一种日本枫猩猩的组培快繁方法

摘要

本发明公开一种日本枫猩猩的组培快繁方法，包括以下步骤：(1)外植体选取及灭菌：切取日本枫猩猩带芽茎段，采用酒精和升汞灭菌处理后，得外植体；(2)启动培养：将步骤(1)所得外植体接种到启动培养基中培养1—4周，腋芽生成；(3)增殖培养：切取步骤(2)所得腋芽，接种到增殖培养基中培养4—6周，丛生芽生成；(4)生根培养：将步骤(3)所得丛生芽分离成单芽，接种到生根培养基中培养3—4周即得日本枫猩猩无菌苗；所用培养基配方简单，组培流程简便，培养时间短，增殖频率高，幼苗整齐，便于后期统一的移栽和种植管理，降低了人工成本，能保证所长出的幼苗植株在形状上的一致性，易于操作，可进行产业化生产。

说明书

技术领域

本发明涉及生物组培育苗技术领域，具体涉及一种日本枫猩猩的组培快繁方法。

背景技术

日本枫猩猩，其拉丁名为Acerpalmatum‘Deshojo’，春天叶子呈鲜亮的胭脂 红，但颜色持续时间没有其他相似品种长，除春天外，叶子在其他季节都呈浅绿色， 通常边缘是铜红色，而秋天变为深红色。其植株大多低矮，枝条层叠状犹如瀑布， 成龄植株，其冠伞形或半球形，植株健壮，生长旺盛。虽然该品种目前没有广泛栽 植，但它将会成为一个很受欢迎的园林景观树种，极具观赏价值与经济价值。然而 该品种数量少，目前主要通过播种和嫁接繁殖，出芽率和成活率都不是很高，繁殖 系数低，繁殖周期长，场地要求大，人工成本较高，远不能满足国内对种苗的需求。

因此，如何提高其生产效率，缩短培育时间，降低人工成本，保持优良树种的 遗传稳定性，提高其繁殖系数成为目前亟待解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本申请提供一种日本枫猩猩的组培快繁方法，所用培养基配方简单， 组培流程简便，培养时间短，增殖频率高，幼苗整齐，便于后期统一的移栽和种植 管理，降低了人工成本，能保证所长出的幼苗植株在形状上的一致性，易于操作， 可进行产业化生产。

为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是一种日本枫猩猩的组培快繁方 法，包括以下步骤：

(1)外植体选取及灭菌：切取日本枫猩猩带芽茎段，采用酒精和升汞灭菌处理 后，得外植体；

(2)启动培养：将步骤(1)所得外植体接种到启动培养基中培养1—4周，腋 芽生成，所述启动培养基的组成为：N6基本培养基，补充0.05—0.20mg/LNAA、 0.01—0.08mg/LTDZ、10—50g/L蔗糖、2—10g/L琼脂；

(3)增殖培养：切取步骤(2)所得腋芽，接种到增殖培养基中培养4—6周， 丛生芽生成，所述增殖培养基的组成为：N6基本培养基，补充0.05—0.20mg/LNAA、 0.05—0.20mg/LTDZ、0.2—1.2mg/L6-BA、200—600mg/LLH；

(4)生根培养：将步骤(3)所得丛生芽分离成单芽，接种到生根培养基中培 养3—4周即得日本枫猩猩无菌苗，所述生根培养基的组成为：1/4N6基本培养基， 补充0.01—0.05mg/LIAA、0.01—0.08mg/LNAA、0.005—0.02mg/LIBA。

优选的，所述外植体选取及灭菌的具体操作为：选取日本枫猩猩幼嫩枝条，去 掉叶片，切割成长度为2—3cm的带芽茎段，在无菌操作台上，用75％的酒精处理 6—10s，再用0.1％的升汞处理6—10min，无菌水冲洗4—6次，晾干即可。

优选的，所述启动培养基的组成为：N6基本培养基，补充0.05—0.15mg/LNAA、 0.03—0.06mg/LTDZ、20—40g/L蔗糖、3—6g/L琼脂。

