用作偏振敏感荧光探针的混合半导体聚合物纳米颗粒

摘要

混合纳米颗粒的组合物、制备方法和使用方法包含至少一种半导体聚合物和至少一种非半导体聚合物的混合纳米颗粒的组合物、制备方法和使用方法还包含至少一种半导体聚合物和非半导体聚合物，其中该非半导体聚合物包含超过一种非半导体聚合物，使得至少一种非半导体聚合物经官能化用于生物共轭。本发明的混合纳米颗粒是偏振敏感的并且具有低质量比率和大荧光。

说明书

交叉参考

本申请要求2013年7月8日提交的美国临时申请号61/843,796的权益，该申请通过引用全文纳入本文用于所有目的。

背景

理解生物系统的进展依赖于应用荧光显微术、流式细胞术、通用生物试验和生物传感器。对开发用作这些和其他平台的检测试剂的更亮且更光稳定的荧光探针存在相当的兴趣。持续探索半导体聚合物用于这类应用。

发明概述

在多个方面中，本发明提供了偏振敏感的纳米颗粒，其包括：发色聚合物；第一基质聚合物；和第二基质聚合物，其中偏振敏感纳米颗粒具有至少一个1nm至1000nm的临界尺寸。

在多个方面中，本发明提供了包含本发明的偏振敏感纳米颗粒的颗粒，其中该颗粒是量子点、金纳米颗粒或铁纳米颗粒。

在多个方面中，本发明提供了包含溶液中的多个本发明的偏振敏感纳米颗粒的组合物，其中该组合物是单一分散剂。

在多个方面中，本发明提供了分子靶标的方法，该方法包括使本发明的偏振敏感纳米颗粒中的任一种与靶标结合；用足够产生荧光信号的电磁辐射照射纳米颗粒；并且检测荧光信号。

在多个方面中，本发明提供了分子靶标的方法，该方法包括使本发明的偏振敏感纳米颗粒中的任一种与靶标结合；用足够产生荧光信号的偏振化电磁辐射照射纳米颗粒；并且检测荧光信号。

通过引用纳入

本说明书中提到的所有发表物和专利申请通过引用纳入本文，就好像将各篇单独的发表物和专利申请特别和单独地通过引用纳入本文那样。

附图的简要说明

所附权利要求书中具体说明了本发明的新特征。可参考以下说明和附图更好地理解本发明的特征和优点，这些详述列出利用本发明原理的说明性实施方式：

图1是显示使用纳米沉淀和后续生物共轭制备聚合物混合纳米颗粒的示意图。

图2显示了本发明的一个方面的偏振敏感纳米颗粒的主体荧光和性质，包括(A)聚合物纳米颗粒的吸收和发射光谱，(B)官能化之前(散列)和官能化之后(未散列)的数均纳米颗粒动态直径。

图3显示个体偏振敏感纳米颗粒的偏振，按照本发明的一个方面包括(A)位移台旋转，(B)分到两个正交偏振的通道的单个聚合物纳米颗粒的发射光，和(C)激发偏振旋转期间单个聚合物纳米颗粒的发射光。

图4显示了本发明的一个方面的聚合物杂交纳米颗粒的偏振敏感性，包括(A)分子内激子转移，(B)由聚合物纳米颗粒的荧光半衰期衰减覆盖的时间分辨的荧光各向异性衰减。

图5显示了使用本发明的一个方面的偏振敏感聚合物纳米颗粒检测微管旋转，包括(A)显示由与玻璃基材结合的驱动蛋白移动的滑移微管的示意图，(B)当微管由2种不同形式的驱动蛋白运输时测量的微管旋转周期，和(C)单个微管的踪迹。

图6证明了本发明的一个方面的生物共轭的偏振敏感纳米颗粒的ζ电势。

图7证明了本发明的一个方面的偏振敏感纳米颗粒的量子产率。

图8是本发明的一个方面的单个聚合物混合纳米颗粒和单个量子混合纳米颗粒的强度时间踪迹。

图9显示了按照本发明的一个方面比较偏振敏感纳米颗粒和Qhybrid纳米颗粒525的单个颗粒亮度直方图。

发明详述

半导体聚合物纳米颗粒作为荧光标签提供了许多优势(Wu，C.，Chem.Int.Edit.2013，52，3086-3109)。它们是亮的(Wu，C.，J.Am.Chem.Soc.2010，132，15410-15417)，发射足够的光子使得以纳米精度追踪(Yu，J.，J.Am.Chem.Soc.2009，131，18410-18414)。在一些方面中，使用纳米沉淀方法从大范围的荧光聚合物制备半导体聚合物纳米颗粒(Hashim，Z.，J.Mater.Chem.2011，21，1797-1803；Zhang，X.，ACSNano.2012，6，5429-5439)，使得吸收和发射光谱根据特定应用调节(Rong，Y.，ACSNano.2013，7，376-384)。聚合物的小尺寸和紧密堆积能够使向掺杂的染料转移充足的能量(Jin，Y.，ACSNano.2011，5，1468-1475)。在一些方面中，混合纳米颗粒具有挠性表面化学。在某些方面中，用抗体或其他蛋白质使混合纳米颗粒官能化(Jin，Y.，ACSNano.2011，5，1468-1475；Wu，C.，Chem.Int.Ed.2010，49，9346-9440；Wu，C.，Chem.Int.Ed.2011，50，3430-3434；Petkau，K.，J.Am.Chem.Soc.2011，133，17063-17071)来以高度特异性结合广泛的靶标。在一些方面中，也包括其他混合纳米颗粒，如量子点或金或铁混合纳米颗粒(Chan，Y.，J.Am.Chem.Soc.2012，134，7309-7312)。多种用于形成半导体混合纳米颗粒的聚合物已经显示出对本发明的用途而言是生物相容的和可及的(Medina，C.，J.Pharmacol.2007，150，552-558)。

混合纳米颗粒中电子激发的共轭的聚合物经过沿着聚合物链的激发能量转移(EET)(Zhou，Q.，J.Am.Chem.Soc.1995，117，12593-12602)并且转移吸收的能量到发生光发射的区段(G.，Adv.Mater.1999，11，115-119)。这通过将能量从较高能量的半导体聚合物链上的局部区域转移至优选发射的较低能量区域发生(Nguyen，T.，J.Chem.Phys.1999，110，4068-4078；Jakubiak，R.，J.Phys.Chem.A.1999，103，2394-2398；Yu，J.，Science.2000，289，1327-1330)。

本发明的某些实施方式涉及一类新的混合半导体偏振敏感纳米颗粒，其包含半导体聚合物和非半导体聚合物，其在本文中也称为“基质聚合物”。在一些方面中，用官能团和/或生物分子共轭物修饰的偏振敏感纳米颗粒用于多种应用，包括但不限于：流式细胞术、荧光激活的分选、免疫荧光、免疫组化、荧光多重化(fluorescencemultiplexing)、单分子成像、单颗粒追踪、蛋白质折叠、蛋白质转动动力学、DNA和基因分析、蛋白质分析、代谢物分析、脂质分析、基于FRET的传感器、高通量筛选、细胞成像、体内成像、生物正交标记、点击反应、如免疫试验和基于酶的试验以及生物试验和测量中的多种荧光技术。

虽然不希望受到任意特定理论或概念的限制，本发明部分基于从聚合物，例如，半导体聚合物和/或非半导体聚合物形成混合纳米颗粒很大部分受到分子内和/或分子间聚合物相互作用驱动的概念。例如，由于分子内和/或分子间疏水性相互作用形成偏振敏感纳米颗粒，该相互作用导致单个聚合物分子或多个聚合物分子形成偏振敏感纳米颗粒。在一些方面中，聚合物上的亲水性基团(如侧链上的那些)干扰混合纳米颗粒稳定性和光物理性质以及细胞靶向。例如，沿着聚合物的官能团的密度和/或位置可能影响混合半导体聚合物纳米颗粒的形成和稳定性以及性能。如本文所述，本发明提供了包括经任选官能化以在生物应用中提供偏振敏感纳米颗粒的有利的纳米颗粒堆叠和内部结构、高荧光亮度和低非特异性结合的半导体聚合物的混合偏振敏感纳米颗粒的实施方式。此外，本发明提供可用于使混合半导体聚合物纳米颗粒进行生物共轭的同时也保持稳定性和性能的方法和组合物。例如，这些实施方式涉及混合半导体聚合物纳米颗粒中官能团的位置和/或密度，其依赖于官能团的亲水性/疏水性。

本发明还描述了以低的对基质聚合物的质量比率掺混荧光共轭的半导体聚合物以产生混合半导体聚合物纳米颗粒。在多个方面中，混合半导体聚合物纳米颗粒具有高荧光偏振各向异性的固定的链区段。在一些方面中，本发明的荧光共轭的半导体聚合物具有偏振的荧光强度。在一些方面中，从本发明的纳米颗粒发出的偏振化的荧光强度随着纳米颗粒的旋转变化。在多个方面中，测量荧光强度的变化。在其他实施方式中，推导出偏振化的荧光强度变化。在多个方面中，本发明的混合半导体聚合物纳米颗粒接合至蛋白质或其他感兴趣的靶标。在多个方面中，混合半导体聚合物纳米颗粒发射偏振化的光。在一些方面中，观察偏振化的光的强度变化使得能够确定混合半导体聚合物纳米颗粒接合的蛋白质或其他感兴趣靶标的位置。例如，随着混合半导体聚合物纳米颗粒移动，得到蛋白质取向以及空间信息的变化。

应理解，给出数值范围时，除非文中另有明确说明，该范围上下限之间、以下限单位的十分之一为间隔的各间插数值，以及所述范围的任何其它指出或间插数值均包括在本发明范围内。所述较小范围内独立地包含这些较小范围的上下限，它们也属于本发明范围，除非明确地排除所述范围的上下限。所述范围包含一个或两个限值时，排除这一个或两个限值以外的范围也包括在本发明范围内。

除非另外定义，本文中所使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的同样含义。虽然采用与本文所述类似或等同的任何方法、装置和材料实施或测试本发明，但现在描述优选的方法、装置和材料。

除非说明书和权利要求书中明确说明，术语“包括”、“包含”等应被认为是包括性含义，而不是排他性或穷举性含义，也就是说，其含义是“包括但不限于”。使用单数或多数的词语也分别包括多数和单数。另外，“本文”、“上文”和“下文”和类似重要词语在本申请中使用时应该整体指代本申请并且不是指代本申请的任意具体部分。

描述的本发明的实施方式不意在穷尽或限定公开到所公开的精确形式。尽管本文描述了本公开的特定实施方式和实施例以用于说明目的，但可在本公开范围内有多个等同修改，如相关领域技术人员所知。

所有参考文献通过引用纳入本文。如果需要，本发明的实施方式经修饰以采用上述参考文献和申请的系统、功能和概念以提供本公开的其他实施方式。根据详细说明对本发明进行这些和其他改变。

任意前述实施方式的具体元素可组合或替代其他实施方式中的元素。此外，尽管在本发明的某些实施方式中已经描述了与这些实施方式相关的优点，但是其他实施方式也能展示这类优点，并且并非所有的实施方式必须显示这类优点才落入本发明的范围。本发明的其它特征和优点将部分在随后的描述中陈述，部分由该描述可明显看出，或可通过实施本发明而了解到。

本文所用术语“发色混合纳米颗粒”或“发色聚合物混合纳米颗粒”是指包括一种或多种已经塌缩成稳定的亚微米尺寸颗粒的聚合物(例如，发色聚合物)。术语“混合纳米颗粒”、“聚合物混合纳米颗粒”、“偏振敏感纳米颗粒”、“发色混合纳米颗粒”和“发色聚合物混合纳米颗粒”在本文中互换使用以指代本发明的纳米颗粒。本发明提供的发色偏振敏感纳米颗粒可通过塌缩聚合物领域的任何已知方法形成，包括但不限于，依赖沉淀的方法(如纳米沉淀)、依赖乳液(如细乳液(miniemulsion)或微乳液(microemulsion))形成的方法和依赖缩聚的方法。在某些方面中，通过纳米沉淀形成发色混合纳米颗粒。本文所用术语“发色聚合物”是其中至少一部分的聚合包括发色单元的聚合物。术语“发色团”给出其在本领域中的普通含义。发色团从UV到近红外区中吸收光的某些波长。在一些方面中，发色团发光。

发色偏振敏感纳米颗粒是具有发光性质的π-共轭物质。这些发色偏振敏感纳米颗粒包含具有一个或多个重复单元的聚合物，其在一些方面中可以固定、有序或随机配置和比例组合。重复单元是在整个聚合物上出现的单体或化学基序，例如芳族或杂环单元。在一些方面中，该聚合物是卤素化的，例如，氟化、氯化、溴化或碘化。在某些方面中，聚合物、重复单元或单体在一个或多个位点上卤素化。在一些方面中，卤化聚合物(如氟化聚合物)提供比非卤化类似聚合物更高水平的荧光。在多个方面中，发色聚合物混合纳米颗粒包含一种或多种共轭聚合物(如半导体聚合物)的结果，其已塌缩为稳定的亚微米尺寸颗粒。在多个方面中，发色偏振敏感纳米颗粒包含具有至少一个塌缩的共轭的聚合物的荧光混合纳米颗粒。

