一株高效阿特拉津降解菌及其应用以及筛选方法

摘要

本发明涉及一株高效阿特拉津降解菌及其应用以及筛选方法，该细菌为ZXY-2，属于节杆菌属（Arthrobacter），保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC？No.10937，保藏日期为2015年6月1日。本发明细菌能够以阿特拉津作为唯一碳氮源生长，其可以使初始浓度为100mg/L的阿特拉津在14h内完全降解。菌株Arthrobacter？sp.？ZXY-2最适的生长温度为30-35℃，最适的生长pH为8.0-9.0，最适的生长摇床转速为100-200r/min。该细菌可应用于阿特拉津农药污染的快速修复。

说明书

技术领域

本发明涉及环境微生物技术领域，具体而言，涉及一种用于降解阿特拉津的细菌、筛选方法及其应用。

背景技术

我国作为农业大国，农药的施用量逐年增加。近年来，由于人们不合理的使用农药，加之农药的难生化降解特性，农药常伴随着降水流入河流与土壤中，严重污染地表水与地下水。阿特拉津作为一种北方地区重要的除草剂，因广泛施用已对自然界动植物造成严重危害。如何高效降解污水中的阿特拉津是当前水污染处理领域的热点问题。为了获得稳定高效降解效果，采用微生物修复技术将阿特拉津分解为无毒或低毒物质具有着广泛的发展前景。其中，最为关键之处是筛选具有高效率降解阿特拉津的功能菌株。

发明内容

本发明目的在于提供一种用于降解阿特拉津的细菌及其筛选方法，为受阿特拉津污染地区的快速原位修复奠定理论基础。

为实现本发明目的，提供了以下技术方案：一株高效阿特拉津降解菌，其特征在于所述菌株为Arthrobactersp.ZXY-2，于2015年6月1日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCCNo.10937。

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

一株高效阿特拉津降解菌，其特征在于可应用于阿特拉津农药污染的水体的快速修复。

为实现本发明目的，提供一种高效阿特拉津降解菌筛选方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）取10g农药厂受污染土壤，加入100ml含有100mg/L阿特拉津的无机盐培养基的三角锥形瓶中，在30℃恒温摇床上150r/min驯化培养；每隔7天取驯化培养液接种至新鲜的含有100mg/L的阿特拉津无机盐培养基中，接种量为10%（v/v）；

（2）连续驯化培养30天后，将富集培养物分别稀释10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8和10^-9倍，各取0.1mL分别涂布于100mg/L阿特拉津固体平板上，置于30℃恒温培养箱中培养2-3天；

（3）挑取单菌落进行细菌纯化培养，重复3次以上直至平板上出现形态大小相同的单菌落；

（4）挑取步骤（3）中的单菌落划线至斜面固体培养基中培养2-3天后，4℃保存。

作为优选，无机盐培养基组成为：KH₂PO₄0.9g/L,Na₂HPO₄.12H₂O6.5g/L,蔗糖3g/L,MgSO₄.7H₂O0.2g/L,FeSO₄.7H₂O0.01g/L，以及1ml/L微量元素液，其中微量元素液为:CoCl₂.6H₂O0.1g,MnCl₂.4H₂O0.425g,ZnCl₂0.05g,NiCl₂.6H₂O0.01g,CuSO₄.5H₂O0.015g,Na₂MoO₄.2H₂O0.01g,Na₂SeO₄.2H₂O0.01g溶于1000ml蒸馏水中。

作为优选，斜面培养基为:KH₂PO₄0.9g/L,Na₂HPO₄.12H₂O6.5g/L,蔗糖3g/L,蛋白胨1g/L,酵母粉0.5g/L,NaCl1g/L,MgSO₄.7H₂O0.2g/L,FeSO₄.7H₂O0.01g/L,1ml/L微量元素液以及15-20g/L琼脂。