更为优选的，所述启动培养基的组成为：N6基本培养基，补充0.1mg/LNAA、 0.05mg/LTDZ、30g/L蔗糖、5g/L琼脂。

优选的，所述增殖培养基的组成为：N6基本培养基，补充0.05—0.15mg/LNAA、 0.05—0.15mg/LTDZ、0.6—1.0mg/L6-BA、400—600mg/LLH。

更为优选的，所述增殖培养基的组成为：N6基本培养基，补充0.1mg/LNAA、 0.1mg/LTDZ、0.8mg/L6-BA、500mg/LLH。

优选的，所述生根培养基的组成为：1/4N6基本培养基，补充0.01—0.03mg/L IAA、0.03—0.06mg/LNAA、0.01—0.015mg/LIBA。

更为优选的，所述生根培养基的组成为：1/4N6基本培养基，补充0.02mg/LIAA、 0.05mg/LNAA、0.01mg/LIBA。

优选的，所述启动培养基的pH值为6.3—6.7。

优选的，所述启动培养、增殖培养、生根培养步骤中，培养温度为24—30℃， 光照强度为2000—3000Lx，光照时间为14—18h/d。

本申请所述N6基本培养基成分简单，但硝酸盐和铵盐含量较高，其养分的数 量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要，部分植物组织培养快速繁殖用 它作为培养基的基本培养基。

所述1/4N6基本培养基为上述N6基本培养基在大量母液的基础上减去四分之 三的无机盐，更低的盐浓度有利于植物根系的生长。

所述NAA为萘乙酸，是一种植物生长激素，在植物使用扦插法繁殖时使用， 也可用于植物组织培养，能促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根增加座果，防止 落果，改变雌、雄花比率等，可经叶片、树枝的嫩表皮，种子进入到植株内，随营 养流输导到全株。

所述TDZ是一种植物生长调节剂，具有很强的细胞分裂素活性，可以促进植物 芽的再生和繁殖，打破芽的休眼，促进种子萌发，促进愈伤组织生长，延缓植物衰 老等，可以对其它的植物激素和生理活性物质的作用来调节植物的生长发育过程， 可用作植物组织培养。

所述6-BA为6-苄氨基腺嘌呤，是一种植物生长激素，其主要作用是促进芽的 形成，也可以诱导愈伤组织发生，促进细胞分裂，促进非分化组织分化，促进生物 体内物质的积累，促进侧芽发生，防止老化，是植物组织和细胞培养中的细胞分裂 素。

所述LH为水解乳蛋白，是一种多种氨基酸的混合物，其主要作用是促进胚状 体、不定芽的分化，有利于丛生芽的分化。可增强其他营养物质的吸收利用；亦可 利用氨基酸对微量元素的结合能力，增强微量元素的利用率。可促进植物吸收作用。

所述IAA为吲哚乙酸，是一种植物生长激素，能够调节植物的生长，不仅能促 进生长，而且具有抑制生长和器官建成的作用。在细胞水平上，可刺激形成层细胞 分裂、刺激枝的细胞伸长、抑制根细胞生长、促进木质部、韧皮部细胞分化、促进 插条发根、调节愈伤组织的形态建成，因此可用作植物组织培养。

所述IBA为吲哚丁酸，是一种植物生长激素，主要用于插条生根，可诱导根原 体的形成，促进细胞分化和分裂，有利于新根生成和维管束系统的分化，促进插条 不定根的形成。

本申请与现有技术相比，其详细说明如下：本申请技术方案提供了一种日本枫 猩猩的组培快繁方法，包括外植体的选取及灭菌、启动培养、增殖培养、生根培养 的步骤，通过对启动培养基、增殖培养基、生根培养基的筛选，得到最佳的培养基 组分和配比，采用前述植物生长激素配比形成的培养基，配方简单，培养基成本低， 配合各阶段的培养条件，得到的幼苗培养时间短，培养流程简便，提高了日本枫猩 猩繁殖的效率，繁殖系数较高为2—3，能快速获得遗传性状一致的日本枫猩猩无菌 苗，利用组织培养技术，进行外植体培养，可不受季节气候变化、自然灾害的影响， 可进行大规模的工业化育苗及深加工。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例 对本发明作进一步的详细说明。

