醒脑静注射液液相指纹图谱的测定方法及其标准指纹图谱

摘要

本发明涉及一种中药制剂的指纹图谱的测定方法，具体涉及一种醒脑静注射液的液相指纹图谱测定方法，包括以下步骤：供试品溶液的制备、对照品溶液的制备、液相色谱仪测定及对数据和图谱的处理，以及由该方法得到的醒脑静注射液液相指纹图谱。本发明方法简便、快捷、准确、稳定、可靠，可用与醒脑静注射液气相指纹图谱结合，用于醒脑静注射液样品的质量控制，能更加全面、客观、科学地评价醒脑静注射液质量，保证产品的有效性。

说明书

技术领域

本发明涉及中药指纹图谱分析方法，具体涉及醒脑静注射液液相指纹图谱测定方法，及其所得到的醒脑静注射液液相指纹图谱。

背景技术

我国传统中药制剂成分复杂，一般质量标准中含量测定只涉及处方中君药的1～3个成分，难以有效的控制其内在质量，从而无法保证用药的安全性、有效性，尤其是经静脉途径用药的中药注射剂，现行质量标准已无法保证其安全性。故只有不断进行科学的质量标准研究，才能逐步符合中药及中药发展的要求，真正的做到“安全、有效、稳定、可控”。

醒脑静注射液是由麝香、冰片、郁金和栀子经水蒸气蒸馏提取精制而成的复方中药注射液，始创于上世纪70年代，组方由中医名方安宫牛黄丸化裁而得，具有清热解毒，凉血活血，开窍醒脑功效。其质量标准国家食品药品监督管理局国家药品标WS₃-B-3353-98-2003，其中鉴别包括麝香的鉴别，含量测定仅有冰片的检测。

已有的醒脑静注射液质量控制的文献报道，全部是以麝香酮和/或龙脑为质控指标，检测方法主要为气相色谱法(GC)和气质联用法(GC-MS)，仅有1篇文献采用HPLC法测定醒脑静中麝香酮的含量。且专利(专利申请号200910186698.X)仅建立一种气相测定的指纹图谱方法，在该指纹图谱中，麝香酮和龙脑的总含量占到总峰面积的90％之上，其他成分的信息掩盖较多；而液相色谱法可有效排除了麝香酮和龙脑含量过高造成的不利影响。而且理论上，所有化学成分都应具有某些药理活性，而且往往微量成分的作用在整个处方或制剂中的作用举足轻重。

基于此，本发明首次采用高效液相法建立了醒脑静注射液的指纹图谱，对该注射液的化学成分概貌有一个全面的认识。同时生产过程中，气相指纹图谱与液相指纹图谱共同运用，可进一步提高制剂的质量可控性需求，满足制剂的“安全、有效、稳定、可控”。

发明内容

本发明的目的在于提供一种醒脑静注射液液相指纹图谱的测定方法及其标准指纹图谱。

本发明通过对醒脑静注射液液相指纹图谱的研究，提供了一种快速评价该制剂中成分质量的方法，弥补了现有质量控制技术的不足的缺点，使醒脑静注射液质量控制技术更为完善，也更为科学。

本发明所述的一种醒脑静注射液的液相指纹图谱测定方法，包括以下步骤

一种醒脑静注射液的有效成分含量测定方法，包括以下步骤：

1)供试品溶液的制备：取醒脑静注射液3～5支，倾出内容物，混匀，精密吸取5～10mL，通过固相萃取小柱，流出液弃去，用1～5mL有机溶剂洗脱，收集洗脱液，置1～5mL量瓶中，加有机溶剂至刻度，摇匀，作为供试品溶液；

2)对照品溶液的制备：分别称取优香芹酮、樟脑、莪术二酮、吉马酮、姜黄烯酮、莪术酮和莪术烯醇对照品适量，置于容量瓶中，加有机溶剂溶解并稀释至刻度，制成混合对照品溶液；

3)测定方法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，得到色图谱，根据色谱图计算供试品溶液中的有效成分含量；

其中的色谱系统条件：色谱柱：C₁₈柱；流动相：乙腈(A)-甲酸水溶液(B)梯度洗脱，流速1.0～2.0mL/min；检测波长254nm；柱温30～40℃，

洗脱条件：0-5min，40％A；5-50min，40％-60％A；50-60min，60％-100％A；60-65min，100％A；65.01-75min，40％A。

