所示。并通过AnnexinV-FITC法检测miR-126-3p对颗粒细胞凋亡影响，结果显示过表达miR-126-3p抑制颗粒细胞凋亡，而抑制miR-126-3p促进颗粒细胞凋亡；结果如图3所示。

3、生物信息学软件预测猪miR-126-3p的靶基因，实验证实发现其靶基因为PIK3R2和TSC1。TargetScan、MiRanda、RNAhybrid3个生物信息学软件预测miR-126-3p靶基因，运用KOBAS2.0软件，对预测的靶基因进行作用通路分析，发现其靶向PI3K(磷脂酰肌醇3-激酶)-AKT(丝氨酸蛋白激酶)通路中关键PIK3R2(磷酸酯酶基因)、TSC1(3-磷酸肌醇依赖激酶)基因，发现PIK3R2和TSC13′UTR中含有miR-126-3p序列结合位点，将PIK3R2和TSC1野生型3′UTR和含有种子序列突变的3′UTR构建到真核表达载体pmirGLO中，通过双荧光素酶报告分析，发现PIK3R2和TSC1野生型(PIK3R2-WT和TSC1-WT)3′UTR上游报告基因受到miR-126-3p调控，而突变型(PIK3R2-MUT和TSC1-MUT)不受miR-126-3p调控。还采用qRT-PCR和Westernblotting在转录水平和翻译水平验证miR-126-3p调控PIK3R2和TSC1的表达，发现miR-126-3p在转录及翻译水平下调PIK3R2表达，只在翻译水平下调TSC1表达。结果如图4和图5所示。

4、合成3对靶基因PIK3R2和TSC1干扰小片段/对照(siRNA-PIK3R2，siRNA-TSC1/siRNA-NC)，筛选并检测其干扰效率。结果如图6所示。转染基因干扰小片段到颗粒细胞中，通过qRT-PCR手段，最终筛选干扰效果较好的siRNA-PIK3R2-1和siRNA-TSC1-3小片段进行后续实验。

siRNA-PIK3R2-1：5′-GGAGAAGUUACUUCAGGAA-3′；

siRNA-PIK3R2-2：5′-GGAACAACAAGCUGAUCAA-3′；

siRNA-PIK3R2-3：5′-GGUAUGUAGGCAAGAUCAA-3′；

siRNA-TSC1-1：5′-GCUGGAGAUCUUAGAUUUA-3′；

siRNA-TSC1-2：5′-GCUUCGACUCUCCCUUCUA-3′；

siRNA-TSC1-3：5′-CCACGUGACAGAAAUCUAU-3′；

上述干扰小片段由广州市锐博生物科技有限公司合成；对照siRNA-NC来自广州市锐博生物科技有限公司。

5、PIK3R2和TSC1干扰小片段(siRNA-PIK3R2-1和siRNA-TSC1-3)转染颗粒细胞，研究靶基因PIK3R2和TSC1对猪卵巢颗粒细胞凋亡的应用。通过AnnexinV-FITC法检测PIK3R2和TSC1受到siRNA-PIK3R2-1和siRNA-TSC1-3小片段干扰后后颗粒细胞凋亡情况，发现PIK3R2和TSC1促进颗粒细胞凋亡。结果如图7所示。

6、miR-126-3p靶基因PIK3R2和TSC1功能回复验证。在颗粒细胞中补充外源靶基因PIK3R2和TSC1后，能否回复由miR-126-3p引起的细胞功能表型，颗粒细胞共转染miR-126-3pinhibitor/NC和PIK3R2和TSC1干扰小片段(siRNA-PIK3R2-1和siRNA-TSC1-3)/siRNA-NC，通过AnnexinV-FITC法检测颗粒细胞凋亡情况，发现，miR-126-3p引起的抑制颗粒细胞凋亡的功能能够被PIK3R2和TSC1回复。结果如图8和图9所示。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。