实施例1

本实施例所述的一种日本枫猩猩的组培快繁方法，包括以下步骤：

(1)外植体选取及灭菌：选取日本枫猩猩幼嫩枝条，去掉叶片，切割成长度为 2—3cm的带芽茎段，在无菌操作台上，用75％的酒精处理6—10s，再用0.1％的升 汞处理6—10min，无菌水冲洗4—6次，晾干即可，得外植体；

(2)启动培养：将步骤(1)所得外植体接种到pH值为6.3—6.7的启动培养 基中培养1—4周，腋芽生成，所述启动培养基的组成为：N6基本培养基，补充 0.1mg/LNAA、0.05mg/LTDZ、30g/L蔗糖、5g/L琼脂；

(3)增殖培养：切取步骤(2)所得腋芽，接种到增殖培养基中培养4—6周， 丛生芽生成，所述增殖培养基的组成为：N6基本培养基，补充0.1mg/LNAA、0.1mg/L TDZ、0.8mg/L6-BA、500mg/LLH；

(4)生根培养：将步骤(3)所得丛生芽分离成单芽，接种到生根培养基中培 养3—4周即得日本枫猩猩无菌苗，所述生根培养基的组成为：1/4N6基本培养基， 补充0.02mg/LIAA、0.05mg/LNAA、0.01mg/LIBA。

其中，所述启动培养、增殖培养、生根培养步骤中，培养温度为24—30℃，光 照强度为2000—3000Lx，光照时间为14—18h/d。

本实施例中，启动培养过程中，第一个腋芽生成的时间为8天，启动培养结束 时，腋芽伸长1—3cm；增殖培养过程中，第一个丛生芽生成的时间为30天，增殖 培养结束时，丛生芽株高1.5—3cm，增殖系数为2—3。

实施例2

本实施例所述的一种日本枫猩猩的组培快繁方法，与实施例1的区别在于：

步骤(2)中，启动培养基的组成为：N6基本培养基，补充0.05mg/LNAA、 0.01mg/LTDZ、10g/L蔗糖、2g/L琼脂；

步骤(3)中，增殖培养基的组成为：N6基本培养基，补充0.05mg/LNAA、 0.05mg/LTDZ、0.2mg/L6-BA、200mg/LLH；

步骤(4)中，生根培养基的组成为：1/4N6基本培养基，补充0.05mg/LIAA、 0.08mg/LNAA、0.02mg/LIBA。

本实施例中，启动培养过程中，第一个腋芽生成的时间为11天，启动培养结束 时，腋芽伸长1—3cm；增殖培养过程中，第一个丛生芽生成的时间为37天，增殖 培养结束时，丛生芽株高1.5—3cm，增殖系数为2—3。

实施例3

本实施例所述的一种日本枫猩猩的组培快繁方法，与实施例1的区别在于：

步骤(2)中，启动培养基的组成为：N6基本培养基，补充0.20mg/LNAA、 0.08mg/LTDZ、50g/L蔗糖、10g/L琼脂；

步骤(3)中，增殖培养基的组成为：N6基本培养基，补充0.20mg/LNAA、 0.20mg/LTDZ、1.2mg/L6-BA、600mg/LLH；

步骤(4)中，生根培养基的组成为：1/4N6基本培养基，补充0.01mg/LIAA、 0.01mg/LNAA、0.005mg/LIBA。

本实施例中，启动培养过程中，第一个腋芽生成的时间为13天，启动培养结束 时，腋芽伸长1—3cm；增殖培养过程中，第一个丛生芽生成的时间为43天，增殖 培养结束时，丛生芽株高1.5—3cm，增殖系数为2—3。