其中，步骤1)中所用的固相萃取小柱选自C₁₈或C₈的固相萃取小柱。

其中，步骤1)和步骤2)所用的有机溶剂选自：甲醇、乙醇、乙腈、正己烷等有机溶剂。

其中，步骤3)甲酸水溶液浓度为0.01～0.05％。

优选的，测定方法，包括以下步骤：

1)供试品溶液的制备：取醒脑静注射液3～5支，倾出内容物，混匀，精密吸取5mL，通过C₈固相萃取小柱，流出液弃去，用1mL甲醇洗脱，收集洗脱液，置1mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液；

2)对照品溶液的制备：分别称取优香芹酮、樟脑、莪术二酮、吉马酮、姜黄烯酮、莪术酮和莪术烯醇对照品适量，置于同一容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成优香芹酮、樟脑、莪术二酮、吉马酮、姜黄烯酮、莪术酮和莪术烯醇经适当稀释后得最终质量浓度介于0.1mg/mL～1.0mg/mL的单个对照品溶液；

3)测定方法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，得到色图谱，根据色谱图计算供试品溶液中的有效成分含量；

其中，液相色谱系统条件：

色谱柱：C₁₈(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈(A)-0.02％甲酸水溶液(B)梯度洗脱，洗脱条件：0-5min，40％A；5-50min，40％-60％A；50-60min，60％-100％A；60-65min，100％A；65.01-75min，40％A；流速1.0mL/min；检测波长254nm；柱温35℃；进样量：20μL。

本发明进一步提供一种醒脑静注射液液相标准图谱的建立方法，步骤如下：

1)取多批次合格的醒脑静注射液，倾出内容物，混匀，精密吸取5mL，通过C₈固相萃取小柱，流出液弃去，用1mL甲醇洗脱，收集洗脱液，置1mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液；

2)吸取供试品溶液，注入液相色谱仪，得到色图谱，根据所得到的多批合格产品的色谱图，用指纹图谱软件归一成一个醒脑静注射液标准对照液相指纹图谱，其中吸收峰总计为11个；

其中，所述液相色谱的色谱条件如下：

色谱柱：C₁₈(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈(A)-0.02％甲酸水溶液(B)梯度洗脱，洗脱条件：0-5min，40％A；5-50min，40％-60％A；50-60min，60％-100％A；60-65min，100％A；65.01-75min，40％A；流速1.0mL/min；检测波长254nm；柱温35℃；进样量：20μL。

本发明的测定方法是经过筛选获得的，筛选过程如下：

1.仪器与试剂

1.1仪器

日本岛津LC-20AT高效液相色谱仪(SIL-20A自动进样器、CTO-10AS柱温箱、检测器：SPD-M20A)，Labsolutions色谱工作站；1/10万电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司，瑞士)。

1.2试剂

莪术二酮(批号E-009-110603)和吉马酮(批号111665-201103)购自成都彼斯特生物科技有限公司。樟脑(批号Z-018-140801)购自成都瑞芬思生物科技有限公司。优香芹酮(2，6，6-三甲基-2，4-环庚烯-1-酮)、姜黄烯酮、莪术烯醇和莪术酮均由本实验室自制，经NMR和MS确定结构。以上对照品经HPLC测定纯度>98％。

2.色谱系统条件：

色谱柱：C₁₈(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈(A)-0.02％甲酸水溶液(B)梯度洗脱，洗脱条件：0-5min，40％A；5-50min，40％-60％A；50-60min，60％-100％A；60-65min，100％A；65.01-75min，40％A；流速1.0mL/min；检测波长254nm；柱温35℃；进样量：20μL。

3.供试品溶液制备

取醒脑静注射液3～5支，倾出内容物，混匀，精密吸取5mL，通过C₈固相萃取小柱，流出液弃去，用1mL甲醇洗脱，收集洗脱液，置1mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

4.对照品溶液制备

分别精密称取优香芹酮、樟脑、莪术二酮、吉马酮、姜黄烯酮、莪术酮和莪术烯醇对照品适量，置于同一容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成一定浓度的混合对照品溶液。

5.方法学验证

5.1稳定性试验

精密吸取同一批号醒脑静注射液(120107)供试品溶液，按色谱条件分别于制样后0h、2h、4h、6h、12h和24h小时进样分析，记录色谱图。各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3％(n＝6)，结果说明供试品的稳定性良好。

