一种电化学葡萄糖生物传感器的制备方法及其用于葡萄糖测试的检测方法

摘要

本发明涉及一种电化学葡萄糖生物传感器的制备及其检测方法。一种电化学葡萄糖生物传感器的制备方法，首先将钛酸钙纳米粒子分散在壳聚糖溶液中，配制GOD/CaTiO3/CS混合溶液；然后将制得的GOD/CaTiO3/CS混合溶液修饰到经过预处理的玻碳电极表面，即得到所述电化学葡萄糖生物传感器。利用该制备方法得到的电化学葡萄糖生物传感器对葡萄糖样本进行检测的方法，包括以下步骤：（1）在测试液中，以制得的修饰电极为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂片电极作为对电极，加入葡萄糖样本；（2）然后用电化学工作站检测工作电极的电化学信号。采用钛酸钙纳米粒子固定葡萄糖氧化酶，可以很好地保持生物大分子的生物催化活性。

说明书

技术领域

本发明涉及一种电化学生物传感器的制备方法，尤其涉及一种钛酸钙纳米粒子修 饰的电化学葡萄糖生物传感器的制备方法，以及利用所述电化学葡萄糖生物传感器进行检 测的方法。

背景技术

糖尿病严重危害着人类的健康，因此对于糖尿病的诊断显得尤为重要。通过检测 人体血液中葡萄糖的浓度可以间接得知人们的身体健康状况，为糖尿病的诊断提供一个平 台。

目前，检测葡萄糖浓度的方法有色谱法、分光光度法、旋光度法、比色法等，这些分 析方法灵敏度低、费力、耗时，而使用电化学生物传感器法具有更高的灵敏度，以及分析速 度快、选择性高、仪器操作简单、价格低廉等特点。

近年来，电化学分析法由于其灵敏度高，特异性好，样品消耗量小、简单快速等特 点，成为一种极有竞争力的现场检测方法。

钛酸钙有很多有趣的性质，应用范围很广，可以作为催化剂、半导体、电介质材料， 还可以作为中间体来粘附基体等等；而纳米材料是具有表面效应、体积效应和介电限域效 应等不同于块体材料和原子或分子的介观效应，很多纳米材料具有导电性和完整的表面结 构，可作为电极材料，为电化学分析研究提供了新的研究途径。

目前，缺乏新的灵敏度高、稳定性好的纳米材料电化学葡萄糖传感器的制备方法， 而钛酸钙纳米粒子作为一种新的纳米材料，为传感器的制备提供了新的可能性。

发明内容

本发明提出一种电化学葡萄糖生物传感器的制备方法，将钛酸钙纳米粒子与葡萄 糖氧化酶修饰玻碳电极上，制得电化学生物传感器；

本发明同时公开了利用前述方法制得的钛酸钙纳米粒子的电化学葡萄糖生物传感器 进行葡萄糖检测的方法；

本发明利用钛酸钙纳米粒子固定葡萄糖氧化酶，构建一个电化学生物传感器实现对葡 萄糖的定量检测，对人体血糖的检测、糖尿病的早期诊断具有重要意义。

本发明所采用的技术方案：

一种电化学葡萄糖生物传感器的制备方法，包括步骤如下：

1）将钛酸钙纳米粒子分散在壳聚糖溶液中，配制葡萄糖氧化酶/钛酸钙纳米粒子/壳聚 糖混合溶液；

2）将步骤1）中制得的葡萄糖氧化酶/钛酸钙纳米粒子/壳聚糖混合溶液修饰到经过预 处理的玻碳电极表面，即得到所述电化学葡萄糖生物传感器。

所述步骤1）中，钛酸钙纳米粒子的制备过程如下：

a）称取一定物质的量的四水合硝酸钙和等物质的量的P25二氧化钛放置于坩埚中；b） 在马弗炉中把坩埚加热到550-650°C，保持该温度9-11h,然后冷却至室温，收集钛酸钙 纳米粒子待用。

所述步骤2）中，对玻碳电极的预处理方法如下：将玻碳电极依次用粒径0.3μm和 0.5μm的氧化铝粉抛光，再以去离子水冲洗掉残留的氧化铝粉后，放入稀硝酸水溶液中超声 清洗，最后依次用乙醇和二次蒸馏水清洗玻碳电极，修饰前用氮气快速吹干。

