一种人血清白蛋白的检测试剂及定量检测方法

摘要

一种人血清白蛋白的检测试剂及定量检测方法，其属于精细化工技术领域。该方法的原理是基于白蛋白与小分子的结合属性，具体为HCAB可与白蛋白特异性结合，抑制了HCAB扭曲分子内电荷转移现象，非辐射跃迁减少，从而恢复荧光，实现白蛋白的定量检测。在生理pH值条件下被激发后（激发波长λex=424nm）产生稳定的荧光信号（发射波长λem=526nm）。其荧光值强度与白蛋白的浓度成正比，根据检测到的荧光值可推算出生物样品中白蛋白的含量。该方法可用于测定血浆、尿液等多种生物样品中白蛋白的绝对含量，同时还具有灵敏度高、准确度高、抗环境干扰能力强、易于高通量检测等优势。

说明书

技术领域

本发明属于精细化工领域，具体涉及一种定量测定生物样品中白蛋白含量的方法 及应用。

背景技术

人血白蛋白(humanserumalbumin，HSA)是一种小分子量、非糖基化、带负电荷的 血清蛋白，具有物质结合、运输、抗氧化以及酶活性等多种功能[1]。生理情况下，白蛋白是 细胞外液中含量最多的蛋白质，其中血浆白蛋白含量为35～50g/L，约占血浆总蛋白的60%， 远高于组织间液中的蛋白含量。白蛋白主要在肝脏合成，但不在肝脏内贮存，由肝细胞直接 分泌到窦状隙中进入血液循环，半衰期为17～19d，最终由肌肉、肝脏和肾脏等降解。

HSA是一种包含有585个氨基酸的小分子球状蛋白质，有少量色氨酸和蛋氨酸残基 及大量的带电荷的赖氨酸、天门冬氨酸残基，没有非朊基团和糖，分子量为66kD。X线晶体照 相显示其拥有一个心形的三维结构，但在溶液中呈椭圆体。HSA由3个相似的结构域(Ⅰ－Ⅲ) 组成，每个结构域包含2个亚级结构(A和B)，分别由4个和6个α螺旋组成，结构域间的二硫键 和亚级结构间通过脯氨酸残基提供的灵活环结构做相对移动以助于白蛋白结合各种物质。 生理情况下，HSA主要以带一个自由硫氢基的还原形式存在(HSA-SH)，也称硫基白蛋白。半 胱氨酸-34的硫氢基部分有助于硫醇化作用和亚硝基化进程，这与HSA在体内的多种作用有 关。小部分HSA以二硫化物形式存在，且含量随年龄增长而增高，在氧化应激等疾病状态时 也会增高。

HSA可结合多种内源性和外源性化合物，包括脂肪酸、金属离子、药物、代谢产物 等，提示其具有药物转运功能。HSA结合位点Ⅰ和Ⅱ位于不同的结构域，负责结合与蛋白质作 用的大多数药物，其中位点Ⅰ除了可结合较大的杂环化合物或二羧基酸，以及其他多种化合 物外，还可以结合体积庞大的内源性物质，如胆红素、卟啉等，位点Ⅱ则较小且欠灵活，结合 功能更为特异。半胱氨酸-34可结合顺铂、青霉胺、N-乙酰半胱氨酸等药物。一氧化氮(NO)也 可通过亲电子与半胱氨酸-34结合形成S-亚硝基白蛋白，产生扩血管作用，但生理状况下， 血浆中S-亚硝基白蛋白含量极低(<10nmol/L)，目前还不清楚病理状况下HSA能在多大程 度上结合NO及其衍生物。此外，还有一些药物和化合物不能确定具体的结合位点。

HSA具有协调维持血管内皮完整性，抗氧化作用，脏器功能保护，维持胶体渗透压， HSA还有保护血细胞、调节凝血、作为氮源为损伤组织修复提供营养等作用。因此，开发检测 迅速，操作简单，成本低廉的HSA检测方法具有重要意义。