本文所用术语“聚合物”指由至少两个重复结构单元组成的分子，通常通过共价化学键连接。在一些方面中，重复结构单元是一种类型的单体，且所得聚合物是均聚物。在一些方面中，这些聚合物包含两种不同类型的单体，或三种不同类型的单体，或更多类型的单体。用于合成共轭聚合物的单体的示例包括但不限于：苯、芴、苯并噻二唑；噻吩、BODIPY；卟啉、芘、方酸菁，及其衍生物。本领域普通技术人员应理解，不同类型的单体可以多种方式沿聚合物链分布。例如，在一些方面中，三种不同类型的单体沿聚合物随机分布。类似地，应理解，单体沿聚合物的分布以不同方式呈现。在一些方面中，沿着聚合物长度的重复结构单元(例如，单体)的数量表示为“n”。在一些方面中，n的范围可以是，例如，至少2，至少100、至少500、至少1000、至少5000、或至少10000、或至少100000，或更高。在某些实施方式中，n的范围可以是2至10000、20至10000、20至500、50至300、100至1000、或500至5000。

聚合物一般具有包括任选含有侧基的主链的延伸的分子结构。在多个方面中，本文提供的聚合物包括，但不限于，线性聚合物和分支聚合物，如星状聚合物、组合聚合物、刷状聚合物、梯标和枝状聚合物。本文所述的某些方面中的聚合物包括半导体聚合物，其中的一些是本领域一般知晓的。在某些实施方式中，本发明的聚合物(例如，半导体聚合物)包括沿聚合物主链没有三键的聚合物，即本发明的聚合物是具有由单键、双键或其组合组成的主链的聚合物。在一些方面中，沿着聚合物主链的单体将仅通过单键或双键(例如，碳键)连接。在一些方面中，聚合物的结构特征(例如，刚性)影响聚合物是否折叠成紧密的混合纳米颗粒。例如，在某些方面中，包括重复三键单元的聚合物比包括沿主链包括单键和/或双键的那些聚合物更刚性。在某些方面中，这导致混合纳米颗粒的复杂堆叠和相性质，产生变宽的发射光谱(Wu，C.，J.ACSNano2008，2，2415-2423)。

本发明还提供了聚合物的变体。在一些方面中，聚合物的变体是共轭聚合物。在多个方面中，共轭发色偏振敏感纳米颗粒称为发色偏振敏感纳米颗粒。在一些方面中，卤素(如氟)接合或整合至发色聚合物混合纳米颗粒结构。发色聚合物偏振敏感纳米颗粒的粒度可与Qhybrid纳米颗粒的粒度相当，例如大于Qhybrid纳米颗粒尺寸的80％。在多个方面中，发色偏振敏感纳米颗粒中的半导体聚合物以占总纳米颗粒组合物至少50％的总质量百分比存在。在其他方面中，半导体聚合物的质量百分比占总纳米颗粒组合物的至少80％。在多个方面中，发色偏振敏感纳米颗粒包含疏水性聚合物内腔。在一些方面中，发色聚合物混合纳米颗粒的卤素(如氟)含量小于50重量％。在一些方面中，偏振敏感纳米颗粒中的半导体聚合物的质量百分比大于40％、50％、60％、70％、80％、90％或99％。在一些方面中，偏振敏感纳米颗粒中的半导体聚合物的质量百分比为约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约99％。在一些方面中，偏振敏感纳米颗粒中半导体聚合物的质量百分比的范围是40％-50％、45％-55％、50％-60％、55％-65％、60％-70％、65％-75％、70％-80％、75％-85％、80％-90％、85％-95％或90％-100％。在一些方面中，偏振敏感纳米颗粒中半导体聚合物的质量百分比的范围是约40％-50％、约45％-55％、约50％-60％、约55％-65％、约60％-70％、约65％-75％、约70％-80％、约75％-85％、约80％-90％、约85％-95％或约90％-100％。

本文中，通过书写主要发色物质的种类来表示“发色共聚物”。例如，PFBT是含有特定比例的芴和苯并噻唑单元的发色聚合物。在一些方面中，连接号用于表示次要发色物质的百分比，之后是次要发色物质的种类。例如，PF-0.1BT是含有90％PF和10％BT的发色共聚物。

本发明的“发色单元”包括但不限于，具有离域的π-电子的结构的单元、小有机染料分子的单元、和/或金属络合物的单元。发色聚合物的示例包括包含具有离域的π-电子的结构的单元的聚合物，如半导体聚合物、包含小有机染料分子单元的聚合物、包含金属络合物单元的聚合物、和包含其任意组合的单元的聚合物。

本文所用术语“官能团”指满足下述条件的任何化学单元，其能够如通过任何稳定的物理或化学连接与参考化合物接合，从而使发色聚合物混合纳米颗粒的表面可用于共轭。官能团在本文中也称为“反应性官能团”或“官能化部分”。

在多个方面中，本发明的聚合物能够用官能团官能化，包括但不限于，发色聚合物，第一基质聚合物和/或第二基质聚合物。偏振敏感纳米颗粒内含有的聚合物之一或全部能够独立地被官能团官能化。

本文所用术语“亲水性部分”是指增加聚合物的亲水性的化学单元。在一些方面中，亲水性部分包括亲水性官能团。在某些实施方式中，亲水性部分包括与亲水性官能团不同的非反应性亲水性部分。例如，在一些方面中，非反应性亲水性部分包括非离子性、非反应性亲水性部分，如水溶性聚合物(例如，聚乙二醇(PEG))。在其他方面中，非反应性亲水性部分也包括离子型非反应性亲水性部分，如正离子物质、负离子物质、和两性离子物质或其组合。

本文所用术语“亲水性官能团”是指在自然中亲水的官能团或者与亲水性侧链或亲水性部分接合的疏水性官能团，这赋予该疏水性官能团比自然中更大的亲水性并且促进疏水性官能团排列在发色聚合物混合纳米颗粒表面上而不是埋在发色聚合物混合纳米颗粒的疏水性核心内。通过接合至亲水性侧链或部分而被赋予更多亲水性的疏水性官能团的示例包括但不限于接合至亲水性侧链如PEG(聚乙二醇)或任意其他亲水性侧链的炔、张力炔、叠氮化物、二烯、烯烃、环辛炔和膦基(用于点击反应)和其他生物正交反应的基团。如本文所述，接合至亲水性侧链或亲水性部分的疏水性官能团在颗粒形成之前接合至聚合物，即预官能化。在一些方面中，接合至亲水性侧链或亲水性部分的疏水性官能团适于生物共轭。

在某些实施方式中，官能团包括在自然中亲水并且接合至聚合物(例如，在侧链上)的亲水性官能团。在一些方面中，亲水性官能团包括，羧酸或其盐、氨基、巯基、叠氮基、醛、酯、羟基、羰基、硫酸盐、磺酸盐、磷酸盐、氰酸盐、琥珀酰亚胺酯、其取代的衍生物。在某些实施方式中，亲水性官能团包括，羧酸或其盐、氨基、巯基、叠氮基、醛、酯、羟基、羰基、硫酸盐、磷酸盐、氰酸盐、琥珀酰亚胺酯、及其取代的衍生物。在某些实施方式中，亲水性官能团适于生物共轭。在一些方面中，亲水性官能团适于生物共轭，并且也在水溶液中稳定(例如，不水解的基团)。本领域的普通技术人员可在例如BioconjugateTechniques(《生物共轭技术》)(学术出版社(AcademicPress)，纽约，1996年或之后的版本)中找到这类官能团，其内容通过引用全文纳入本文用于所有目的。一些适于生物共轭的亲水性官能团包括，羧酸或其盐、氨基、巯基、叠氮基、醛、酯、羟基、羰基、磷酸盐、氰酸盐、琥珀酰亚胺酯、及其取代的衍生物。在一些方面中，适于共轭的亲水性官能团包括羧酸或其盐、氨基、巯基、琥珀酰亚胺酯、和羟基。下表1中提供了亲水性官能团对的非限制性列表。

表1.共轭化学的示例性亲水性官能团对。

在一些方面中，官能团包括与疏水性聚合物接合的疏水性官能团(例如，在疏水性侧链上)。在一些方面中，疏水性官能团一般包括，但不限于炔烃、烯烃和适于共轭的取代的烷基衍生物。本发明提供了包含用于形成紧密混合纳米颗粒的疏水性官能团(例如，预官能化)。在形成之后，疏水性官能团的一些经化学修饰以形成用于生物共轭的亲水性官能团(例如，后官能化)。在某些实施方式中，与疏水性聚合物接合的疏水性基团适于生物共轭。例如，在一些方面中，疏水性官能团包括但不限于用于点击(click)化学的那些，如炔、张力(strained)炔、叠氮化物、二烯、烯烃、环辛炔和膦基团。在一些方面中，这些疏水性官能团，例如，用于将偏振敏感纳米颗粒与生物相关分子(例如，抗体)共价偶联的生物共轭反应。

在多个方面中，官能团能够以多种方式接合发色偏振敏感纳米颗粒。例如，在某些方面中，聚合物经化学修饰以在形成颗粒之前包括官能团，如本文所述的“预官能化”。预官能化包括其中单体在形成聚合物之前包括官能团的实施方式，以及使已经形成的聚合物发生反应以沿着单体主链包括官能团。或者，在其他方面中，发色聚合物混合纳米颗粒在形成颗粒之后经修饰以接合官能团，例如，在聚合物混合纳米颗粒的表面上，本文所述的“后官能化”。本领域普通技术人员之一将理解了以多种顺序进行预官能化和后官能化以形成官能化的聚合物。例如，在一些方面中，用官能团，例如疏水性官能团预官能化聚合物。在其他方面中，疏水性预官能化聚合物缩合成混合纳米颗粒，然后用官能团(例如适于生物共轭的亲水性官能团)后官能化。或者，在其他方面中，预官能化和后官能化步骤包括用亲水性基团或疏水性基团官能化。

如本文所述，官能团中的一些“适于生物共轭”，其用于指代与生物分子，如抗体、蛋白质、核酸、链霉亲和素或生物相关的其他分子共价结合的官能团。本领域的普通技术人员可在例如BioconjugateTechniques(《生物共轭技术》)(学术出版社(AcademicPress)，纽约，1996年或之后的版本)中找到这类官能团，其内容通过引用全文纳入本文用于所有目的。在一些方面中，适于生物共轭的官能团包括能够在多种条件下，如在极性或非极性溶剂中与生物分子共轭的官能团。在某些实施方式中，适于生物共轭的官能团包括在水性溶液中与生物分子共轭的官能团。在一些方面中，适于生物共轭的官能团可包括在水性溶液中与生物分子共轭的官能团，其中生物分子保留其生物活性(例如，对抗体的单克隆结合特异性)。在某些实施方式中，适于生物共轭的官能团可包括与生物分子共价结合的官能团。例如，一般官能团与生物分子的共价结合接合了包括，例如，与生物分子上的胺反应以形成酰胺键的羧基官能团、与生物分子上的巯基反应以形成半胱氨酸键的巯基官能团、或与生物分子上的羧基反应以形成酰胺键的氨基官能团。在一些方面中，生物共轭的具体反应可包括表1中的官能团对。

本文所用术语“合理官能化”是指通过接合预定数量的反应性官能团对发色聚合物或混合纳米颗粒的修饰。例如，聚合物经化学修饰以在颗粒形成之前包括官能团(预官能化)。或者，发色聚合物混合纳米颗粒在形成之后经修饰以接合官能团，例如，在聚合物混合纳米颗粒的表面上(后官能化)。在一种情况中，多个合理官能化的混合纳米颗粒将各自具有与其表面接合的单个官能团。在其他实施方式中，多个官能化的混合纳米颗粒将各自具有与其表面接合的2个官能团。在其他实施方式中，多个官能化的混合纳米颗粒将各自精确具有与其表面接合的3、4、5、6、7、8、9、10或更多个官能团。以多种方式实现发色聚合物和/或混合纳米颗粒的合理官能化。例如，在一种情况中，预定数量的反应性官能团接合发色聚合物，其然后塌缩成混合纳米颗粒。在第二种情况中，通过一些方法处理预形成的发色混合纳米颗粒，其中还未预定颗粒表面上的反应性官能团的数量，以形成具有预定数量的官能团的发色颗粒。本文提供了这类方法的示例如溶剂洗涤或表面钝化以赋予合理官能化的混合纳米颗粒。

向聚合物中加入非离子性和非反应性亲水性部分以实现某些特性，如减少生物应用中的非特异性吸附。多种聚合物，如聚乙二醇(PEG)是本领域熟知的以减少非特异性吸附。非离子性亲水性部分在形成颗粒之前连接至发色聚合物(预官能化)。后者，非离子性亲水性部分在形成混合纳米颗粒之后，例如在聚合物混合纳米颗粒的表面上连接至发色聚合物混合纳米颗粒(后官能化)。在一些方面中，同时通过预官能化和后官能化接合非离子性亲水性部分。对于预官能化，发色聚合物中亲水性部分，如PEG基团的密度可影响偏振敏感纳米颗粒的形成、稳定性、内部结构和荧光亮度。如本文他处所述，PEG的密度应该足够低使得它们不会对偏振敏感纳米颗粒的稳定性和性能有不良影响。对于后官能化，发色聚合物混合纳米颗粒表面上PEG基团的密度高，因为混合纳米颗粒已经形成并且PEG基团对偏振敏感纳米颗粒的形成、稳定性、内部结构和荧光亮度没有不良影响，但是减少了非特异性相互作用。