作为优选，无机盐固体培养基是在无机盐培养基中另加入琼脂15-20g/L。

作为优选，无机盐、斜面培养基初始pH为8.0。

作为优选，无机盐、斜面培养基高压蒸汽灭菌条件为121℃，15min。

本发明菌株为革兰氏阳性好氧短杆菌，长1.58μm，宽1.13μm，无鞭毛，无芽孢，菌株在无机盐固定培养基上生长，形成不透明的淡黄色菌落且边缘光滑。该细菌能够以阿特拉津作为唯一碳氮源生长，可以使初始浓度为100mg/L的阿特拉津在14h内完全降解。该菌株最适生长温度为30-35℃，最适pH为8.0-9.0，最适生长摇床转速为100-200r/min。

本发明菌株经16SrDNA鉴定，并将其结果通过Blast程序进行同源性比较，该菌株与ArthrobacterTBD185的同源性达99%。其序列如下：

ACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGATCCGGTGCTTGCGCCGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGTAACCTGCCCTTGACTCTGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACTCCTCATCGCATGGTGGGGGGTGGAAAGCTTTTTGTGGTTTTGGATGGACTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGTAGGGAAGAAGCCCTCTTTGGGGGTGACGGTACTTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCTGCTGTGAAAGACCGGGGCTCAACTCCGGTTCTGCAGTGGGTACGGGCAGACTAGAGTGCAGTAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCATGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGTTGGGCACTAGGTGTGGGGGACATTCCACGTTTTCCGCGCCGTAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATGGACCGGAAAGACCTGGAAACAGGTGCCCCGCTTGCGGCCGGTTTACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTCTATGTTGCCAGCGGTTCGGCCGGGGACTCATAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAAAGGGTTGCGATACTGTGAGGTGGAGCTAATCCCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCACGAAAGTTGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCGTGTGGGGGGAGCCGTCGAAGGTGG

本发明有益效果：本发明提供的阿特拉津降解菌株Arthrobactersp.ZXY-2能够以阿特拉津作为唯一碳氮源，为生物降解阿特拉津点源污染提高经济效益。本发明提供的阿特拉津降解菌株Arthrobactersp.ZXY-2能够将初始浓度为100mg/L的阿特拉津在14h内完全降解。

附图说明

图1为菌株Arthrobactersp.ZXY-2原子力显微镜图。

图2为菌株Arthrobactersp.ZXY-2生长曲线图。

图3为菌株Arthrobactersp.ZXY-2降解阿特拉津曲线图。

图4为菌株Arthrobactersp.ZXY-2在有无蔗糖条件下降解图。

图5为菌株Arthrobactersp.ZXY-2在不同温度下阿特拉津降解图。

图6为菌株Arthrobactersp.ZXY-2在不同pH值条件下阿特拉津降解图。

图7为菌株Arthrobactersp.ZXY-2在不同摇床转速条件下阿特拉津降解图。

图8为菌株Arthrobactersp.ZXY-2在不同初始阿特拉津浓度条件下降解图。

具体实施方式

实施例1:本发明菌株从长期施用阿特拉津的吉林化工有限公司农药厂土壤中筛选而来，其筛选方式按以下步骤实现。

（1）取10g吉林化工有限公司农药厂受污染土壤，加入100ml含有100mg/L阿特拉津的无机盐培养基（pH=8）的三角锥形瓶中，在30℃恒温摇床上150r/min驯化培养。每隔7天取驯化培养液接种至新鲜的含有100mg/L的阿特拉津无机盐培养基中，接种量为10%（v/v）；

（2）连续驯化培养30天后，将富集培养物分别稀释10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8和10^-9倍，各取0.1mL分别涂布于100mg/L阿特拉津固体平板上，置于30℃恒温培养箱中培养2-3天；

（3）挑取单菌落进行细菌纯化培养，重复3次以上直至平板上出现形态大小相同的单菌落；

（4）挑取步骤（3）中的单菌落划线至斜面固体培养基中培养2-3天后，4℃保存。

其中，无机盐培养基组成为：KH₂PO₄0.9g/L,Na₂HPO₄.12H₂O6.5g/L,蔗糖3g/L,MgSO₄.7H₂O0.2g/L,FeSO₄.7H₂O0.01g/L，以及1ml/L微量元素液。