本发明提供了一种定量测定生物样品中白蛋白含量的方法及应用，具体为HCAB可 与白蛋白特异性结合，抑制了扭曲分子内电荷转移现象，非辐射跃迁减少，从而恢复荧光， 实现白蛋白的定量检测。在生理pH值条件下被激发后（激发波长λ_ex=424nm）产生稳定的 荧光信号（发射波长λ_em=560nm）。其荧光值强度与白蛋白的浓度成正比，根据检测到的荧 光值可推算出生物样品中白蛋白的含量。该方法可用于测定血浆、尿液等多种生物样品中 白蛋白的绝对含量，同时还具有灵敏度高、准确度高、抗环境干扰能力强、易于高通量检测 的优势，并且操作简单，成本低廉。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人血清白蛋白的检测试剂及定量检测方法；利用该方 法，检测人血清、血浆或尿液中白蛋白含量，通过检测样本中的荧光强度值来计算其中的白 蛋白浓度；该方法具有荧光强度增益大，检测灵敏度高等特点。

本发明采用的技术方案是：一种人血清白蛋白的检测试剂，检测试剂是浓度为35- 45μM的荧光探针二甲基亚砜溶液，所述荧光探针的结构为

、或。

一种人血清白蛋白的检测试剂进行定量检测的方法，包括以下步骤：

（1）将含有白蛋白的待测样品加入到100mM的磷酸缓冲液中，37^oC孵育3分钟；待测样 品与磷酸缓冲液的体积比为1:18；

（2）加入检测试剂，混匀后用荧光检测器检测，荧光检测条件为激发波长424nm，发射 波长424nm；检测试剂与待测样品的体积比为1:1；

（3）读取荧光值后代入定量标准曲线，换算得到人血清白蛋白的浓度；建立定量标准曲 线的方法如下：采用1mg/mL的人血清白蛋白的标准溶液，用磷酸缓冲液稀释成不同浓度的 标准曲线工作液；向每个标准曲线工作液中加入同量的荧光探针，得到荧光探针浓度相同 的待测液；分别检测待测液中荧光探针与白蛋白结合产生的荧光强度，将荧光强度比值对 人血清白蛋白浓度进行线性拟合作图，得到白蛋白的定量标准曲线。

一种人血清白蛋白的检测试剂的应用于重组表达的白蛋白、白蛋白注射液或含有 白蛋白的制剂中白蛋白含量的定量测定，或用于人血浆或尿液体外检验临床样品中白蛋白 含量的定量测定。

本发明还提供了所述定量测定生物样品中白蛋白含量的方法的应用，采用上述式 （1）中化合物作为白蛋白特异性的结合底物，进行结合反应，通过定量检测单位时间内底物 与白蛋白结合后所示荧光强度来测定不同样本（包括重组表达的白蛋白、含有白蛋白的各 类医药产品、人血浆、尿液等临床样品）中白蛋白的含量；具体测定方法为：

——体系中以HCAB作为特异性结合底物；底物浓度选择为K_D（K_D为解离常数）

——在磷酸缓冲液等常用缓冲液中，反应温度为0-60℃（优选反应温度为37^oC）；孵 育体系pH值介于5.5-9.5之间（优选pH值为7.4）；

——结合时间为3s以上，在确保以上底物与白蛋白结合牢固；

——测定结合后荧光强度作为白蛋白含量的评价指标。

本发明提供的定量测定不同样本中白蛋白含量的应用，底物与白蛋白结合抑制了 扭曲分子内电荷转移现象，非辐射跃迁减少，从而恢复荧光，实现白蛋白的定量检测。采用 荧光检测器实现结合产物的快速灵敏检测；荧光检测条件为：激发波长424nm，发射波长 560nm。