离子性和非反应性亲水性部分连接至发色聚合物以实现所得偏振敏感纳米颗粒的某些性质，如通过高度带电物质增加表面ζ电势，和/或通过两性离子性物质产生两性离子性表面。在一些方面中，非离子性亲水性部分通过预官能化、后官能化或其组合接合。对于预官能化，发色聚合物中离子性亲水性部分的密度可影响偏振敏感纳米颗粒的形成、稳定性、内部结构和荧光亮度。因此，离子性部分的密度应该足够低使得它们不会对偏振敏感纳米颗粒的稳定性和性能有不良影响。在一些方面中，使用纳米颗粒的后官能化，在这种情况中，发色聚合物混合纳米颗粒的表面上离子部分的密度能够升高，因为混合纳米颗粒已经形成并且离子部分不会对偏振敏感纳米颗粒的形成、稳定性、内部结构和荧光亮度有不良影响，但是可提供某些性质，如高表面ζ电势和/或两性离子性表面。

在一些方面中，反应性官能团通过接头部分接合至混合纳米颗粒的表面。多种接头部分是本领域所熟知的，并且本领域的普通技术人员可在例如BioconjugateTechniques(《生物共轭技术》)(学术出版社(AcademicPress)，纽约，1996年或之后的版本)中找到这类结构部分，其内容通过引用全文纳入本文用于所有目的。在某些实施方式中，接头部分包括水溶性聚合物。在一些方面中，发色偏振敏感纳米颗粒也包括具有非反应性化学基团的聚合物。在某些实施方式中，非反应性化学基团还包括，例如，水溶性聚合物。本发明的合适水溶性聚合物包括，但不限于，聚乙二醇。

本文所用的在例如聚合的一个或多个末端或侧链处与聚合物接合的官能团和部分的“密度”是指带有接合的官能团或部分的单体的数量，其表示为聚合物单体单元的百分比。例如，如果特定聚合物的单体单元的一般具有接合的官能团，该官能团的密度是50％。在一些方面中，发色偏振敏感纳米颗粒中的聚合物(例如，半导体聚合物)经设计以包括官能团或部分密度的范围。在某些实施方式中，聚合物(例如，半导体聚合物)上疏水性官能团的密度低于约100％、低于约90％、低于约80％、低于约70％、低于约60％、低于约50％、低于约40％、低于约30％、低于约20％、或低于约10％。当使用预官能化时，发色聚合物中亲水性官能团和部分的密度可影响偏振敏感纳米颗粒的形成、稳定性、内部结构和荧光亮度。因此，发色聚合物上亲水性官能团和部分的密度应该足够低使得它们不会对偏振敏感纳米颗粒的稳定性和性能有不良影响。在一些方面中，聚合物(例如，半导体聚合物)上发色官能团和部分的密度低于约50％、低于约40％、低于约30％、低于约20％、低于约10％、或低于约5％。在涉及后官能化的一些方面中，亲水性官能团和部分连接至发色混合纳米颗粒的表面，其中官能化的密度高(例如，超过约50％)，因为已经形成混合纳米颗粒并且亲水性部分不会对偏振敏感纳米颗粒的形成、稳定性、内部结构和荧光亮度有不良影响，但是可能提供某些性质，如通过PEG基团减少非特异性相互作用，和/或通过高度带电物质生成高表面ζ电势和/或通过两性离子性部分产生两性离子性表面。在某些实施方式中，聚合物包括上述所列百分比的疏水性和亲水性官能团。在一些方面中，本文所述的聚合物将包括至少50％的疏水性官能团。本领域普通技术人员会理解侧链官能团的位置将沿着聚合物的长度随机分布。例如，如果具有100个单体的长度n，则由官能团(例如，羧基)取代的侧链沿聚合物的长度随机定位。一些官能团位于紧邻的单体上或者在聚合物下更远处，例如一个方向上的2或3个单体。在某些实施方式中，如本文所述，官能团是适于生物共轭的官能团。使用多种分光光度技术，如核磁共振(NMR)来确定密度。

本发明提供了使用聚合物的方法和组合物。聚合物指由至少两个重复结构单元组成的分子，通常通过共价化学键连接。重复结构单元是一种类型的单体，且所得聚合物是均聚物。在一些方面中，这些聚合物包含两种不同类型的单体，或三种不同类型的单体，或更多类型的单体。

本公开的聚合物可具有一定范围的亚基，例如单体或重复单元。在一些方面中，聚合物中亚基的数量是，例如，约2至约100000、约2至约10000、约2至约1000、约2至约100、约10至约100000、约10至约10000、约10至约1000、约100至约100000、或约100至约10000。在一些方面中，聚合物中亚基的数量是，例如，2至100000、2至10000、2至1000、2至100、10至100000、10至10000、10至1000、100至100000、或100至10000。在一些方面中，聚合物中亚基的数量是，例如，大于2、大于10、大于100、大于1000、大于10000、或大于100000。在一些方面中，聚合物中亚基的数量是，例如，小于2、小于10、小于100、小于1000、小于10000、或小于100000。在一些方面中，聚合物中亚基的数量是，例如，约2、约10、约100、约1000、约10000、或约100000。在一些方面中，聚合物中亚基的数量是，例如，2、10、100、1000、10000、或100000。

本公开的聚合物可具有不同种类的亚基，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同的亚基。在多个方面中，本发明提供了具有发色纳米颗粒、第一基质聚合物和第二基质聚合物的偏振敏感纳米颗粒。在这些聚合物各自内，存在其他单个亚基。一个独立的亚基可占总体重量的百分数或聚合物的单元或单体数量的百分数，例如是约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、或约100％。单个亚基可以总质量的百分比或聚合物单体或单元数量的百分比提供，例如，超过5％、超过10％、超过15％、超过20％、超过25％、超过30％、超过35％、超过40％、超过45％、超过50％、超过55％、超过60％、超过65％、超过70％、超过75％、超过80％、超过85％、超过90％、超过95％、或超过100％。单个亚基可以总质量的百分比或聚合物单体或单元数量的百分比提供，例如，低于5％、低于10％、低于15％、低于20％、低于25％、低于30％、低于35％、低于40％、低于45％、低于50％、低于55％、低于60％、低于65％、低于70％、低于75％、低于80％、低于85％、低于90％、低于95％、或低于100％。单个亚基可以总质量的百分比或聚合物单体或单元数量的百分比提供，例如，5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％。

在一些方面中，合成共轭的聚合物。用于合成共轭聚合物的单体的示例包括但不限于：苯、芴、苯并噻二唑；噻吩、BODIPY；卟啉、芘、方酸菁，及其衍生物。在一些方面中，聚合物是发色聚合物并且使用本文所述的方法形成混合纳米颗粒。

使用多种聚合物(包括半导体聚合物和非半导体聚合物)形成本发明的发色偏振敏感纳米颗粒。

发色聚合物

在多个方面中，本发明提供了偏振敏感的纳米颗粒，其包括：发色聚合物；第一基质聚合物；和第二基质聚合物，其中偏振敏感纳米颗粒具有至少一个1nm至1000nm的临界尺寸。

在某些方面中，发色聚合物是半导体聚合物。在一些方面中，发色聚合物是短链聚合物。在其他方面中，发色聚合物是疏水性的。

在某些方面中，偏振敏感纳米颗粒包含选自以下的发色聚合物：聚(9，9-二己基芴基-2，7-二基)(PDHF)、聚(9，9-二辛基芴基-2，7-二基)(PFO)、聚[{9，9-二辛基-2，7-二亚乙烯基-亚芴基}-交替-共-{2-甲氧基-5-(2-乙基己氧基)-1，4-亚苯基}](PFPV)、聚[(9，9-二辛基芴基-2，7-二基)-共-(4，7-二-2-噻吩基-2，1，3-苯并噻二唑)](PFTBT)、聚[(9，9-二辛基芴基-2，7-二基)-9-共-(4，7-二-2-噻吩基-2，1，3-苯并噻二唑)](PF-0.1TBT)、聚[(9，9-二辛基芴基-2，7-二基)-交替-共-(1，4-苯并-{2，1’，3}-噻二唑)](PFBT)、聚[(9，9-二(2-乙基己基)芴基-2，7-二基)-交替-2，5-二氟-1，4-苯](PFDFB)、聚[(9，9-二(2-乙基己基)芴基-2，7-二基)-交替-1，4-苯](PFB)、聚[(9，9-二(2-乙基己基)芴基-2，7-二基)-交替-4，4’-二苯基-5，6-二氟-1，4-苯并-(2，1，3)-噻二唑](PFDPDFBT)、聚[(9，9-二(2-乙基己基)芴基-2，7-二基)-交替-4，4’-二苯基-1，4-苯并-(2，1，3)-噻二唑](PFDPBT)、(聚[(9，9-二(2-乙基己基)芴基-2，7-二基)-交替-4，4’-二苯基-5-氟-1，4-苯并-(2，1，3)-噻二唑](PFDPFBT)、聚[2-甲氧基-5-(2-乙基己氧基)-1，4-亚苯基亚乙烯基](MEH-PPV)、聚[2-甲氧基-5-(2-乙基己氧基)-1，4-(1-氰基亚乙烯基-1，4-亚苯基)](CN-PPV)、BODIPY、BODIPY衍生物或其组合。

本文所用术语“烷基”指直链或支链的饱和的脂族基团，其具有指定数量的碳原子。例如，C₁-C₆烷基包括但不限于：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基等。其它烷基基团包括但不限于：庚基、辛基、壬基、癸基等。烷基可包括任意数目的碳，如1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、2-3、2-4、2-5、2-6、3-4、3-5、3-6、4-5、4-6和5-6。该烷基基团通常是单价的，但可以是二价的，例如当烷基基团将两个部分连接到一起时。

本文所用术语“杂烷基”指直链或支链的饱和的碳原子脂族基团，其中至少一个碳原子被杂原子(如N、O或S)替换。也考虑其他杂原子，包括但不限于B、Al、Si和P。

与有机基团或化合物结合使用的本文所用术语“低级”是指多至并且包括7个碳原子并少至1个碳原子的支链或直链和饱和或不饱和的化合物或基团。也考虑具有1个碳原子至7个碳原子的碳原子范围的有机基团或化合物。也考虑单独或与其他有机基团或化合物任意组合具有1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子、4个碳原子、5个碳原子、6个碳原子和/或7个碳原子的有机基团或化合物。在某些方面中，与有机基团或化合物结合使用“低级”是指多至并且包括4个碳原子并少至1个碳原子的支链或直链和饱和或不饱和的化合物或基团。示例性的低级烷基包括，但不限于，甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基及其同分异构形式。

本文所用术语“亚烷基”指与至少两个基团相连的上文所定义的烷基，即二价烃基基团。与亚烷基相连的两个部分与亚烷基的相同或不同原子连接。例如，直链亚烷基是-(CH₂)_n-的二价基团，其中n是1、2、3、4、5或6。亚烷基包括但不限于亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚异丙基、亚丁基、亚异丁基、亚仲丁基、亚戊基和亚己基。

本文所述基团是取代或未取代的。烷基和杂烷基基团(包括在多个方面称为亚烷基、烯基、杂亚烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的基团)的取代基可以是多种基团，例如烷基、芳基、氰基(-CN)、氨基、硫化物、醛、酯、醚、酸、羟基或卤化物。取代基可具有反应性基团，例如但不限于氯、溴、碘、羟基或氨基。合适的取代基选自：-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R”’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO₂R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R”’、-NR”C(O)₂R’、-NH-C(NH₂)＝NH、-NR’C(NH₂)＝NH、-NH-C(NH₂)＝NR’、-S(O)R’、-S(O)₂R’、-S(O)₂NR’R”、-CN和-NO₂，取代基数量为0至(2m’+1)，其中m’为该取代基中碳原子的总数。R′、R″和R″′各自独立地指氢、未取代的(C₁-C₈)烷基和杂烷基、未取代的芳基、烷氧基或硫代烷氧基，或者芳基-(C1-C₄)烷基。当R′和R″接合至同一个氮原子时，它们与该氮原子一起形成5、6或7元环。例如，-NR′R″包括1-吡咯烷基和4-吗啉基。从上述有关取代基的讨论中，本领域技术人员应理解，术语“烷基“包括诸如卤代烷基(如-CF₃和-CH₂CF₃)和酰基(如-C(O)CH₃、-C(O)CF₃、-C(O)CH₂OCH₃等)等基团。

本文所用术语“烷氧基”指具有氧原子的烷基基团，所述氧原子将烷氧基连接至接合点或连接至烷氧基的两个碳。烷氧基包括例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、2-丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基等。烷氧基进一步被本文所述多种取代基取代。例如，这些烷氧基被卤素取代以形成“卤代烷氧基”。

本文所用术语“烯基”指直链或支链的2-6个碳原子的烃基，其具有至少一个双键。烯基的示例包括但不限于：乙烯基、丙烯基、异丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、丁二烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、异戊烯基、1，3-戊二烯基、1，4-戊二烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、1，3-己二烯基、1，4-己二烯基、1，5-己二烯基、2，4-己二烯基或1，3，5-己三烯基。

本文所用术语“亚烯基”指连接至少两个其他基团的上文定义的烯基，即二价烃基。与亚烯基相连的两个部分与亚烯基的相同或不同原子连接。亚烯基包括但不限于：亚乙烯基、亚丙烯基、亚异丙烯基、亚丁烯基、亚异丁烯基、亚仲丁烯基、亚戊烯基和亚己烯基。