实施例4

本实施例所述的一种日本枫猩猩的组培快繁方法，与实施例1的区别在于：

步骤(2)中，启动培养基的组成为：N6基本培养基，补充0.05mg/LNAA、 0.01mg/LTDZ、10g/L蔗糖、2g/L琼脂；

步骤(3)中，增殖培养基的组成为：N6基本培养基，补充0.20mg/LNAA、 0.20mg/LTDZ、1.2mg/L6-BA、600mg/LLH；

步骤(4)中，生根培养基的组成为：1/4N6基本培养基，补充0.01mg/LIAA、 0.01mg/LNAA、0.005mg/LIBA。

本实施例中，启动培养过程中，第一个腋芽生成的时间为11天，启动培养结束 时，腋芽伸长1—3cm；增殖培养过程中，第一个丛生芽生成的时间为43天，增殖 培养结束时，丛生芽株高1.5—3cm，增殖系数为2—3。

实施例5

本实施例所述的一种日本枫猩猩的组培快繁方法，与实施例1的区别在于：

步骤(2)中，启动培养基的组成为：N6基本培养基，补充0.20mg/LNAA、 0.08mg/LTDZ、50g/L蔗糖、10g/L琼脂；

步骤(3)中，增殖培养基的组成为：N6基本培养基，补充0.05mg/LNAA、 0.05mg/LTDZ、0.2mg/L6-BA、200mg/LLH；

步骤(4)中，生根培养基的组成为：1/4N6基本培养基，补充0.05mg/LIAA、 0.08mg/LNAA、0.02mg/LIBA。

本实施例中，启动培养过程中，第一个腋芽生成的时间为13天，启动培养结束 时，腋芽伸长1—3cm；增殖培养过程中，第一个丛生芽生成的时间为37天，增殖 培养结束时，丛生芽株高1.5—3cm，增殖系数为2—3。

实施例6

本实施例所述的一种日本枫猩猩的组培快繁方法，与实施例1的区别在于：

步骤(2)中，启动培养基的组成为：N6基本培养基，补充0.05mg/LNAA、 0.03mg/LTDZ、20g/L蔗糖、3g/L琼脂；

步骤(3)中，增殖培养基的组成为：N6基本培养基，补充0.05mg/LNAA、 0.05mg/LTDZ、0.6mg/L6-BA、400mg/LLH；

步骤(4)中，生根培养基的组成为：1/4N6基本培养基，补充0.03mg/LIAA、 0.06mg/LNAA、0.015mg/LIBA。

本实施例中，启动培养过程中，第一个腋芽生成的时间为18天，启动培养结束 时，腋芽伸长1—3cm；增殖培养过程中，第一个丛生芽生成的时间为51天，增殖 培养结束时，丛生芽株高1.5—3cm，增殖系数为2—3。

实施例7

本实施例所述的一种日本枫猩猩的组培快繁方法，与实施例1的区别在于：

步骤(2)中，启动培养基的组成为：N6基本培养基，补充0.15mg/LNAA、 0.06mg/LTDZ、40g/L蔗糖、6g/L琼脂；

步骤(3)中，增殖培养基的组成为：N6基本培养基，补充0.15mg/LNAA、 0.15mg/LTDZ、1.0mg/L6-BA、600mg/LLH；

步骤(4)中，生根培养基的组成为：1/4N6基本培养基，补充0.01mg/LIAA、 0.03mg/LNAA、0.01mg/LIBA。

本实施例中，启动培养过程中，第一个腋芽生成的时间为21天，启动培养结束 时，腋芽伸长1—3cm；增殖培养过程中，第一个丛生芽生成的时间为35天，增殖 培养结束时，丛生芽株高1.5—3cm，增殖系数为2—3。

实施例8

本实施例所述的一种日本枫猩猩的组培快繁方法，与实施例1的区别在于：

步骤(2)中，启动培养基的组成为：N6基本培养基，补充0.05mg/LNAA、 0.03mg/LTDZ、20g/L蔗糖、3g/L琼脂；

步骤(3)中，增殖培养基的组成为：N6基本培养基，补充0.15mg/LNAA、 0.15mg/LTDZ、1.0mg/L6-BA、60mg/LLH；

步骤(4)中，生根培养基的组成为：1/4N6基本培养基，补充0.01mg/LIAA、 0.03mg/LNAA、0.01mg/LIBA。

本实施例中，启动培养过程中，第一个腋芽生成的时间为18天，启动培养结束 时，腋芽伸长1—3cm；增殖培养过程中，第一个丛生芽生成的时间为35天，增殖 培养结束时，丛生芽株高1.5—3cm，增殖系数为2—3。