5.2精密度试验

精密吸取同一批号醒脑静注射液(120107)供试品溶液，按照色谱条件连续进样6次，记录色谱图。各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3％(n＝6)，结果说明仪器的精密度良好。

5.3重复性试验

取同一批号醒脑静注射液(120107)供试品溶液，各精密吸取6份，分别制备供试品溶液，进样检测，记录色谱图。各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3％(n＝6)，结果说明方法的重复性良好。

5.4样品测定

将21批醒脑静注射液按供试品提取方法提取，并按该指纹图谱测定方法进行测定，记录各色谱图。

6.数据分析

按中国药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》2012年版进行计算，获得每个批次相似度值。样品相似度在0.95～0.99。由相似度结果可知，不同批次样品之间差异较小。

本发明色谱条件的筛选：

(1)色谱柱的选择：

选择ThermoBDSHypersilC₁₈(4.6mm×250mm,5μm)，Topsil-TMC₁₈(4.6mm×250mm,5μm)，DikmaspursilC₁₈(4.6mm×250mm,5μm)，WatersxtcrraC₁₈(4.6mm×250mm,5μm)进行耐用性试验，色谱柱对其分离度有影响，其中WatersxtcrraC₁₈(4.6mm×250mm,5μm)和ThermoBDSHypersilC₁₈(4.6mm×250mm,5μm)，两种色谱柱的分离效果较好。

(2)流动相的选择：选择纯乙腈，纯甲醇，甲醇-水，乙腈-水，乙腈-甲酸水溶液等流动相，进行梯度洗脱，发现乙腈-甲酸水溶液分离效果较好，故选择此流动相。

(3)洗脱条件的选择：本发明采用乙腈-甲酸水溶液等流动相，洗脱条件分别采用等度洗脱，发现其分离度无法达到预期；采用梯度洗脱后，可实现有效成分的分离，最终选择的洗脱条件为：0-5min，40％A；5-50min，40％-60％A；50-60min，60％-100％A；60-65min，100％A；65.01-75min，40％A；

本发明与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、本发明采用液相色谱法，建立的醒脑静注射液液相指纹图谱中共有峰总计11个，能有效的表征醒脑静注射液成分质量，补充了气相指纹图谱及含量测定以外的成分。

2、液相色谱法可有效排除了麝香酮和龙脑含量过高造成的不利影响，更为准确的反应除麝香酮及龙脑外的其他成分情况。

3、指纹图谱注重各个构成指纹特征峰的相互关系，注重整体特征，避免了个别化学成分评估而造成的整体质量的片面性。

4、本发明采用固相萃取小柱进行样品预处理，简单方面、利于操作；并可保证方法的准确度。

5、本方法具有精密度、稳定性、重复性好的优点，且简便、快捷、准确、稳定、可靠，可用于醒脑静注射液质量控制。

下面结合实施例和附图对本发明做进一步的说明。

附图说明

图1醒脑静注射液标准液相指纹图谱

图2醒脑静注射液对照品图谱

图3醒脑静注射液21批液相指纹图谱

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步地说明，以便对本发明作更详细的了解。

实施例1

1)供试品溶液的制备：取醒脑静注射液3～5支，倾出内容物，混匀，精密吸取5mL，通过C₈固相萃取小柱，流出液弃去，用1mL甲醇洗脱，收集洗脱液，置1mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液；

2)对照品溶液的制备：分别称取优香芹酮、樟脑、莪术二酮、吉马酮、姜黄烯酮、莪术酮和莪术烯醇对照品适量，置于同一容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成优香芹酮、樟脑、莪术二酮、吉马酮、姜黄烯酮、莪术酮和莪术烯醇经适当稀释后得最终质量浓度介于0.1mg/mL～1.0mg/mL的单个对照品溶液；

3)测定方法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，得到色图谱，根据色谱图计算供试品溶液中的有效成分含量；

其中，液相色谱系统条件：

色谱柱：C₁₈(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈(A)-0.02％甲酸水溶液(B)梯度洗脱，洗脱条件：0-5min，40％A；5-50min，40％-60％A；50-60min，60％-100％A；60-65min，100％A；65.01-75min，40％A；流速1.0mL/min；检测波长254nm；柱温35℃；进样量：20μL。