本文所用术语“炔基”指直链或支链的2-6个碳原子的烃基，其具有至少一个三键。炔基的示例包括但不限于：乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、异丁炔基、仲丁炔基、丁二炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、异戊炔基、1，3-戊二炔基、1，4-戊二炔基、1-己炔基、2-己炔基、3-己炔基、1，3-己二炔基、1，4-己二炔基、1，5-己二炔基、2，4-己二炔基或1，3，5-己三炔基。

本文所用术语“亚炔基”指连接至少两个其他基团的上文定义的炔基，即二价烃基。与亚炔基相连的两个部分与亚炔基的相同或不同原子连接。亚炔基包括但不限于：亚乙炔基、亚丙炔基、亚异丙炔基、亚丁炔基、亚仲丁炔基、亚戊炔基和亚己炔基。

本文所用术语“烷基胺”指具有一个或多个氨基的本文所定义的烷基。这些氨基是伯氨基、仲氨基或叔氨基。所述烷基胺进一步被羟基取代。烷基胺可包括但不限于：乙胺、丙胺、异丙胺、乙二胺和乙醇胺。氨基可将烷基胺连接至化合物剩余部分接合点，其位于烷基的ω位，或将烷基的至少两个碳原子连接在一起。

本文所用术语“卤素”或“卤化物”指的是氟(化物)、氯(化物)、溴(化物)和碘(化物)。本文所用术语“卤代烷基”指如上文所定义的烷基，其中一些或全部氢原子被卤素原子取代。在某些方面中，卤素(卤代)是氯或氟。在进一步的方面中，卤素(卤代)是氯、氟、溴或碘。本文所用术语“卤代烷氧基”指具有至少一个卤素的烷氧基。卤代烷氧基定义为一些或全部氢原子被卤素原子取代的烷氧基。在某些方面中，烷氧基被1、2、3或更多个卤素取代。当所有氢都被一种卤素取代时，例如被氟取代时，该化合物是全取代的，例如全氟化的。卤代烷氧基包括但不限于三氟甲氧基、2，2，2，-三氟乙氧基、全氟乙氧基等。

本文所用术语“环烷基”指饱和的或部分不饱和的单环、稠合二环或桥接多环组成物，其包含3-12个环原子，或指示数量的原子。单环包括，例如，环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环辛基。二环和多环包括，例如，降莰烷、十氢化萘和金刚烷。例如，C_3-8环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环辛基和降莰烷。

本文所用术语“亚环烷基”指连接至少两个其他基团的上文定义的环烷基，即二价烃基。与亚环烷基相连的两个部分可以与亚环烷基的相同或不同原子连接。亚环烷基包括但不限于：亚环丙基、亚环丁基、亚环戊基、亚环己基和亚环辛基。

本文所用术语“杂环烷基”指具有3-约20个环原子且1-约5个杂原子(如N、O和S)的环体系。也考虑其他的杂原子，包括但不限于B、Al、Si和P。在某些方面，杂原子被氧化，例如但不限于-S(O)-和-S(O)₂-。

本文所用术语“亚杂环烷基”指与至少两个其他基团相连的上文定义的杂环烷基。与亚杂环烷基相连的两个部分与亚杂环烷基的相同或不同原子连接。

本文所用术语“芳基”指单环或稠合二环、三环或更大的，芳族环组成物，其包含6-16个环碳原子。例如，芳基可以是苯基、苄基、薁基或萘基。“亚芳基”指源自芳基基团的二价基团。芳基是被一个、两个或三个选自下组的基团单取代、二取代或三取代的：烷基、烷氧基、芳基、羟基、卤素、氰基、氨基、氨基-烷基、三氟甲基、亚烷基二氧基和氧基-C₂-C₃-亚烷基；其均任选地被进一步取代，例如如上文定义的那样；或1-或2-萘基；或1-或2-菲基。亚烷基二氧基是与苯基的两个邻近碳原子接合的二价取代基，例如亚甲基二氧基或亚乙基二氧基。氧基-C₂-C₃-亚烷基也是与苯基的两个邻近碳原子接合的二价取代基，例如，氧乙烯或氧丙烯。氧基-C₂-C₃-亚烷基-苯基的示例是2，3-二氢苯并呋喃-5-基。

芳基包括但不限于：萘基，苯基或被烷氧基、苯基、卤素、烷基或三氟甲基单取代或双取代的苯基，苯基或被烷氧基、卤素或三氟甲基单取代或双取代的苯基，且特别是苯基。

本文所用术语“亚芳基”指与至少两个其他基团相连的上文定义的芳基。与亚芳基相连的两个部分与该亚芳基的不同原子相连。亚芳基包括但不限于亚苯基。

本文所用术语“烷氧基-芳基”或“芳氧基”指其中与芳基相邻的一个部分通过氧原子连接的上文定义的芳基。烷氧基-芳基包括但不限于苯氧基(C₆H₅O-)。本发明还包括烷氧基-杂芳基或杂芳氧基。

本文所用术语“杂芳基”指单环或稠合双环或三环芳香环组成物，其含有5-16个成环原子，成环原子中的1-4个是N、O或S的杂原子。例如有，吡啶基、吲哚基、吲唑基、喹喔啉基、喹啉基、异喹啉基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、呋喃基、吡咯基、噻唑基、苯并噻唑基、噁唑基、异噁唑基、三唑基、四唑基、吡唑基、咪吡基、噻吩基，或被例如烷基、硝基或卤素取代(特别是单取代或双取代)的任意其他基团。本公开的合适基团还包括亚杂芳基和亚杂芳基-氧基，类似于上文关于亚芳基和亚芳基-氧基的描述。

类似地，本文所述芳基和杂芳基是取代的或未取代的。芳基和杂芳基的取代基是不同的，例如烷基、芳基、CN、氨基、硫化物、醛、酯、醚、酸、羟基或卤化物。在一些方面中，取代基是反应性基团，例如但不限于氯、溴、碘、羟基或氨基。在某些方面中，取代基选自以下基团：-卤素、-OR′、-OC(O)R′、-NR′R″、-SR′、-R′、-CN、-NO₂、-CO₂R′、-CONR′R″、-C(O)R′、-OC(O)NR′R″、-NR″C(O)R′、-NR″C(O)₂R′、-NR′-C(O)NR″R″′、-NH-C(NH₂)＝NH、-NR′C(NH₂)＝NH、-NH-C(NH₂)＝NR′、-S(O)R′、-S(O)₂R′、-S(O)₂NR′R″、-N₃、-CH(Ph)₂、数量为0至芳环系统上开放价态的总数；其中R′、R″和R″′独立地选自：氢、(C₁-C₈)烷基和杂烷基、未取代的芳基和杂芳基、(未取代的芳基)-(C₁-C₄)烷基和(未取代的芳基)氧基-(C₁-C₄)烷基。

本文所用术语“烷基-芳基“指具有烷基组分和芳基组分的基团，其中烷基组分将芳基组分连接至接合点。烷基组分如上文所定义，不同之处在于烷基组分是至少二价的从而连接芳基组分和接合点。在一些方面中，没有烷基组分。芳基组分如上文所定义。烷基-芳基的示例包括但不限于苄基。本发明还包括烷基-杂芳基。

本文所用术语“烯基-芳基”指具有烯基组分和芳基组分的基团，其中烯基组分将芳基组分连接至接合点。烯基组分如上文所定义，不同之处在于烯基组分是至少二价的，从而连接芳基组分和接合点。芳基组分如上文所定义。烯基-芳基的示例包括乙烯基-苯基等。本发明还包括烯基-杂芳基。

本文所用术语“炔基-芳基”指具有炔基组分和芳基组分的基团，其中炔基组分将芳基组分连接至接合点。炔基组分如上文所定义，不同之处在于炔基组分是至少二价的，从而连接芳基组分和接合点。芳基组分如上文所定义。炔基-芳基的示例包括乙炔基-苯基等。本发明还包括炔基-杂芳基。

本领域普通技术人员应理解，本文定义的多个化学术语用于描述本发明的聚合物和单体的化学结构。例如，在某些方面中，多种单体衍生物(如BODIPY衍生物)包括本发明所述多种化学取代基和基团。例如，在一些方面中，多种单体的衍生物被氢、氘、烷基、芳烷基、芳基、烷氧基-芳基、N-二烷基-4-苯基、N-二苯基-4-苯基、N-二烷氧基苯基-4-苯基、氨基、硫化物、醛、酯、醚、酸和/或羟基取代。

半导体聚合物的非限制性示例包括：芴聚合物(例如，聚(9，9-二己基芴基-2，7-二基)(PDHF)、聚(9，9-二辛基芴基-2，7-二基)(PFO))，基于芴的共聚物(例如，聚[{9，9-二辛基-2，7-二亚乙烯基-亚芴基}-交替-共-{2-甲氧基-5-(2-乙基己氧基)-1，4-亚苯基}](PFPV)、聚[(9，9-二辛基芴基-2，7-二基)-共-(1，4-苯并-{2，1，3}-噻二唑)](PFBT)、聚[(9，9-二辛基芴基-2，7-二基)-共-(4，7-二-2-噻吩基-2，1，3-苯并噻二唑)](PFTBT)，和聚[(9，9-二辛基芴基-2，7-二基)-共-(4，7-二-2-噻吩基-2，1，3-苯并噻二唑)](PF-0.1TBT))，亚苯基亚乙烯基聚合物(例如，聚[2-甲氧基-5-(2-乙基己氧基)-1，4-亚苯基亚乙烯基](MEH-PPV)、聚[2-甲氧基-5-(2-乙基己氧基)-1，4-(1-氰基亚乙烯基71767-亚苯基)](CN-PPV)、BODIPY570、BODIPY590、BODIPY690和用于制备窄带发色偏振敏感纳米颗粒(如基于BODIPY的发色偏振敏感纳米颗粒)的其他聚合物，例如参见PCT/US12/71767，其通过引用全文纳入本文)。

本发明可包括偏振敏感纳米颗粒，例如，发光发色偏振敏感纳米颗粒。例如，本发明可包括均聚物或杂聚物，其包含如BODIPY和/或BODIPY衍生物单体、方酸菁和/或方酸菁衍生物、金属复合物和/或金属复合物衍生物单体、卟啉和/或卟啉衍生物单体、酞菁和/或酞菁衍生物单体、镧系复合物和/或镧系复合物衍生物单体、二萘嵌苯和/或二萘嵌苯衍生物单体、花青和/或花青衍生物单体、若丹明和/或若丹明衍生物单体、香豆素和/或香豆素衍生物单体，和/或呫吨和/或呫吨衍生物单体。

在一些方面中，本发明提供了包含具有式(I)的结构的BODIPY衍生物的偏振敏感纳米颗粒：

其中，R¹、R^2A、R^2B、R^3A、R^3B、R^4A和R^4B各自选自氢、烷基、芳烷基、芳基或烷氧基-芳基，且该BODIPY衍生物通过接合至R¹、R^2A、R^2B、R^3A、R^3B、R^4A、R^4B或其组合整合至发色聚合物中。

BODIPY和多种BODIPY衍生物用于本发明。BODIPY和BODIPY衍生物进行聚合以形成聚合物(如均聚物或杂聚物)和/或接合(如共价接合)至聚合物主链、侧链和/或末端。在一些方面中，本发明的发色偏振敏感纳米颗粒可包括包含单体的聚合物，该单体具有式(I)的结构：

其中，R¹、R^2A、R^2B、R^3A、R^3B、R^4A和R^4B各自独立地选自但不限于：氢(H)、氘(D)、卤素、直链或支链烷基、杂烷基、杂环烷基、杂环亚烷基、烷氧基、芳基、羟基、氰基、硝基、醚及其衍生物、酯及其衍生物、烷基酮、烷基酯、芳基酯、炔基、烷基胺、氟代烷基、氟代芳基和聚亚烷基(例如，甲氧基乙氧基乙氧基、乙氧基乙氧基和-(OCH₂CH₂)_nOH、n＝1-50)、苯基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯基、吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡啶基、二吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的二吡啶基、三吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的三吡啶基、呋喃基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的呋喃基、噻吩基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噻吩基、吡咯基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡咯基、吡唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡唑基、噁唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噁唑基、噻唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噻唑基、咪吡基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的咪吡基、吡嗪基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡嗪基、苯并噁二唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯并噁二唑基、苯并噻二唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯并噻二唑基、芴基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的芴基、三苯基氨基取代的芴基、二苯基氨基取代的芴基、烷基取代的咔唑基、烷基取代的三苯基氨基和烷基取代的噻吩基。作为示例性实施方式，烷基取代的苯基可包括2-烷基苯基、3-烷基苯基、4-烷基苯基、2，4-二烷基苯基、3，5-二烷基苯基、3，4-二烷基苯基；烷基取代的芴基可包括9，9-二烷基取代的芴基、7-烷基-9，9-二烷基取代的芴基、6-烷基-9，9-二烷基取代的芴基、7-三苯基氨基-9，9-二烷基取代的芴基和7-二苯基氨基-9，9-二烷基取代的芴基；烷基取代的咔唑基可包括N-烷基取代的咔唑基、6-烷基取代的咔唑基和7-烷基取代的咔唑基；烷基取代的三苯基氨基可包括4’-烷基取代的三苯基氨基、3’-烷基取代的三苯基氨基、3’，4’-二烷基取代的三苯基氨基和4’，4”-烷基取代的三苯基氨基；烷基取代的噻吩基可包括2-烷基噻吩基、3-烷基噻吩基和4-烷基噻吩基、N-二烷基-4-苯基、N-二苯基-4-苯基和N-二烷氧基苯基-4-苯基。该单体整合至聚合物的主链中(例如在聚合物中聚合化)和/或共价接合至聚合物的主链、末端或侧链(通过与R¹、R^2A、R^2B、R^3A、R^3B、R^4A和R^4B的至少一个连接，或其组合)。