本发明提供的所述定量测定不同样本中白蛋白含量的应用，该特异性底物用于重 组表达的白蛋白、含有白蛋白的各类医药产品、人血浆、尿液等临床样品中白蛋白的测定。

该方法的原理是基于白蛋白与小分子的结合属性，具体为HCAB可与白蛋白特异性 结合，抑制了HCAB扭曲分子内电荷转移现象，非辐射跃迁减少，从而恢复荧光，实现白蛋白 的定量检测。在生理pH值条件下被激发后（激发波长λ_ex=424nm）产生稳定的荧光信号（发 射波长λ_em=526nm）。其荧光值强度与白蛋白的浓度成正比，根据检测到的荧光值可推算出 生物样品中白蛋白的含量。该方法可用于测定血浆、尿液等多种生物样品中白蛋白的绝对 含量，同时还具有灵敏度高、准确度高、抗环境干扰能力强、易于高通量检测等优势。选用本 发明所述白蛋白的定量检测方法具有以下突出优势：

（1）该检测试剂对血清响应范围宽，达到0~300mg/L;（2）响应灵敏度高，血清含量由0增 加到300mg/L时，荧光强度增加88倍；HCAB具有良好的荧光发射光谱特性（424nm），该底物与 白蛋白结合产物具有荧光发射光谱特征，能较好的进行检测。（3）检测试剂的工作浓度低， 荧光探针的浓度2.0μM；（4）选择性高，在18种不同蛋白测试中，只对血清蛋白响应。该方法 具有良好的特异性，HCAB可与白蛋白高特异性地结合抑制了扭曲分子内电荷转移现象，非 辐射跃迁减少，从而恢复荧光，实现白蛋白的定量检测。(5)易高通量检测：该方法可在实验 室常见各类荧光酶标仪及临床大生化仪上测定，可利用96或386微孔板进行批量检测。(6) 抗干扰能力强，操作简单，成本低廉。

附图说明

图1是探针1的核磁氢谱数据。

图2是探针2的核磁氢谱数据。

图3是探针HCAB的核磁氢谱数据。

图4是探针1与白蛋白结合荧光发射光谱图（在424nm进行激发）。

图5是探针2与白蛋白结合荧光发射光谱图（在424nm进行激发）。

图6是探针HCAB与白蛋白结合荧光发射光谱图（在424nm进行激发）。

图7是探针HCAB与白蛋白结合前后紫外吸收光谱图。

图8是探针HCAB的选择性。

其中：PBS为缓冲溶液，BSA为牛血清蛋白，IgG为免疫球蛋白，AAG为α-酸性糖蛋白， AC为α-胰凝乳蛋白酶，hCE1为人羧酸酯酶1，hCE2为人羧酸酯酶2，AChE为乙酰胆碱酯酶， BchE为丁酰胆碱酯酶，Lipase为脂肪酶，Transferrin为转铁蛋白，CRP为C反应蛋白， Lysozyme为溶解酶，Hemoglobin为血红蛋白，CA为碳酸酐酶，Pepsin为胃蛋白酶，Trypsin为 胰蛋白酶，AMG为α2巨球蛋白，Myoglobin为肌球蛋白，HSA为人血清白蛋白。

图9是HCAB与白蛋白结合后荧光强度随白蛋白浓度变化的线性拟合图。

图10是探针HCAB与药物结合位点图。

具体实施方式

下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。

实施例1.探针1、2或HCAB的合成

探针1的合成：

1.3mmol的化合物3（2’-羟基苯乙酮）、1.2mmol的化合物4（4-二甲氨基苯甲醛）溶解在 30mL乙醇中，再向其中滴加4.9mmol氢氧化钾溶液。搅拌8h，旋蒸除去溶剂，将剩余固体纯 化（硅胶、乙酸乙酯-正己烷作为洗脱剂，1:5，v/v），得到红色固体160mg，为探针1，产率为 50%。探针1的1HNMR(400MHz,CDCl3):δ13.19(s,1H),7.91(d,J=7.0Hz, 2H),7.57(d,J=8.9Hz,2H),7.37-7.49(m,2H),7.00(d,J=8.4Hz,1H), 6.85-6.96(m,1H),6.69(d,J=8.9Hz,2H),3.05(s,6H)。