实施例9

本实施例所述的一种日本枫猩猩的组培快繁方法，与实施例1的区别在于：

步骤(2)中，启动培养基的组成为：N6基本培养基，补充0.15mg/LNAA、 0.06mg/LTDZ、40g/L蔗糖、6g/L琼脂；

步骤(3)中，增殖培养基的组成为：N6基本培养基，补充0.05mg/LNAA、 0.05mg/LTDZ、0.6mg/L6-BA、400mg/LLH；

步骤(4)中，生根培养基的组成为：1/4N6基本培养基，补充0.03mg/LIAA、 0.06mg/LNAA、0.015mg/LIBA。

本实施例中，启动培养过程中，第一个腋芽生成的时间为21天，启动培养结束 时，腋芽伸长1—3cm；增殖培养过程中，第一个丛生芽生成的时间为51天，增殖 培养结束时，丛生芽株高1.5—3cm，增殖系数为2—3。

实施例10

启动培养基中生长激素成分和浓度对腋芽生长的影响

取生长情况一致的外植体若干，经过灭菌晾干后接种到pH值为6.3—6.7的启 动培养基上培养1—4周，培养温度为24—30℃，光照强度为2000—3000Lx，光照 时间为14—18h/d。其中启动培养基采用N6基本培养基，补充生长激素、蔗糖、琼 脂。在N6基本培养基、蔗糖、琼脂均相同的条件下，根据生长激素的成分和浓度 进行分组，观察并记录培养基中外植体的培养情况，具体分组及培养结果见表1。

表1启动培养基中生长激素成分和浓度对腋芽生长的影响结果

从上表可以看出，NAA和TDZ同时使用比二者任一单用时的分化率要高得多， 平均腋芽长度也更长，且从7—9组可以看出，两者同时使用时，NAA为0.1mg/L， TDZ为0.05mg/L时，分化率最高，为启动培养基的最适合的生长激素组成条件。 实施例11

增殖培养基中生长激素成分和浓度对增殖的影响

取生长情况一致的经过启动培养的腋芽若干，接种到增殖培养基上培养4—6 周，培养温度为24—30℃，光照强度为2000—3000Lx，光照时间为14—18h/d。其 中增殖培养基采用N6基本培养基，补充生长激素，在N6基本培养基条件相同的情 况下，根据生长激素的成分和浓度进行分组，观察并记录培养基中腋芽的培养情况， 具体分组及培养结果见表2。

表2增殖培养基中生长激素成分和浓度对增殖的影响结果

从上表可以看出，NAA、TDZ、6-BA、LH同时使用比四者任一种、任两种、 任三种使用时的增殖率要高得多，平均株高也更高，且从13—15组可以看出，四者 同时使用时，NAA为0.1mg/L，TDZ为0.1mg/L，6-BA为0.8mg/L，LH为500mg/L 时，其增殖率最高，为增殖培养基的最适合的生长激素组成条件。

实施例12

生根培养基中生长激素成分和浓度对生根的影响

取生长情况一致的经过增殖培养的丛生芽的单株若干，接种到增殖培养基上培 养3—4周，培养温度为24—30℃，光照强度为2000—3000Lx，光照时间为14—18h/d。 其中生根培养基采用1/4N6基本培养基，并补充生长激素，在N6基本培养基条件 相同的情况下，根据生长激素的成分和浓度进行分组，观察并记录培养基中丛生芽 的单株的培养情况，具体分组及培养结果见表3。

表3生根培养基中生长激素成分和浓度对生根的影响结果

从上表可以看出，IAA、NAA、IBA同时使用比三者任一单用时的生根率要 高得多，平均生根数和平均根长也均较高，且从7—9组可以看出，三者同时使用时， IAA为0.02mg/L，NAA为0.05mg/L，IBA为0.01mg/L，其生根率达到100％，且 长势较好，平均生根数和平均根长均较高，为生根培养基的最适合的生长激素条件。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为 对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技 术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改 进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。