在一些方面中，本发明的发色偏振敏感纳米颗粒可包括包含单体的聚合物，该单体具有式(II)的结构：

其中，R¹、R^2A、R^2B、R^3A、R^3B、R^4A和R^4B各自独立地选自但不限于：氢(H)、氘(D)、卤素、直链或支链烷基、杂烷基、杂环烷基、杂环亚烷基、烷氧基、芳基、羟基、氰基、硝基、醚及其衍生物、酯及其衍生物、烷基酮、烷基酯、芳基酯、炔基、烷基胺、氟代烷基、氟代芳基和聚亚烷基(例如，甲氧基乙氧基乙氧基、乙氧基乙氧基和-(OCH₂CH₂)_nOH、n＝1-50)、苯基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯基、吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡啶基、二吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的二吡啶基、三吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的三吡啶基、呋喃基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的呋喃基、噻吩基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噻吩基、吡咯基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡咯基、吡唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡唑基、噁唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噁唑基、噻唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噻唑基、咪吡基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的咪吡基、吡嗪基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡嗪基、苯并噁二唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯并噁二唑基、苯并噻二唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯并噻二唑基、芴基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的芴基、三苯基氨基取代的芴基、二苯基氨基取代的芴基、烷基取代的咔唑基、烷基取代的三苯基氨基和烷基取代的噻吩基。作为示例性实施方式，烷基取代的苯基可包括2-烷基苯基、3-烷基苯基、4-烷基苯基、2，4-二烷基苯基、3，5-二烷基苯基、3，4-二烷基苯基；烷基取代的芴基可包括9，9-二烷基取代的芴基、7-烷基-9，9-二烷基取代的芴基、6-烷基-9，9-二烷基取代的芴基、7-三苯基氨基-9，9-二烷基取代的芴基和7-二苯基氨基-9，9-二烷基取代的芴基；烷基取代的咔唑基可包括N-烷基取代的咔唑基、6-烷基取代的咔唑基和7-烷基取代的咔唑基；烷基取代的三苯基氨基可包括4’-烷基取代的三苯基氨基、3’-烷基取代的三苯基氨基、3’，4’-二烷基取代的三苯基氨基和4’，4”-烷基取代的三苯基氨基；烷基取代的噻吩基可包括2-烷基噻吩基、3-烷基噻吩基和4-烷基噻吩基、N-二烷基-4-苯基、N-二苯基-4-苯基和N-二烷氧基苯基-4-苯基。该单体整合至聚合物的主链中(例如在聚合物中聚合化)和/或共价接合至聚合物的主链、末端或侧链(通过与R¹、R^2A、R^2B、R^3A、R^3B、R^4A、R^4B的至少一个连接，或其组合)。例如，该单体可通过接合至R^3A和R^3B基团来与聚合物的主链整合。

在一些方面中，本发明的发色偏振敏感纳米颗粒可包括包含单体的聚合物，该单体具有式(III)的结构：

其中，R¹、R^2A和R^2B各自独立地选自但不限于：氢(H)、氘(D)、卤素、直链或支链烷基、杂烷基、杂环烷基、杂环亚烷基、烷氧基、芳基、羟基、氰基、硝基、醚及其衍生物、酯及其衍生物、烷基酮、烷基酯、芳基酯、炔基、烷基胺、氟代烷基、氟代芳基和聚亚烷基(例如，甲氧基乙氧基乙氧基、乙氧基乙氧基和-(OCH₂CH₂)_nOH、n＝1-50)、苯基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯基、吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡啶基、二吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的二吡啶基、三吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的三吡啶基、呋喃基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的呋喃基、噻吩基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噻吩基、吡咯基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡咯基、吡唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡唑基、噁唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噁唑基、噻唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噻唑基、咪吡基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的咪吡基、吡嗪基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡嗪基、苯并噁二唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯并噁二唑基、苯并噻二唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯并噻二唑基、芴基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的芴基、三苯基氨基取代的芴基、二苯基氨基取代的芴基、烷基取代的咔唑基、烷基取代的三苯基氨基和烷基取代的噻吩基。作为示例性实施方式，烷基取代的苯基可包括2-烷基苯基、3-烷基苯基、4-烷基苯基、2，4-二烷基苯基、3，5-二烷基苯基、3，4-二烷基苯基；烷基取代的芴基可包括9，9-二烷基取代的芴基、7-烷基-9，9-二烷基取代的芴基、6-烷基-9，9-二烷基取代的芴基、7-三苯基氨基-9，9-二烷基取代的芴基和7-二苯基氨基-9，9-二烷基取代的芴基；烷基取代的咔唑基可包括N-烷基取代的咔唑基、6-烷基取代的咔唑基和7-烷基取代的咔唑基；烷基取代的三苯基氨基可包括4’-烷基取代的三苯基氨基、3’-烷基取代的三苯基氨基、3’，4’-二烷基取代的三苯基氨基和4’，4”-烷基取代的三苯基氨基；烷基取代的噻吩基可包括2-烷基噻吩基、3-烷基噻吩基和4-烷基噻吩基、N-二烷基-4-苯基、N-二苯基-4-苯基和N-二烷氧基苯基-4-苯基。该单体整合至聚合物的主链中(例如在聚合物中聚合化)和/或共价接合至聚合物的主链、末端或侧链(通过结合至R¹、R^2A和R^2B的至少一个，或其组合)。括号表示单体与聚合物主链的接合点。

在一些方面中，本发明的发色偏振敏感纳米颗粒可包括包含单体的聚合物，该单体具有式(IV)的结构：

其中，R¹、R^2A、R^2B、R^3A、R^3B各自独立地选自但不限于：氢(H)、氘(D)、卤素、直链或支链烷基、杂烷基、杂环烷基、杂环亚烷基、烷氧基、芳基、羟基、氰基、硝基、醚及其衍生物、酯及其衍生物、烷基酮、烷基酯、芳基酯、炔基、烷基胺、氟代烷基、氟代芳基和聚亚烷基(例如，甲氧基乙氧基乙氧基、乙氧基乙氧基和-(OCH₂CH₂)_nOH、n＝1-50)、苯基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯基、吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡啶基、二吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的二吡啶基、三吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的三吡啶基、呋喃基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的呋喃基、噻吩基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噻吩基、吡咯基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡咯基、吡唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡唑基、噁唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噁唑基、噻唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噻唑基、咪吡基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的咪吡基、吡嗪基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡嗪基、苯并噁二唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯并噁二唑基、苯并噻二唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯并噻二唑基、芴基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的芴基、三苯基氨基取代的芴基、二苯基氨基取代的芴基、烷基取代的咔唑基、烷基取代的三苯基氨基和烷基取代的噻吩基。作为示例性实施方式，烷基取代的苯基可包括2-烷基苯基、3-烷基苯基、4-烷基苯基、2，4-二烷基苯基、3，5-二烷基苯基、3，4-二烷基苯基；烷基取代的芴基可包括9，9-二烷基取代的芴基、7-烷基-9，9-二烷基取代的芴基、6-烷基-9，9-二烷基取代的芴基、7-三苯基氨基-9，9-二烷基取代的芴基和7-二苯基氨基-9，9-二烷基取代的芴基；烷基取代的咔唑基可包括N-烷基取代的咔唑基、6-烷基取代的咔唑基和7-烷基取代的咔唑基；烷基取代的三苯基氨基可包括4’-烷基取代的三苯基氨基、3’-烷基取代的三苯基氨基、3’，4’-二烷基取代的三苯基氨基和4’，4”-烷基取代的三苯基氨基；烷基取代的噻吩基可包括2-烷基噻吩基、3-烷基噻吩基和4-烷基噻吩基、N-二烷基-4-苯基、N-二苯基-4-苯基和N-二烷氧基苯基-4-苯基。该单体整合至聚合物的主链中(例如在聚合物中聚合化)和/或连接至聚合物的主链、末端或侧链(通过接合至R¹、R^2A、R^2B、R^3A、R^3B的至少一个，或其组合)。

在一些方面中，本发明的发色偏振敏感纳米颗粒可包括包含单体的聚合物，该单体具有式(V)的结构：

其中，R¹、R^2A、R^2B、R^3A、R^3B、R^4A、R^4B、R^5A和R^5B各自独立地选自但不限于：氢(H)、氘(D)、卤素、直链或支链烷基、杂烷基、杂环烷基、杂环亚烷基、烷氧基、芳基、羟基、氰基、硝基、醚及其衍生物、酯及其衍生物、烷基酮、烷基酯、芳基酯、炔基、烷基胺、氟代烷基、氟代芳基和聚亚烷基(例如，甲氧基乙氧基乙氧基、乙氧基乙氧基和-(OCH₂CH₂)_nOH、n＝1-50)、苯基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯基、吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡啶基、二吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的二吡啶基、三吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的三吡啶基、呋喃基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的呋喃基、噻吩基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噻吩基、吡咯基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡咯基、吡唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡唑基、噁唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噁唑基、噻唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噻唑基、咪吡基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的咪吡基、吡嗪基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡嗪基、苯并噁二唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯并噁二唑基、苯并噻二唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯并噻二唑基、芴基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的芴基、三苯基氨基取代的芴基、二苯基氨基取代的芴基、烷基取代的咔唑基、烷基取代的三苯基氨基和烷基取代的噻吩基。作为示例性实施方式，烷基取代的苯基可包括2-烷基苯基、3-烷基苯基、4-烷基苯基、2，4-二烷基苯基、3，5-二烷基苯基、3，4-二烷基苯基；烷基取代的芴基可包括9，9-二烷基取代的芴基、7-烷基-9，9-二烷基取代的芴基、6-烷基-9，9-二烷基取代的芴基、7-三苯基氨基-9，9-二烷基取代的芴基和7-二苯基氨基-9，9-二烷基取代的芴基；烷基取代的咔唑基可包括N-烷基取代的咔唑基、6-烷基取代的咔唑基和7-烷基取代的咔唑基；烷基取代的三苯基氨基可包括4’-烷基取代的三苯基氨基、3’-烷基取代的三苯基氨基、3’，4’-二烷基取代的三苯基氨基和4’，4”-烷基取代的三苯基氨基；烷基取代的噻吩基可包括2-烷基噻吩基、3-烷基噻吩基和4-烷基噻吩基、N-二烷基-4-苯基、N-二苯基-4-苯基和N-二烷氧基苯基-4-苯基。该单体整合至聚合物的主链中(例如在聚合物中共聚)和/或共价接合至聚合物的主链、末端或侧链(通过与R¹、R^2A、R^2B、R^3A、R^3B、R^4A、R^4B、R^5A、R^5B的至少一个连接，或其组合)。在某些实施方式中，这些单体通过与R^5A和R^5B接合来整合至主链中。

在一些方面中，本发明的发色偏振敏感纳米颗粒可包括包含单体的聚合物，该单体具有式(VI)的结构：

其中，R¹、R^2A、R^2B、R^3A、R^3B各自独立地选自但不限于：氢(H)、氘(D)、卤素、直链或支链烷基、杂烷基、杂环烷基、杂环亚烷基、烷氧基、芳基、羟基、氰基、硝基、醚及其衍生物、酯及其衍生物、烷基酮、烷基酯、芳基酯、炔基、烷基胺、氟代烷基、氟代芳基和聚亚烷基(例如，甲氧基乙氧基乙氧基、乙氧基乙氧基和-(OCH₂CH₂)_nOH、n＝1-50)、苯基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯基、吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡啶基、二吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的二吡啶基、三吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的三吡啶基、呋喃基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的呋喃基、噻吩基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噻吩基、吡咯基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡咯基、吡唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡唑基、噁唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噁唑基、噻唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噻唑基、咪吡基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的咪吡基、吡嗪基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡嗪基、苯并噁二唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯并噁二唑基、苯并噻二唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯并噻二唑基、芴基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的芴基、三苯基氨基取代的芴基、二苯基氨基取代的芴基、烷基取代的咔唑基、烷基取代的三苯基氨基和烷基取代的噻吩基。作为示例性实施方式，烷基取代的苯基可包括2-烷基苯基、3-烷基苯基、4-烷基苯基、2，4-二烷基苯基、3，5-二烷基苯基、3，4-二烷基苯基；烷基取代的芴基可包括9，9-二烷基取代的芴基、7-烷基-9，9-二烷基取代的芴基、6-烷基-9，9-二烷基取代的芴基、7-三苯基氨基-9，9-二烷基取代的芴基和7-二苯基氨基-9，9-二烷基取代的芴基；烷基取代的咔唑基可包括N-烷基取代的咔唑基、6-烷基取代的咔唑基和7-烷基取代的咔唑基；烷基取代的三苯基氨基可包括4’-烷基取代的三苯基氨基、3’-烷基取代的三苯基氨基、3’，4’-二烷基取代的三苯基氨基和4’，4”-烷基取代的三苯基氨基；烷基取代的噻吩基可包括2-烷基噻吩基、3-烷基噻吩基和4-烷基噻吩基、N-二烷基-4-苯基、N-二苯基-4-苯基和N-二烷氧基苯基-4-苯基。该单体可整合至聚合物的主链中(例如在聚合物中聚合化)和/或共价接合至聚合物的主链、末端或侧链(通过与R¹、R^2A、R^2B、R^3A、R^3B的至少一个连接，或其组合)。