微量元素液为:CoCl₂.6H₂O0.1g,MnCl₂.4H₂O0.425g,ZnCl₂0.05g,NiCl₂.6H₂O0.01g,CuSO₄.5H₂O0.015g,Na₂MoO₄.2H₂O0.01g,Na₂SeO₄.2H₂O0.01g溶于1000ml蒸馏水中。

斜面培养基为:KH₂PO₄0.9g/L,Na₂HPO₄.12H₂O6.5g/L,蔗糖3g/L,蛋白胨1g/L,酵母粉0.5g/L,NaCl1g/L,MgSO₄.7H₂O0.2g/L,FeSO₄.7H₂O0.01g/L,1ml/L微量元素液以及15-20g/L琼脂。

无机盐固体培养基是在无机盐培养基中另加入琼脂15-20g/L

以上培养基均在121℃，高压灭菌15分钟后使用。

该菌株为革兰氏阳性好氧菌，无鞭毛，无芽孢，菌株在无机盐固定培养基上生长，形成不透明的淡黄色菌落且边缘光滑。

该菌株透射电镜图如图1所示，为短杆菌，长1.58μm，宽1.13μm。

实施例2：

使用DNA提取试剂盒（Sangon）按照提取步骤提取细菌DNA，而后进行PCR目的片段扩增，PCR反应条件为：94℃预变性5min，再经30个循环的94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，再72℃延伸5min。PCR扩增产物送至大连宝生物公司测序。该菌株经16SrDNA鉴定，并将其结果通过Blast程序进行同源性比较，该菌株与ArthrobacterTBD185的同源性达99%。其序列如下：

ACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGATCCGGTGCTTGCGCCGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGTAACCTGCCCTTGACTCTGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACTCCTCATCGCATGGTGGGGGGTGGAAAGCTTTTTGTGGTTTTGGATGGACTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGTAGGGAAGAAGCCCTCTTTGGGGGTGACGGTACTTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCTGCTGTGAAAGACCGGGGCTCAACTCCGGTTCTGCAGTGGGTACGGGCAGACTAGAGTGCAGTAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCATGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGTTGGGCACTAGGTGTGGGGGACATTCCACGTTTTCCGCGCCGTAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATGGACCGGAAAGACCTGGAAACAGGTGCCCCGCTTGCGGCCGGTTTACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTCTATGTTGCCAGCGGTTCGGCCGGGGACTCATAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAAAGGGTTGCGATACTGTGAGGTGGAGCTAATCCCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCACGAAAGTTGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCGTGTGGGGGGAGCCGTCGAAGGTGG

实施例3：

挑取4℃斜面保存细菌Arthrobactersp.ZXY-2一环至100mg/L阿特拉津液体培养基中培养至10⁸MPN/ml时，按照5%（v/v）的接菌量将细菌悬液接种至新鲜的无机盐液体培养基中，接种后置于30℃，150r/min的摇床中培养。其中，液体培养基初始pH值为8.0。以时间为横坐标，吸光度OD₆₀₀值为纵坐标，绘制生长曲线。期间每隔1h取样测定OD₆₀₀值。细菌生长曲线图如图2所示，该细菌在0h-4h内处于调整期；从第4h开始进入对数生长期；第18h时，OD₆₀₀值为0.8；细菌继续生长至第24h时，OD₆₀₀值为1.0。

实施例4：

挑取4℃斜面保存细菌Arthrobactersp.ZXY-2一环至100mg/L阿特拉津液体培养基中培养至10⁸MPN/ml时，按照5%（v/v）的接菌量将细菌悬液接种至新鲜的无机盐液体培养基中，接种后置于30℃，150r/min的摇床中培养。其中，液体培养基初始pH值为8.0。以时间为横坐标，阿特拉津浓度为纵坐标，绘制细菌降解曲线。期间每隔1h取样，将细菌悬液10000r/min离心10min后，用0.22μm水系滤头过滤，利用高效液相色谱测定阿特拉津的浓度，色谱条件如下：