探针HCAB的合成：

将0.5mmol的探针1和0.5mmol的三乙胺加入到10mL的四氢呋喃中，再将苯甲酰氯（0.6 mmol，混合5mL四氢呋喃）在30分钟内逐滴加入反应混合物中，在0℃下搅拌1h，然后升温至 室温搅拌过夜。旋蒸除去溶剂，剩余固体纯化（硅胶、乙酸乙酯-正己烷作为洗脱剂，1:3，v/ v），得到103mg的黄色固体，为探针HCAB，产率为55%。探针HCAB的¹HNMR(400MHz, CDCl₃):δ8.13(d,J=1.2Hz,2H),7.70(d,J=1.7Hz,1H),7.54(m,3H), 7.35(m,6H),6.94(d,J=15.8Hz,1H),6.58-6.60(d,J=8.9Hz,2H),3.01 (s,6H);¹³CNMR(100MHz,CDCl₃):191.84,165.02,152.06,148.63,146.91, 133.51,133.42,131.65,130.42,130.31,129.80,129.29,128.49,125.95, 123.40,122.25,120.71,111.71,40.99;HRMS:m/zcalcdforC₂₄H₂₁NO₃:371.1521 andfound371.1522。

探针2的合成：

将0.5mmol的探针1和0.5mmol的三乙胺加入到10mL的四氢呋喃中，再将乙酰氯（0.6 mmol，混合5mL四氢呋喃）在30分钟内逐滴加入反应混合物中，在0℃下搅拌1h，然后升温至 室温搅拌过夜。旋蒸除去溶剂，剩余固体纯化（硅胶、乙酸乙酯-正己烷作为洗脱剂，1:3，v/ v），得到82mg的黄色固体为探针2，产率为53%。探针2的¹HNMR(400MHz,CDCl₃):δ7.66 (d,J=7.6Hz,1H),7.42-7.56(m,4H),7.32(d,J=0.8Hz,1H),7.25(s, 1H),7.15(d,J=8.1Hz,1H),6.95(d,J=15.8Hz,1H),6.68(d,J=8.6 Hz,2H),3.03(s,6H),2.22(s,3H);¹³CNMR(100MHz,CDCl₃):191.85,169.44, 152.15,148.48,146.74,133.16,130.45,131.73,129.74,125.93,123.33, 122.20,120.39,111.83,40.10,21.01.HRMS:m/zcalcdforC₁₉H₁₉NO₃:309.1365 andfound309.1372。