一种利用前述制备方法得到的电化学葡萄糖生物传感器对葡萄糖样本进行检测 的方法，包括以下步骤：

（1）在测试液中，以制得的修饰电极为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂片电 极作为对电极，加入葡萄糖样本；

（2）然后用电化学工作站检测工作电极的电化学信号。

在步骤（1）中，检测条件是：所述测试液为磷酸缓冲盐0.02-0.1molL^-1的溶液；所 述磷酸缓冲盐PBS溶液，其pH值为6.5-7.5。

本发明的有益效果：

1、本发明电化学葡萄糖生物传感器的制备方法，采用钛酸钙纳米粒子具有比表面积 大、生物相容性好、导电性好等优点，利用其固定葡萄糖氧化酶，保持生物大分子的生物催 化活性，提高检测时的电子传递速率，拓宽检测的线性范围。制备的纳米材料电化学葡萄糖 传感器可实现对葡萄糖的定量检测，灵敏度高、稳定性好。

2、本发明电化学葡萄糖生物传感器的制备方法，制备简单、快速、成本低、灵敏度 高，可以用于实际样品中葡萄糖浓度的检测。该传感器通过安培检测得到的i–t曲线来检测 葡萄糖浓度，可将其应用于葡萄糖电化学分析。

3、利用本发明的传感器置于检测体系中，加入葡萄糖，检测其电化学信号。测试方 法无需标记、简单、快速、成本低、灵敏度高、重现性和稳定性好，可以用于人体血糖葡萄糖 浓度的检测。为了提高检测的准确性，本发明还在涂覆钛酸钙纳米材料的混合溶液前，将玻 碳电极依次用粒径0.3μm和0.5μm的氧化铝粉抛光，再以去离子水冲洗掉残留的氧化铝粉 后，放入稀硝酸水溶液中超声清洗，最后依次用乙醇和二次蒸馏水清洗玻碳电极，修饰前用 氮气快速吹干，以此制得预处理的玻碳电极。

4、本发明检测方法，对缓冲溶液的pH、安培检测中的电位进行了优化，并获得了最 佳的葡萄糖检测条件，提高了分析效果。用于检测人体血糖浓度，有助于糖尿病的检测，方 法简单、快速、成本低、灵敏度高、重现性和稳定性好。

附图说明

图1是钛酸钙纳米粒子（A）、钛酸钙纳米粒子和壳聚糖的溶液（B）、葡萄糖氧化酶溶解于 钛酸钙纳米粒子和壳聚糖的溶液（C）修饰到玻碳电极上干燥后的扫描电镜图(SEM)；

图2是CS(曲线a)，CaTiO₃（曲线b）和CaTiO₃/CS（曲线c），GOD（曲线d），GOD/CS（曲线e）， GOD/CaTiO₃/CS（曲线f）的紫外吸收图谱；

图3是裸玻碳电极和不同修饰材料的交流阻抗图；

图4是不同的修饰电极在0.1MpH7.0的N₂饱和的PBS中的循环伏安图；

图5是GOD/CaTiO₃/CS/GCE修饰电极在0.1MpH7.0PBS中，连续加入葡萄糖不同浓度 的得到的i–t安培响应曲线。

具体实施方式

下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

实施例1

本发明电化学葡萄糖生物传感器的制备方法，通过如下步骤：

1）将钛酸钙纳米粒子（CaTiO₃）分散在壳聚糖（CS）溶液中，配制葡萄糖氧化酶（GOD）/钛 酸钙纳米粒子/壳聚糖混合溶液（即：GOD/CaTiO₃/CS混合溶液）；