在一些方面中，本发明的发色偏振敏感纳米颗粒可包括包含单体的聚合物，该单体具有式(VII)的结构：

其中，R^2A、R^2B、R^3A、R^3B、R^4A、R^4B、R^5A和R^5B各自独立地选自但不限于：氢(H)、氘(D)、卤素、直链或支链烷基、杂烷基、杂环烷基、杂环亚烷基、烷氧基、芳基、羟基、氰基、硝基、醚及其衍生物、酯及其衍生物、烷基酮、烷基酯、芳基酯、炔基、烷基胺、氟代烷基、氟代芳基和聚亚烷基(例如，甲氧基乙氧基乙氧基、乙氧基乙氧基和-(OCH₂CH₂)_nOH、n＝1-50)、苯基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯基、吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡啶基、二吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的二吡啶基、三吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的三吡啶基、呋喃基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的呋喃基、噻吩基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噻吩基、吡咯基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡咯基、吡唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡唑基、噁唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噁唑基、噻唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噻唑基、咪吡基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的咪吡基、吡嗪基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡嗪基、苯并噁二唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯并噁二唑基、苯并噻二唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯并噻二唑基、芴基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的芴基、三苯基氨基取代的芴基、二苯基氨基取代的芴基、烷基取代的咔唑基、烷基取代的三苯基氨基和烷基取代的噻吩基。作为示例性实施方式，烷基取代的苯基可包括2-烷基苯基、3-烷基苯基、4-烷基苯基、2，4-二烷基苯基、3，5-二烷基苯基、3，4-二烷基苯基；烷基取代的芴基可包括9，9-二烷基取代的芴基、7-烷基-9，9-二烷基取代的芴基、6-烷基-9，9-二烷基取代的芴基、7-三苯基氨基-9，9-二烷基取代的芴基和7-二苯基氨基-9，9-二烷基取代的芴基；烷基取代的咔唑基可包括N-烷基取代的咔唑基、6-烷基取代的咔唑基和7-烷基取代的咔唑基；烷基取代的三苯基氨基可包括4’-烷基取代的三苯基氨基、3’-烷基取代的三苯基氨基、3’，4’-二烷基取代的三苯基氨基和4’，4”-烷基取代的三苯基氨基；烷基取代的噻吩基可包括2-烷基噻吩基、3-烷基噻吩基和4-烷基噻吩基、N-二烷基-4-苯基、N-二苯基-4-苯基和N-二烷氧基苯基-4-苯基。该单体可整合至聚合物的主链中(例如在聚合物中聚合化)和/或共价接合至聚合物的主链、末端或侧链(通过与R^2A、R^2B、R^3A、R^3B、R^4A、R^4B、R^5A和R^5B的至少一个连接，或其组合)。

在一些方面中，本发明的发色偏振敏感纳米颗粒可包括包含单体的聚合物，该单体具有式(VIII)的结构：

其中，R¹、R^2A、R^2B、R^3A、R^3B、R^4A、R^4B、R^5A、R^5B、R^6A和R^6B各自独立地选自但不限于：氢(H)、氘(D)、卤素、直链或支链烷基、杂烷基、杂环烷基、杂环亚烷基、烷氧基、芳基、羟基、氰基、硝基、醚及其衍生物、酯及其衍生物、烷基酮、烷基酯、芳基酯、炔基、烷基胺、氟代烷基、氟代芳基和聚亚烷基(例如，甲氧基乙氧基乙氧基、乙氧基乙氧基和-(OCH₂CH₂)_nOH、n＝1-50)、苯基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯基、吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡啶基、二吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的二吡啶基、三吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的三吡啶基、呋喃基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的呋喃基、噻吩基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噻吩基、吡咯基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡咯基、吡唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡唑基、噁唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噁唑基、噻唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噻唑基、咪吡基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的咪吡基、吡嗪基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡嗪基、苯并噁二唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯并噁二唑基、苯并噻二唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯并噻二唑基、芴基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的芴基、三苯基氨基取代的芴基、二苯基氨基取代的芴基、烷基取代的咔唑基、烷基取代的三苯基氨基和烷基取代的噻吩基。作为示例性实施方式，烷基取代的苯基可包括2-烷基苯基、3-烷基苯基、4-烷基苯基、2，4-二烷基苯基、3，5-二烷基苯基、3，4-二烷基苯基；烷基取代的芴基可包括9，9-二烷基取代的芴基、7-烷基-9，9-二烷基取代的芴基、6-烷基-9，9-二烷基取代的芴基、7-三苯基氨基-9，9-二烷基取代的芴基和7-二苯基氨基-9，9-二烷基取代的芴基；烷基取代的咔唑基可包括N-烷基取代的咔唑基、6-烷基取代的咔唑基和7-烷基取代的咔唑基；烷基取代的三苯基氨基可包括4’-烷基取代的三苯基氨基、3’-烷基取代的三苯基氨基、3’，4’-二烷基取代的三苯基氨基和4’，4”-烷基取代的三苯基氨基；烷基取代的噻吩基可包括2-烷基噻吩基、3-烷基噻吩基和4-烷基噻吩基、N-二烷基-4-苯基、N-二苯基-4-苯基和N-二烷氧基苯基-4-苯基，其中，R^5A、R^5B、R^6A和R^6B各自独立地选自但不限于：氢(H)、氘(D)、卤素、直链或支链烷基、杂烷基、杂环烷基、杂环亚烷基、烷氧基、芳基、羟基、氰基、硝基、醚及其衍生物、酯及其衍生物、烷基酮、烷基酯、芳基酯、炔基、烷基胺、氟代烷基、氟代芳基和聚亚烷基(例如，甲氧基乙氧基乙氧基、乙氧基乙氧基和-(OCH₂CH₂)_nOH、n＝1-50)、苯基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯基、吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡啶基、二吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的二吡啶基、三吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的三吡啶基、呋喃基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的呋喃基、噻吩基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噻吩基、吡咯基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡咯基、吡唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡唑基、噁唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噁唑基、噻唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噻唑基、咪吡基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的咪吡基、吡嗪基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡嗪基、苯并噁二唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯并噁二唑基、苯并噻二唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯并噻二唑基、芴基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的芴基、三苯基氨基取代的芴基、二苯基氨基取代的芴基、烷基取代的咔唑基、烷基取代的三苯基氨基和烷基取代的噻吩基。作为示例性实施方式，烷基取代的苯基可包括2-烷基苯基、3-烷基苯基、4-烷基苯基、2，4-二烷基苯基、3，5-二烷基苯基、3，4-二烷基苯基；烷基取代的芴基可包括9，9-二烷基取代的芴基、7-烷基-9，9-二烷基取代的芴基、6-烷基-9，9-二烷基取代的芴基、7-三苯基氨基-9，9-二烷基取代的芴基和7-二苯基氨基-9，9-二烷基取代的芴基；烷基取代的咔唑基可包括N-烷基取代的咔唑基、6-烷基取代的咔唑基和7-烷基取代的咔唑基；烷基取代的三苯基氨基可包括4’-烷基取代的三苯基氨基、3’-烷基取代的三苯基氨基、3’，4’-二烷基取代的三苯基氨基和4’，4”-烷基取代的三苯基氨基；烷基取代的噻吩基可包括2-烷基噻吩基、3-烷基噻吩基和4-烷基噻吩基、N-二烷基-4-苯基、N-二苯基-4-苯基和N-二烷氧基苯基-4-苯基。该单体可整合至聚合物的主链中(例如在聚合物中共聚化)和/或共价接合至聚合物的主链、末端或侧链(通过与R¹、R^2A、R^2B、R^3A、R^3B、R^4A、R^4B、R^5A、R^5B、R^6A、R^6B的至少一个连接，或其组合)。

在一些方面中，本发明的发色偏振敏感纳米颗粒可包括包含单体的聚合物，该单体具有式(IX)的结构：

其中，X具有式(X)、(XI)、(XII)或(XIII)中任一种或其衍生物的结构：

且其中，式(X)、(XI)、(XII)和(XIII)中的R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹、R¹⁰、R¹¹、R¹²、R¹³、R¹⁴和R¹⁵各自独立地选自：氢(H)、氘(D)、卤素、直链或支链烷基、杂烷基、杂环烷基、杂环亚烷基、烷氧基、芳基、羟基、氰基、硝基、醚及其衍生物、酯及其衍生物、烷基酮、烷基酯、芳基酯、炔基、烷基胺、氟代烷基、氟代芳基和聚亚烷基(例如，甲氧基乙氧基乙氧基、乙氧基乙氧基和-(OCH₂CH₂)_nOH、n＝1-50)、苯基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯基、吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡啶基、二吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的二吡啶基、三吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的三吡啶基、呋喃基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的呋喃基、噻吩基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噻吩基、吡咯基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡咯基、吡唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡唑基、噁唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噁唑基、噻唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噻唑基、咪吡基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的咪吡基、吡嗪基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡嗪基、苯并噁二唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯并噁二唑基、苯并噻二唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯并噻二唑基、芴基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的芴基、三苯基氨基取代的芴基、二苯基氨基取代的芴基、烷基取代的咔唑基、烷基取代的三苯基氨基和烷基取代的噻吩基。作为示例性实施方式，烷基取代的苯基可包括2-烷基苯基、3-烷基苯基、4-烷基苯基、2，4-二烷基苯基、3，5-二烷基苯基、3，4-二烷基苯基；烷基取代的芴基可包括9，9-二烷基取代的芴基、7-烷基-9，9-二烷基取代的芴基、6-烷基-9，9-二烷基取代的芴基、7-三苯基氨基-9，9-二烷基取代的芴基和7-二苯基氨基-9，9-二烷基取代的芴基；烷基取代的咔唑基可包括N-烷基取代的咔唑基、6-烷基取代的咔唑基和7-烷基取代的咔唑基；烷基取代的三苯基氨基可包括4’-烷基取代的三苯基氨基、3’-烷基取代的三苯基氨基、3’，4’-二烷基取代的三苯基氨基和4’，4”-烷基取代的三苯基氨基；烷基取代的噻吩基可包括2-烷基噻吩基、3-烷基噻吩基和4-烷基噻吩基、N-二烷基-4-苯基、N-二苯基-4-苯基和N-二烷氧基苯基-4-苯基。当X代表萘及其衍生物时，该单体整合至聚合物的主链中(例如在聚合物中聚合化)和/或共价接合至聚合物的主链、末端或侧链(通过R⁷、R⁸、R⁹、R¹⁰、R¹¹、R¹²的至少一个，或其组合)。当X代表蒽及其衍生物时，该单体整合至聚合物的主链中和/或共价接合至聚合物的主链、末端或侧链(通过R⁷、R⁸、R⁹、R¹⁰、R¹¹、R¹²、R¹³、R¹⁴、R¹⁵的至少一个，或其组合)。

在一些方面中，本发明提供了包括发色聚合物，聚[(9，9-二辛基芴基-2，7-二基)-共-(4，7-二-2-噻吩基-2，1，3-苯并噻二唑)](PFTBT)的偏振敏感纳米颗粒。

在本发明的一些方面中，用于检测的发色偏振敏感纳米颗粒包含聚合物CN-PPV，其是一种亮、紧密且发橙色光的半导体聚合物混合纳米颗粒，也称作聚[2-甲氧基-5-(2-乙基己氧基)-1，4-(1-氰基亚乙烯基-1，4-亚苯基)]。CN-PPV具有优良的荧光性质，例如大吸收截面、高量子产率和快发射速率。

在一些方面中，用于检测蛋白质和肽的发色聚合物混合纳米颗粒可包含基本由CN-PPV组成的聚合物。在一些方面中，该混合纳米颗粒包含CN-PPV和至少一种其他材料。例如，CN-PPV与提供其他功能的共聚物或其他材料混合。

在一些方面中，用于检测蛋白质和肽的偏振敏感纳米颗粒包含具有至少两个不同发色单元的半导体共聚物。例如，共轭的共聚物可含有以给定比例存在的芴和苯并噻唑发色单元。用于合成半导体共聚物的典型发色单元包括但不限于：芴单元、亚苯基亚乙烯基单元、亚苯基单元、亚苯基亚乙炔基单元、苯并噻唑单元、噻吩单元、咔唑芴单元、硼-二吡咯亚甲基单元，及其衍生物。不同的发色单元是隔离的(如同在嵌段共聚物中那样)或掺杂的。本文中，通过书写主要发色物质的种类来表示发色共聚物。例如，PFBT是含有特定比例的芴和苯并噻唑单元的发色聚合物。在一些方面中，连接号用于表示次要发色物质的百分比，之后是次要发色物质的种类。例如，PF-0.1BT是含有90％PF和10％BT的发色共聚物。