实施例2.探针1结合HSA前后荧光变化

（1）采用1mg/mL的人血清白蛋白（HSA）的标准溶液，采用磷酸缓冲液稀释成300mg/ L），37℃下震荡混匀；

（2）向每个所述溶液样本（198μL）中加入2μL浓度为0.2mM的荧光底物分子1，使其终 浓度为2μM；37℃震荡混匀5s；

（3）分别检测底物分子与白蛋白结合产生的荧光强度（λ_ex=424nm，λ_em=560nm）在 采集波长处的荧光强度值（见图4）。

实施例3.探针2结合HSA前后荧光变化

（1）采用1mg/mL的人血清白蛋白（HSA）的标准溶液，采用磷酸缓冲液稀释成300mg/ L），37℃下震荡混匀；

（2）向每个所述溶液样本（198μL）中加入2μL浓度为0.2mM的荧光底物分子2，使其终 浓度为2μM；37℃震荡混匀5s；

（3）分别检测底物分子与白蛋白结合产生的荧光强度（λ_ex=424nm，λ_em=560nm）在 采集波长处的荧光强度值（见图5）。

实施例4.探针HCAB结合HSA前后荧光变化

（1）采用1mg/mL的人血清白蛋白（HSA）的标准溶液，采用磷酸缓冲液稀释成300mg/ L），37℃下震荡混匀；

（2）向每个所述溶液样本（198μL）中加入2μL浓度为0.2mM的荧光底物分子HCAB，使 其终浓度为2μM；37℃震荡混匀5s；

（3）分别检测底物分子与白蛋白结合产生的荧光强度（λ_ex=424nm，λ_em=560nm）在 采集波长处的荧光强度值（见图6）。

实施例5.探针HCAB结合HSA前后紫外变化

（1）采用1mg/mL的人血清白蛋白（HSA）的标准溶液，采用磷酸缓冲液稀释成300mg/ L），37℃下震荡混匀；

（2）向每个所述溶液样本（198μL）中加入2μL浓度为0.2mM的荧光底物分子HCAO，使 其终浓度为2μM；37℃震荡混匀5s；

（3）检测紫外吸收光谱值（见图7）。

实施例6.探针HCAB的选择性检测

（1）含有转铁蛋白、肌红蛋白、胃蛋白酶、α-糜蛋白酶、胰蛋白酶、碳酸酐酶、巨球蛋白、C 反应蛋白（10mg/L）、血浆（0.1%）、人血清白蛋白（150mg/L）的pH=7.4的磷酸缓冲液 （100mM）198μL，于37℃条件下震荡混匀；

（2）加入2μL浓度为0.2mM的荧光底物分子起始反应，以使待测样品中的荧光底物分 子的终浓度为2μM；37℃震荡混匀；

（3）5秒后，检测底物分子与白蛋白结合生成产生的荧光强度（λ_ex=424nm，λ_em=560 nm）在采集波长处的荧光强度值（见图8）。

实施例7.探针HCAB的检测标准曲线测量

（1）采用1mg/mL的人血清白蛋白（HSA）的标准溶液，采用磷酸缓冲液稀释成不同浓度 的标准曲线工作液（0,5,10,20,30,40,50,60,70,80mg/L），37℃下震荡混匀；

（2）向每个所述溶液样本（198μL）中加入2μL浓度为0.2mM的荧光底物分子，使其终 浓度为2μM；37℃震荡混匀5s；

（3）分别检测底物分子与白蛋白结合产生的荧光强度（λ_ex=424nm，λ_em=560nm）在 采集波长处的荧光强度值，将荧光强度比值对HSA浓度进行线性拟合作图，建立白蛋白的定 量标准曲线；曲线方程为Y=333.3X-27.93，相关系数平方为0.9958（见图9）。

实施例8.探针HCAB检测血清中HSA含量

（1）吸取1μL（约1小滴）人血浆样本，采用pH=7.4的磷酸缓冲液（10mM）稀释1000倍， 于37℃条件下震荡混匀；

（2）吸取198μL样品，加入2μL浓度为0.2mM的荧光底物分子起始反应，以使待测样品 中的荧光底物分子的终浓度为2μM；37℃震荡孵育5秒左右；

（3）检测底物分子与白蛋白结合生成的荧光强度（λ_ex=424nm，λ_em=560nm）在采集 波长处的荧光强度值；将荧光比值代入实施例7中的标准曲线中，求得血浆中的白蛋白浓度 为51.44mg/mL。

实施例9.探针HCAB检测尿样中HSA含量

（1）吸取198μL人尿液样本，37℃下混匀；

（2）加入2μL的荧光底物分子0.2mM，以使待测样品中的荧光底物分子的终浓度为2μ M；37℃震荡混匀；

（3）检测底物分子与白蛋白结合生成的荧光强度（λ_ex=424nm，λ_em=560nm）在采集 波长处的荧光强度值；

（4）在标准曲线中找到对应的白蛋白浓度值，计算出待测样品中的白蛋白浓度为23.21 mg/L。