2）将步骤1）中制得的GOD/CaTiO₃/CS混合溶液修饰到经过预处理的玻碳电极表面，最 终制得所述电化学葡萄糖生物传感器。

实施例2

本实施例所述的电化学葡萄糖生物传感器的制备方法，其与实施例1的不同之处在于： 进一步公开了步骤1）中，钛酸钙纳米粒子的制备过程：

a）称取一定物质的量的四水合硝酸钙（Ca（NO₃）₂·4H₂O）和等物质的量的P25二氧 化钛（P25TiO₂）放置于坩埚中；

b）在马弗炉中把坩埚加热到550-650°C，保持该温度9-11h,然后冷却至室温，收集 钛酸钙纳米粒子待用。

实施例3

本实施例所述的电化学葡萄糖生物传感器的制备方法，其与实施例1或实施例2的不同 之处在于：步骤2）中，对玻碳电极的预处理方法如下：将玻碳电极依次用粒径0.3μm和0.5μm 的氧化铝粉抛光，再以去离子水冲洗掉残留的氧化铝粉后，放入稀硝酸水溶液中超声清洗， 最后依次用乙醇和二次蒸馏水清洗玻碳电极，修饰前用氮气快速吹干。

实施例4

本实施例所述的电化学葡萄糖生物传感器的制备方法，其与前述各实施例的不同之处 在于：所述步骤1）：在超声条件下，将1.0-3.0mg钛酸钙纳米粒子（CaTiO₃）分散在1.0mL 0.5%的壳聚糖（CS）溶液中，取配好的CaTiO₃/CS溶液用于配制10-20mgmL^-1的GOD/ CaTiO₃/CS混合溶液，搅拌15分钟(溶解时转速快易导致葡萄糖氧化酶失活，因此需要以1- 2r/s的速度缓慢搅拌）。

实施例5

本实施例所述的电化学葡萄糖生物传感器的制备方法，其与实施例4的不同之处在于： 所述步骤2）中：将步骤1）中制得的含有钛酸钙纳米粒子/葡萄糖氧化酶/壳聚糖（GOD/ CaTiO₃/CS）的混合溶液3.0-7.0μL均匀地涂覆于预处理的玻碳电极（d=2-4mm）表面，置于4 ℃的温度环境下，干燥后制得GOD/CaTiO₃/CS修饰电极。

实施例6

本实施例为利用前述制备方法得到的电化学葡萄糖生物传感器对葡萄糖样本进行检 测的方法，包括以下步骤：

（1）在测试液中，以制得的修饰电极为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂片电 极作为对电极，加入葡萄糖样本；

（2）然后用电化学工作站检测工作电极的电化学信号。

所述的检测方法，在步骤（1）中，检测条件是：所述测试液为磷酸缓冲盐0.02- 0.1molL^-1的溶液（即PBS溶液）；所述磷酸缓冲盐PBS溶液，其pH值为6.5-7.5。

本发明利用纳米材料的特殊性能来控制酶的活性，采用CaTiO₃纳米粒子以及壳聚 糖的生物兼容性构建了一种生物传感器。下述通过实验说明，本发明基于GOD/CaTiO₃/CS修 饰GCE的生物传感器不但对葡萄糖有良好的催化活性，而且重复性及稳定性很好。

1.实验部分

1.1试剂

葡萄糖氧化酶（GOD，EC1.1.3.4，108Umg^–1，Aspergillusniger）购买自Amresco， D–(+)–葡萄糖和nafion购自Sigma-Aldrich公司，四水合硝酸钙（Ca（NO₃）₂·4H₂O，A. R.，金山化工厂），二氧化钛（P25TiO₂，A.R.，上海苏懿化学试剂有限公司）。磷酸缓冲液 （PBS）是用0.1MNa₂HPO₄和NaH₂PO₄溶液由pH计调节到所需值。其它试剂均为分析纯并用 去离子水配制。

1.2仪器

电化学测量是在CHI852C（USA）电化学工作站上完成。实验采用三电极体系，玻碳电极 GCE（Φ=3mm）为工作电极，铂电极作对电极，饱和甘汞电极作参比电极（SCE）。循环伏安实 验都是在100mVs^–1的扫速下进行的（除非有特殊说明），pH值的测量是在S–25测量仪上完 成的。

电化学交流阻抗实验是在含有5.0mMFe(CN)₆^3-/Fe(CN)₆^4-（1:1）混合物的0.1M KNO₃溶液中进行，频率范围为10^-2–10⁵Hz，交流电位的幅度为0.18V。

扫描电镜（SEM）S–4800，日本，电压15kV；傅里叶红外（FT–IR）光谱Tensor27 Bruker公司，德国；紫外光谱（UV–vis）UV–2500，Shimadzu公司，日本。