流动相为乙腈：水=6:4（V/V），检测波长为220nm，柱温30℃，流速1ml/min，进样量20μL，25cm长C18柱。

细菌降解曲线图如图3所示，菌株在14h内能够将100mg/L的阿特拉津完全降解。

实施例5：

分别挑取4℃斜面保存细菌Arthrobactersp.ZXY-2一环至100mg/L含蔗糖的阿特拉津液体培养基中以及无蔗糖的阿特拉津液体培养基中培养，当细菌生长至10⁸MPN/ml时，分别按照5%（v/v）的接菌量将细菌悬液接种至新鲜的含有蔗糖的无机盐液体培养基中以及无蔗糖的无机盐液体培养基中，接种后置于30℃，150r/min的摇床中培养24h。其中，液体培养基初始pH值均为8.0。以时间为横坐标，以阿特拉津降解率为纵坐标，考察24h后阿特拉津的降解率，其检测方法同实施例4。

该菌在有无蔗糖条件下降解图如图4所示,在24h时间内，菌株在有无蔗糖条件下均能够将100mg/L的阿特拉津完全降解，说明该细菌能够以阿特拉津作为唯一碳氮源生长。

实施例6：

挑取4℃斜面保存细菌Arthrobactersp.ZXY-2一环至100mg/L阿特拉津液体培养基中培养至10⁸MPN/ml时，按照5%（v/v）的接菌量将细菌悬液接种至新鲜的无机盐液体培养基中，接种后置于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃摇床中，150r/min培养24h。其中，液体培养基初始pH值为8.0。以时间为横坐标，阿特拉津降解率为纵坐标，考察不同温度条件下阿特拉津的降解率，其检测方法同具体实施方式四。

该菌在不同的温度条件下对阿特拉津的降解率如图5所示，菌株在30℃-35℃范围内降解能力最强，可达100%；低于30℃或高于35℃其降解阿特拉津的能力均略有下降。

实施例7：

挑取4℃斜面保存细菌Arthrobactersp.ZXY-2一环至100mg/L阿特拉津液体培养基中培养至10⁸MPN/ml时，按照5%（v/v）的接菌量将细菌悬液接种至新鲜的无机盐液体培养基中，其中，液体培养基初始pH值分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0。接种后置于30℃摇床中，150r/min培养24h。以时间为横坐标，阿特拉津降解率为纵坐标，考察不同pH值条件下阿特拉津的降解率，其检测方法同具体实施例4。

该菌在不同的pH值条件下对阿特拉津的降解率如图6所示，菌株在pH8.0-pH9.0范围内降解能力最强，可达100%；低于pH8.0或高于pH9.0时，其降解阿特拉津的能力均略有下降。

实施例8：

挑取4℃斜面保存细菌Arthrobactersp.ZXY-2一环至100mg/L阿特拉津液体培养基中培养至10⁸MPN/ml时，按照5%（v/v）的接菌量将细菌悬液接种至新鲜的无机盐液体培养基中，其中，液体培养基初始pH值为8.0。接种后置于30℃摇床中，0r/min、50r/min、100r/min、150r/min、200r/min分别培养24h。以时间为横坐标，阿特拉津降解率为纵坐标，考察不同pH值条件下阿特拉津的降解率，其检测方法同具体实施例4。

该菌在不同摇床转速条件下对阿特拉津的降解率如图7所示，菌株在100r/min-200r/min时降解能力最强，可达100%；低于100r/min时，其降解阿特拉津的能力均略有下降。

实施例9：

挑取4℃斜面保存细菌Arthrobactersp.ZXY-2一环至100mg/L阿特拉津液体培养基中培养至10⁸MPN/ml时，按照5%（v/v）的接菌量将细菌悬液分别接种至10mg/L、20mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L及500mg/L新鲜的无机盐液体培养基中，接种后置于30℃摇床中，150r/min培养24h。其中，液体培养基初始pH值为8.0。以时间为横坐标，阿特拉津降解率为纵坐标，考察不同初始阿特拉津浓度条件下的降解率，其检测方法同具体实施方式四。

该菌在不同的初始阿特拉津浓度条件下对阿特拉津的降解率如图8所示，菌株在10mg/L-200mg/L范围内均能将阿特拉津全部降解。