在一些方面中，发色偏振敏感纳米颗粒是具有发光性质的π-共轭物质。这些发色偏振敏感纳米颗粒可包含具有一个或多个重复单元的聚合物，其以固定、有序或随机配置和比例组合。在一些方面中，重复单元是在整个聚合物上出现的单体或化学基序，例如芳族或杂环单元。

在一些方面中，该聚合物是卤素化的，例如，氟化、氯化、溴化或碘化。在一些方面中，聚合物、重复单元或单体在一个或多个位点处卤化。卤化聚合物(如氟化聚合物)可提供比非卤化类似聚合物更高水平的荧光。

在一些方面中，该发色聚合物混合纳米颗粒包含携带以下单元的聚合物：小有机染料分子、金属复合物、光发色染料(photochotochromicdye)及其任意组合，例如，无光学活性聚合物，如与小有机染料、金属复合物、光发色染料及其任意组合共价连接或接枝的聚苯乙烯。在一些方面中，这些染料或金属络合物具有传感功能，如氧传感能力、离子传感能力、葡萄糖传感能力、神经递质传感能力、药物传感能力、代谢物传感能力、蛋白质传感能力、信号转导分子传感能力、毒素传感能力、DNA和RNA传感能力等。

在一些方面中，发色聚合物混合纳米颗粒包含与下述物质共价连接的半导体聚合物：作为发射单元的小有机染料分子、金属络合物、光致变色染料及其任意组合。这类发射单元可调节发射颜色、提高量子产率并改善发色聚合物混合纳米颗粒的光稳定性。在某些方面中，这些小有机染料或金属络合物可具有传感功能，并因此向发色聚合物混合纳米颗粒加入其他功能，如氧传感能力、离子传感能力、葡萄糖传感能力、神经递质传感能力、药物传感能力、代谢物传感能力、蛋白质传感能力、信号转导分子传感能力、毒素传感能力、DNA和RNA传感能力等。

在一些方面中，发色偏振敏感纳米颗粒也包括半导体聚合物，其与其他发色聚合物如用小有机染料、金属络合物、光致变色染料及其任意组合共价连接或枝接的光学无活性聚合物物理混合或化学交联，以具有额外功能，如氧传感能力、离子传感能力、葡萄糖传感能力、神经递质传感能力、药物传感能力、代谢物传感能力、蛋白质传感能力、信号转导分子传感能力、毒素传感能力、DNA和RNA传感能力等。

在一些方面中，发色聚合物混合纳米颗粒也包含半导体聚合物，其与其他组分(包括，例如荧光染料、无机发光材料、磁性材料、金属材料)物理混合或化学交联，从而调节发射颜色、改进量子产率和/或光稳定性，和/或提供额外的功能(如磁性功能、等离振子共振功能等)。

基质聚合物

第一基质聚合物。在多个方面中，本发明提供了偏振敏感的纳米颗粒，其包括：发色聚合物；第一基质聚合物；和第二基质聚合物，其中偏振敏感纳米颗粒具有至少一个1nm至1000nm的临界尺寸。

在一些方面中，偏振敏感纳米颗粒包含第一基质聚合物，该聚合物是非半导体聚合物。在某些方面中，第一基质聚合物是两性聚合物。

在某些方面中，第一基质聚合物选自基于聚((甲基)丙烯酸)-的共聚物、基于聚二烯的共聚物、基于聚(环氧乙烷)的共聚物、基于聚异丁烯的共聚物、基于聚苯乙烯的共聚物、基于聚硅氧烷的共聚物、基于聚(二茂铁基二甲基甲硅烷)的共聚物、基于聚(2-乙烯基萘)的共聚物、基于聚(乙烯基吡啶和碘化N-甲基乙烯基吡啶鎓)的共聚物、基于聚(乙烯基吡咯烷酮)的共聚物、基于聚丙烯酰胺的共聚物、基于聚(甲基)丙烯酸酯的共聚物、基于聚亚苯基的共聚物、基于聚乙烯的共聚物、基于聚(乙二醇)的共聚物、基于聚乳酸的共聚物、基于聚氨酯的共聚物或其组合。

在其他方面中，第一基质聚合物选自：聚(丙烯酸-b-丙烯酰胺)、聚(丙烯酸-b-甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸-b-N-异丙基丙烯酰胺)、聚(丙烯酸正丁酯-b-丙烯酸)、聚(丙烯酸钠-b-甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸-b-甲基丙烯酸新戊酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-甲基丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-N，N-二甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-丙烯酸钠)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-甲基丙烯酸钠)、聚(甲基丙烯酸新戊酯-b-甲基丙烯酸)、聚苯乙烯接枝聚(环氧乙烷)、聚(甲基丙烯酸叔丁酯-b-环氧乙烷)、聚(2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸-b-丙烯酸)、聚(丁二烯(1，2加聚)-b-环氧乙烷)、聚(丁二烯(1，2加聚)-b-甲基丙烯酸、聚(丁二烯(1，4加聚)-b-丙烯酸)、聚(丁二烯(1，4加聚)-b-环氧乙烷、聚(丁二烯(1，4加聚)-b-丙烯酸钠)、聚(丁二烯(1，4加聚)-b-碘化N-甲基4-乙烯吡啶鎓)、聚(异戊二烯-b-环氧乙烷)、聚(异戊二烯-b-环氧乙烷)，和聚(异戊二烯-b-碘化N-甲基2-乙烯吡啶鎓)、聚(环氧乙烷-b-丙烯酸)、聚(环氧乙烷-b-丙烯酰胺)、聚(环氧乙烷-b-环氧丁烷)、聚(环氧乙烷-b-c-己内酯)、聚(环氧乙烷-b-交酯)、聚(环氧乙烷-b-交酯)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸)、聚(环氧乙烷-b-丙烯酸甲酯)、聚(环氧乙烷-b-N-异丙基丙烯酰胺)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸甲酯)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸硝基苄酯)、聚(环氧乙烷-b-N，N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯)、聚(环氧乙烷-b-环氧丙烷)、聚(环氧乙烷-b-丙烯酸叔丁酯)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸叔丁酯)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸四氢糠基酯)、聚(环氧乙烷-b-2-乙基噁唑啉)、聚(环氧乙烷-b-2-甲基丙烯酸羟乙酯)、聚(环氧乙烷-b-2-甲基噁唑啉)、聚(异丁烯-b-丙烯酸)、聚(异丁烯-b-环氧乙烷)、聚(异丁烯-b-甲基丙烯酸)、聚(苯乙烯-b-丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-b-丙烯酸)、聚(苯乙烯-b-丙烯酸铯)、聚(苯乙烯-b-环氧乙烷)、在嵌段连接处可切割的聚(苯乙烯-b-环氧乙烷)酸、聚(苯乙烯-b-甲基丙烯酸)、聚(4-苯乙烯磺酸-b-环氧乙烷)、聚(苯乙烯磺酸-b-甲基丁二烯)、聚(苯乙烯-b-N，N-二甲基丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-b-N-异丙基丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-b-碘化N-甲基2-乙烯基吡啶鎓)、聚(苯乙烯-b-碘化N-甲基-4-乙烯基吡啶鎓)、聚(苯乙烯-b-丙基丙烯酸)、聚(苯乙烯-b-丙烯酸钠)聚(苯乙烯-b-甲基丙烯酸钠)、聚对氯甲基苯乙烯-b-丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-共-对氯甲基苯乙烯-b-丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-共-对氯甲基苯乙烯-b-丙烯酸)、聚(苯乙烯-b-甲基丁烯-共-磺酸异戊二烯酯)、聚(二甲基硅氧烷-b-丙烯酸)、聚(二甲基硅氧烷-b-环氧乙烷)、聚(二甲基硅氧烷-b-甲基丙烯酸)、聚(二茂铁基二甲基甲硅烷-b-环氧乙烷)、聚(2-乙烯基萘-b-丙烯酸)、聚(2-乙烯基吡啶-b-环氧乙烷)、聚(2-乙烯基吡啶-b-甲基丙烯酸)、聚(碘化N-甲基2-乙烯基吡啶鎓-b-环氧乙烷)、聚(碘化N-甲基4-乙烯基吡啶鎓-b-甲基丙烯酸甲酯)、聚(4-乙烯基吡啶-b-环氧乙烷)PEO端官能性OH、聚(乙烯基吡咯烷酮-b-D/L-交酯)、60％十二烷基-枝接-聚(异丁烯-交替-马来酸酐)(P60)、70％十二烷基-枝接-聚(异丁烯-交替-马来酸酐)(P70)、80％十二烷基-枝接-聚(异丁烯-交替-马来酸酐)(P80)、或其组合。

在一些方面中，第一基质聚合物是聚苯乙烯-枝接-聚(环氧乙烷)。

在一些方面中，第一基质聚合物是嵌段共聚物、随机共聚物或交替共聚物。

第二基质聚合物。在一些方面中，偏振敏感纳米颗粒包含第二基质聚合物，该聚合物是非半导体聚合物。在某些方面中，第一基质聚合物是两性聚合物。

在某些方面中，第二基质聚合物选自基于聚((甲基)丙烯酸)-的共聚物、基于聚二烯的共聚物、基于聚(环氧乙烷)的共聚物、基于聚异丁烯的共聚物、基于聚苯乙烯的共聚物、基于聚硅氧烷的共聚物、基于聚(二茂铁基二甲基甲硅烷)的共聚物、基于聚(2-乙烯基萘)的共聚物、基于聚(乙烯基吡啶和碘化N-甲基乙烯基吡啶鎓)的共聚物、基于聚(乙烯基吡咯烷酮)的共聚物、基于聚丙烯酰胺的共聚物、基于聚(甲基)丙烯酸酯的共聚物、基于聚亚苯基的共聚物、基于聚乙烯的共聚物、基于聚(乙二醇)的共聚物、基于聚乳酸的共聚物、基于聚氨酯的共聚物或其组合。

在其他方面中，第二基质聚合物选自：聚(丙烯酸-b-丙烯酰胺)、聚(丙烯酸-b-甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸-b-N-异丙基丙烯酰胺)、聚(丙烯酸正丁酯-b-丙烯酸)、聚(丙烯酸钠-b-甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸-b-甲基丙烯酸新戊酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-甲基丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-N，N-二甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-丙烯酸钠)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-甲基丙烯酸钠)、聚(甲基丙烯酸新戊酯-b-甲基丙烯酸)、聚苯乙烯接枝聚(环氧乙烷)、聚(甲基丙烯酸叔丁酯-b-环氧乙烷)、聚(2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸-b-丙烯酸)、聚(丁二烯(1，2加聚)-b-环氧乙烷)、聚(丁二烯(1，2加聚)-b-甲基丙烯酸、聚(丁二烯(1，4加聚)-b-丙烯酸)、聚(丁二烯(1，4加聚)-b-环氧乙烷、聚(丁二烯(1，4加聚)-b-丙烯酸钠)、聚(丁二烯(1，4加聚)-b-碘化N-甲基4-乙烯吡啶鎓)、聚(异戊二烯-b-环氧乙烷)、聚(异戊二烯-b-环氧乙烷)，和聚(异戊二烯-b-碘化N-甲基2-乙烯吡啶鎓)、聚(环氧乙烷-b-丙烯酸)、聚(环氧乙烷-b-丙烯酰胺)、聚(环氧乙烷-b-环氧丁烷)、聚(环氧乙烷-b-c-己内酯)、聚(环氧乙烷-b-交酯)、聚(环氧乙烷-b-交酯)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸)、聚(环氧乙烷-b-丙烯酸甲酯)、聚(环氧乙烷-b-N-异丙基丙烯酰胺)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸甲酯)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸硝基苄酯)、聚(环氧乙烷-b-N，N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯)、聚(环氧乙烷-b-环氧丙烷)、聚(环氧乙烷-b-丙烯酸叔丁酯)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸叔丁酯)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸四氢糠基酯)、聚(环氧乙烷-b-2-乙基噁唑啉)、聚(环氧乙烷-b-2-甲基丙烯酸羟乙酯)、聚(环氧乙烷-b-2-甲基噁唑啉)、聚(异丁烯-b-丙烯酸)、聚(异丁烯-b-环氧乙烷)、聚(异丁烯-b-甲基丙烯酸)、聚(苯乙烯-b-丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-b-丙烯酸)、聚(苯乙烯-b-丙烯酸铯)、聚(苯乙烯-b-环氧乙烷)、在嵌段连接处可切割的聚(苯乙烯-b-环氧乙烷)酸、聚(苯乙烯-b-甲基丙烯酸)、聚(4-苯乙烯磺酸-b-环氧乙烷)、聚(苯乙烯磺酸-b-甲基丁二烯)、聚(苯乙烯-b-N，N-二甲基丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-b-N-异丙基丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-b-碘化N-甲基2-乙烯基吡啶鎓)、聚(苯乙烯-b-碘化N-甲基-4-乙烯基吡啶鎓)、聚(苯乙烯-b-丙基丙烯酸)、聚(苯乙烯-b-丙烯酸钠)聚(苯乙烯-b-甲基丙烯酸钠)、聚对氯甲基苯乙烯-b-丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-共-对氯甲基苯乙烯-b-丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-共-对氯甲基苯乙烯-b-丙烯酸)、聚(苯乙烯-b-甲基丁烯-共-磺酸异戊二烯酯)、聚(二甲基硅氧烷-b-丙烯酸)、聚(二甲基硅氧烷-b-环氧乙烷)、聚(二甲基硅氧烷-b-甲基丙烯酸)、聚(二茂铁基二甲基甲硅烷-b-环氧乙烷)、聚(2-乙烯基萘-b-丙烯酸)、聚(2-乙烯基吡啶-b-环氧乙烷)、聚(2-乙烯基吡啶-b-甲基丙烯酸)、聚(碘化N-甲基2-乙烯基吡啶鎓-b-环氧乙烷)、聚(碘化N-甲基4-乙烯基吡啶鎓-b-甲基丙烯酸甲酯)、聚(4-乙烯基吡啶-b-环氧乙烷)PEO端官能性OH、聚(乙烯基吡咯烷酮-b-D/L-交酯)、60％十二烷基-枝接-聚(异丁烯-交替-马来酸酐)(P60)、70％十二烷基-枝接-聚(异丁烯-交替-马来酸酐)(P70)、80％十二烷基-枝接-聚(异丁烯-交替-马来酸酐)(P80)、或其组合。