1.3CaTiO₃的合成及酶传感器的制备

称取5mmolCa(NO₃)₂·4H₂O和等摩尔的P25TiO₂放置于坩埚中。用马弗炉对坩埚 加热到600°C，保持600°C10h,然后冷却至室温，收集起来用来做分析鉴定。

GCE首先依次用0.3和0.5μm的Al₂O₃处理，然后用二次水冲洗，再用1:1的HNO₃、丙 酮和二次水超声处理，在室温干燥。3.0mgCaTiO₃分散在1.0mL0.5%CS溶液中，取配好 的CaTiO₃/CS溶液配10mgmL^-1的GOD/CaTiO₃/CS溶液在缓慢搅速下搅拌15分钟后，取混合 溶液5.0μL分散液滴在处理好的GCE上，置于4^oC的冰箱中保存，干燥后制得GOD/CaTiO₃/CS 修饰电极，然后用去离子水冲洗去除没有固定的酶分子。当不用的时候，制备好的电极应该 放在0.1MpH7.0PBS溶液中在4^oC的冰箱中保存。

1.4电化学检测过程

循环伏安和安培检测在室温下电解池中进行。安培检测在搅拌的体系中完成，施加电 位为–0.45V。电流稳定后，每间隔30s，加入待测物。对葡萄糖的检测是通过加不同体积的 葡萄糖储备液到空气饱和的缓冲溶液中进行的。

2.结果与讨论

2.1材料的表征

参见图1扫描电镜图，SEM图表征了CaTiO₃（A）、CaTiO₃/CS（B）和GOD/CaTiO₃/CS（C），从图 上可以看出，CaTiO₃呈现规则的结构（A），CaTiO₃被CS的薄层所包裹（B），CaTiO₃表面呈现出 糊状的结构，说明GOD已经均匀的填充到CaTiO₃空隙当中。

图2是CS(曲线a)，CaTiO₃（曲线b）和CaTiO₃/CS（曲线c），GOD（曲线d），GOD/CS（曲线 e），GOD/CaTiO₃/CS（曲线f）的紫外吸收图谱。GOD在273nm和380、454nm弱的吸收归咎于蛋 白质结构中的多肽链和羰基的吸收峰。而酶包裹的复合物即GOD/CaTiO₃/CS（曲线f）的吸收 峰的位置和形状和纯的GOD的吸收峰位置和形状基本一致，这表明固定在CaTiO3/CS材料中 的GOD保持良好的活性。

图3是裸玻碳电极和不同修饰材料的交流阻抗图，其中a：GCE；b：CS/GCE；c： CaTiO₃/CS/GCE；d：GOD/CaTiO₃/CS/GCE。电化学阻抗图谱是表征电极表面性质和电子传递 过程的有力工具。高频处的半圆对应着限制过程中的电子转移，低频处的直线对应着分散 过程。半圆的半径等同于电子转移阻抗（R_et），控制着电极表面氧化还原探针的电子转移动 力学。由图3看出，CaTiO₃有助于电子传递，能够提供一个类似电子传导隧道的微环境，当 CaTiO₃/CS的复合材料负载酶时，半圆半径变大，即阻抗增大，说明GOD已经成功地固定在电 极表面。

2.2GOD/CaTiO3/CS/GCE的直接电化学

参见图4，给出了不同修饰电极的循环伏安图。在N₂饱和的0.1MpH7.0PBS中的CS/ GCE(a)；CaTiO₃/CS/GCE(b)；GOD/Cs/GCE(c)；GOD/CaTiO₃/CS/GCE(d)的循环伏安图。扫速为： 100mVs^–1。从图4看出，CaTiO₃/CS/GCE（b）没有氧化还原峰出现，负载酶之后出现了一对 GOD的典型的Fe(III)/Fe(II)的可逆氧化还原峰（d），而且在由材料负载酶之后的循环伏安 图峰电流明显大于单独的活性酶的峰电流，峰电流是活性酶的3.53倍。由此说明该材料有 助于负载酶，加大了酶和电极之间的电子传递。E_pa=–0.412V，E_pc=–0.459V，△E_p=47mV， i_pa/i_pc≈1，根据59/n=47mV，可计算得知，GOD在该复合材料修饰的电极上是两个电子的 传递过程。

2.3GOD/CaTiO₃/CS/GCE对葡萄糖的电催化行为

固定在CaTiO₃/CS修饰电极上的GOD保持了其原有的生物活性，对葡萄糖有良好的催化 性能。修饰电极对葡萄糖的响应机理为：

GOD(FAD)+2e^–+2H⁺?GOD(FADH₂)（1）

GOD(FAD)+Glucose?GOD(FADH₂)+Gluconolactone（2）

上述两反应竞争FAD，当溶液中有氧气存在，就会发生下面的反应

GOD(FADH₂)+O₂→GOD(FAD)+H₂O₂（3）

（上述式子中：FAD黄素腺嘌呤二核苷酸，FADH₂还原型黄素腺嘌呤二核苷酸）

随着葡萄糖浓度的增加，还原峰电流减小，由此提出了葡萄糖传感器。在一定的范围 内，葡萄糖的量与还原峰电流的减小值成正比。

图5是GOD/CaTiO₃/CS/GCE在连续搅拌、空气饱和的0.1MpH7.0的PBS缓冲液中 连续滴加不同浓度的葡萄糖溶液得到的i–t安培响应曲线。电压为–0.45V，内插图揭示了 响应信号与葡萄糖浓度的关系。线性响应范围7.0×10^?6M–1.49×10^?3M，线性方程为：I(μA )=0.0744+0.995C(mM)R=0.9995，灵敏度：14.10±0.5mAM^?1cm^?2，检出限：2.3×10^?6M （S/N=3）。

干扰试验是在搅拌的情况下，在0.1MpH7.0PBS中加入0.2mM葡萄糖，尿酸和 抗坏血酸来进行的。实验结果表明，尿酸或抗坏血酸存在时几乎不会引起还原电流明显的 改变，这些物质不会干扰传感器的电流响应。通过修饰电极对0.1mM葡萄糖的电流响应可 考察传感器测定的精密度。在最优化条件下重复制作5个葡萄糖传感器，平行进行10次测 定，相对标准偏差为2.1%，分别加入0.05mM葡萄糖测定20次，相对标准偏差为0.75%，表 明该传感器有较好的重现性。

GOD/CaTiO₃/CS/GCE不用时可在0.1MpH7.0PBS中在4^oC的冰箱中保存，三个 星期以内没有观察到酶电极对葡萄糖的安培响应降低，酶电极保存25天后仍能保持初始电 流响应的93%，说明GOD/CaTiO₃/CS/GCE能够有效地保持葡萄糖氧化酶的活性，并能防止酶 泄漏，这是因为壳聚糖的包裹性能。

2.4实际样品的检测

为了证明该葡萄糖传感器的实际使用性，对未经处理的实际血清样品进行了检测。实 际样品的检测是在连续搅拌、空气饱和的pH7.0的PBS缓冲溶液中连续滴加不同浓度的血 清得到的。计算得血清中葡萄糖浓度为4.3mM，跟用分光光度法测得的4.12mM接近。然后 在血清样品中分别加入0.1mM、0.2mM葡萄糖，回收率分别为104.8%、103.8%，检测结 果如下表1所示，结果表明，该修饰电极在实际血清样品检测中具有很好的准确性。

表1血清中葡萄糖的测定值

3.结论

本研究制备了CaTiO₃纳米粒子，利用CaTiO₃纳米粒子大的比表面积，壳聚糖的优良性 能为一体修饰电极固定GOD，实现了酶与电极表面之间的快速直接电子传递。实验结果表 明，利用该纳米材料来固载葡萄糖氧化酶，能保持其良好的生物活性。所固定的酶分子表现 出表面控制、可逆的两电子两质子的转移过程，电子转移速率常数k_s为3.35s^-1。该酶电极 对葡萄糖响应的浓度范围为7.0×10^?6M–1.49×10^?3M，检测限为2.3×10^?6M（S/N=3），灵敏 度为14.10±0.5mAM^?1cm^?2。利用该方法制备的葡萄糖电化学生物传感器具有良好的重复 性、优良的选择性和可接受的寿命，能够成功应用于血清中葡萄糖的选择性测定。