在一些方面中，第二基质聚合物是聚苯乙烯-枝接-聚(环氧乙烷)。

在一些方面中，第二基质聚合物是嵌段共聚物、随机共聚物或交替共聚物。

在某些方面中，第二基质聚合物是P60，其定义为两性聚合物，其中聚(异丁烯-交替-马来酸酐)中60％的马来酸酐环已经与十二烷基胺发生反应，留下其40％的酸酐环。P60也称为60％十二烷基-枝接-聚(异丁烯-交替-马来酸酐)。

在某些方面中，第二基质聚合物是P70，其定义为两性聚合物，其中聚(异丁烯-交替-马来酸酐)中70％的马来酸酐环已经与十二烷基胺发生反应，留下其30％的酸酐环。P70也称为70％十二烷基-枝接-聚(异丁烯-交替-马来酸酐)。

在某些方面中，第二基质聚合物是P80，其定义为两性聚合物，其中聚(异丁烯-交替-马来酸酐)中80％的马来酸酐环已经与十二烷基胺发生反应，留下其20％的酸酐环。P80也称为80％十二烷基-枝接-聚(异丁烯-交替-马来酸酐)。

本文所述的方法和组合物还包括不是半导体的聚合物，例如，非半导体聚合物。在某些实施方式中，官能化的混合纳米颗粒包含具有一个或多个官能化的单体单元的共聚物，例如两性聚合物。如本文所述，当涉及含有两性聚合物的发色混合纳米颗粒时，应该小心确保亲水性官能团不会对聚合物链塌缩成混合纳米颗粒形式有不良影响，或者不会对形成的发色偏振敏感纳米颗粒的稳定性有不良影响。这通过例如相对于发色聚合物调节两亲性官能化聚合物的百分比来实现。

非半导体聚合物包括用于本文所述方法和组合物的任意聚合物，该聚合物不是半导体聚合物，例如，基质聚合物、官能化聚合物等。在一些方面中，基质聚合物和官能化聚合物相同。在其他实施方式中，基质聚合物和官能化聚合物不同。

提供了其他合适的聚合物和发色偏振敏感纳米颗粒，例如参见WO2011/057295，其通过引用全文纳入本文。例如在WO2011/057295中，发色偏振敏感纳米颗粒中的聚合物可经物理掺混或化学连接(或化学交联)。例如，物理掺混的发色偏振敏感纳米颗粒可包括掺混在发色聚合物混合纳米颗粒中并通过非共价相互作用固定在一起的聚合物。化学连接的发色偏振敏感纳米颗粒可包括发色聚合物混合纳米颗粒中彼此共价接合的聚合物。在一些方面中，化学结合的聚合物在形成发色偏振敏感纳米颗粒之前互相共价接合。在一些方面中，这些聚合物和发色偏振敏感纳米颗粒可包括例如PCT/US11/56768中公开和要求保护的那些。例如，这些发色偏振敏感纳米颗粒可包括直接官能化和/或具有低密度官能化的那些。

在一些方面中，使用的发色偏振敏感纳米颗粒含有包含羧基、氨基、巯基、酯、琥珀酰酯、叠氮化物、炔、环辛炔或膦基团的梳状聚合物。在一些方面中，使用的发色偏振敏感纳米颗粒含有基于聚(甲基丙烯酸甲酯)的梳状聚合物。基于聚(甲基丙烯酸甲酯)的梳状聚合物的非限制性示例包括聚(甲基丙烯酸甲酯)接枝丙烯酸、聚(甲基丙烯酸甲酯)接枝环氧乙烷等。

聚合物的掺混物

在某些实施方式中，偏振敏感纳米颗粒可包含半导体聚合物的掺混物。这些掺混物可包含均聚物、共聚物和寡聚物的任意组合。选择用于形成偏振敏感纳米颗粒的聚合物掺混物以调节所得偏振敏感纳米颗粒的性质，例如，实现聚合物混合纳米颗粒的所需激发或发射光谱。

在一些方面中，偏振敏感纳米颗粒可包含半导体聚合物和非半导体聚合物的掺混物。这些掺混物可包含均聚物、共聚物和寡聚物的任意组合。选择用于形成偏振敏感纳米颗粒的聚合物掺混物以调节所得偏振敏感纳米颗粒的性质，例如，实现聚合物混合纳米颗粒的所需激发或发射光谱。

在多个方面中，进行聚合物的掺混使得该掺混物包含一定比率，例如质量比率的聚合物。在一些方面中，质量比率是低质量比率，例如，在半导体聚合物的质量相对非半导体的质量低的情况中。低质量比率是混合纳米颗粒中半导体聚合物质量的百分比低于混合纳米颗粒的总质量的50％的比率。在一些方面中，混合纳米颗粒中半导体聚合物质量的百分比小于50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0.5％。在一些方面中，混合纳米颗粒中半导体聚合物质量的百分比是50％-45％、45％-40％、40％-35％、35％-30％、30％-25％、25％-20％、20％-19％、19％-18％、18％-17％、17％-16％、16％-15％、15％-14％、14％-13％、13％-12％、12％-11％、11％10％、10％-9％、9％-8％、8％-7％、7％-6％、6％-5％、5％-4％、4％-3％、3％-2％、2％-1％或1％-0.5％。

在一些方面中，聚合物的总质量低于20kDa、19kDa、18kDa、17kDa、16kDa、15kDa、14kDa、13kDa、12kDa、11kDa、10kDa、9kDa、8kDa、7kDa、6kDa、5kDa、4kDa、3kDa、2kDa、1kDa或0.5kDa。在一些方面中，混合纳米颗粒中半导体聚合物质量的百分比是20kDa-19kDa、19kDa-18kDa、18kDa-17kDa、17kDa-16kDa、16kDa-15kDa、15kDa-14kDa、14kDa-13kDa、13kDa-12kDa、12kDa-11kDa、11kDa10kDa、10kDa-9kDa、9kDa-8kDa、8kDa-7kDa、7kDa-6kDa、6kDa-5kDa、5kDa-4kDa、4kDa-3kDa、3kDa-2kDa、2kDa-1kDa或1kDa-0.5kDa。

在一些方面中，聚合物的掺混物可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或低于20条链的单一聚合物。在其他实施方式中，聚合物的掺混物可包含1条单链的单一聚合物。在多个方面中，聚合物的掺混物中的单个聚合物链是半导体聚合物的单一链。

在一些方面中，聚合物的掺混物形成混合纳米颗粒。混合纳米颗粒可包含含有一定比率，例如质量比率的聚合物的掺混物。在一些方面中，质量比率是低质量比率，例如，在半导体聚合物的质量相对非半导体的质量低。低质量比率是混合纳米颗粒中半导体聚合物质量的百分比低于混合纳米颗粒的总质量的50％的情况的比率。在一些方面中，混合纳米颗粒中半导体聚合物质量的百分比小于50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0.5％。在一些方面中，混合纳米颗粒中半导体聚合物质量的百分比是50％-45％、45％-40％、40％-35％、35％-30％、30％-25％、25％-20％、20％-19％、19％-18％、18％-17％、17％-16％、16％-15％、15％-14％、14％-13％、13％-12％、12％-11％、11％10％、10％-9％、9％-8％、8％-7％、7％-6％、6％-5％、5％-4％、4％-3％、3％-2％、2％-1％或1％-0.5％。

在一些方面中，聚合物的掺混物形成混合纳米颗粒，其中各聚合物在混合纳米颗粒中，其中聚合物的总质量低于20kDa、19kDa、18kDa、17kDa、16kDa、15kDa、14kDa、13kDa、12kDa、11kDa、10kDa、9kDa、8kDa、7kDa、6kDa、5kDa、4kDa、3kDa、2kDa、1kDa或0.5kDa。在一些方面中，混合纳米颗粒中半导体聚合物质量的百分比是20kDa-19kDa、19kDa-18kDa、18kDa-17kDa、17kDa-16kDa、16kDa-15kDa、15kDa-14kDa、14kDa-13kDa、13kDa-12kDa、12kDa-11kDa、11kDa10kDa、10kDa-9kDa、9kDa-8kDa、8kDa-7kDa、7kDa-6kDa、6kDa-5kDa、5kDa-4kDa、4kDa-3kDa、3kDa-2kDa、2kDa-1kDa或1kDa-0.5kDa。

在一些方面中，聚合物的掺混物可形成混合纳米颗粒，并且该混合纳米颗粒可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或低于20条链的单一聚合物。在其他实施方式中，聚合物的掺混物可包含1条单链的单一聚合物。在多个方面中，聚合物的掺混物中的单个聚合物链是半导体聚合物的单一链。

本发明的一种情况提供了形成稳定的混合纳米颗粒的官能化的发色聚合物。本文所用术语“稳定”指在适当水溶液中储存延长的一段时间时不聚集和/或显著改变尺寸的发色偏振敏感纳米颗粒(由电子显微镜、原子力显微镜或动态光散射测量)。偏振敏感纳米颗粒的聚集或尺寸上的显著变化的特征可以是，例如，包含超过一个聚合物混合纳米颗粒的聚集体的数目增加。使用成像技术(例如电子显微镜或原子显微镜)通过肉眼观察和/或通过动态光散射显示的尺寸测量值增加来检测聚集体。在一些方面中，聚集体的特征在于，与发色偏振敏感纳米颗粒的原始测量值相比，测量的颗粒直径存在至少约10％增加、至少约25％增加、至少约50％增加、至少约100％增加、至少约500％增加，或至少约1000％增加。例如，发色偏振敏感纳米颗粒可在第一天测得直径中位数为15nm并随后在四个月后测得直径中位数为30nm，从而显示所测量颗粒直径的100％增加(即表现出聚集)。在某些实施方式中，这些发色偏振敏感纳米颗粒在储存于适当水溶液中时稳定至少约一个月，优选至少约2个月，更优选至少约4个月。在某些实施方式中，稳定的发色混合纳米颗粒将在至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、30、36、42、48或更多个月期间不聚集或在尺寸上发生显著变化。在一个情况中，本发明提供的官能化发色混合纳米颗粒将在适当水溶液中稳定至少约4个月。在另一个情况中，本发明提供的官能化发色混合纳米颗粒将在适当水溶液中稳定至少约6个月。在其他情况中，本发明提供的官能化发色混合纳米颗粒将在适当水溶液中稳定至少约一年。

在一些方面中，术语“稳定”可指发色聚合物混合纳米颗粒耐受聚合物混合纳米颗粒中掺杂物或聚合物分子的解离。例如，发色偏振敏感纳米颗粒可包含若干聚合物分子且这些聚合物分子可在浸出至溶液前在聚合物混合纳米颗粒中维持一段时间。聚合物分子从偏振敏感纳米颗粒中浸出的特征在于例如偏振敏感纳米颗粒的光物理性质减低。在一些方面中，发色偏振敏感纳米颗粒的稳定性降低的特征在于在对应于聚合物混合纳米颗粒发射的波长下发射强度随时间降低。在某些实施方式中，可通过在对应于聚合物点发射的特定波长下发射强度随时间升高来检测偏振敏感纳米颗粒的降解。除了测量聚合物发射外，偏振敏感纳米颗粒还设计为在混合纳米颗粒形成期间整合溶液中的荧光染料。随着偏振敏感纳米颗粒的降解，染料可随时间浸出并被检测。

大多数用于发色偏振敏感纳米颗粒的有机聚合物是绝缘体。当有机聚合物具有π-共轭结构时，电子可通过跳跃、隧道效应和相关机制通过π-电子云中的重叠沿聚合物主链移动。在一些方面中，这些π-共轭聚合物包括宽带隙半导体，例如半导体聚合物。

在一些方面中，使用的发色聚合物混合纳米颗粒包含携带以下单元的聚合物：小有机染料分子、金属复合物、光发色染料及其任意组合，例如，无光学活性聚合物，如与小有机染料、金属复合物、光发色染料及其任意组合共价连接或接枝的聚苯乙烯。这些染料或金属复合物可具有蛋白质传感能力。

可以使用多种偏振敏感纳米颗粒，例如本文所述实施例以及公开于例如WO2011/057295和WO2013/101902中的其他聚合物点，上述文献各自通过引用全文纳入本文且具体涉及本文所述的特定发色聚合物混合纳米颗粒组合物和相应的制备这些组合物的方法。例如在WO2011/057295中，偏振敏感纳米颗粒中的聚合物可经物理掺混或化学连接(或化学交联)。例如，物理掺混的偏振敏感纳米颗粒可包括掺混在聚合物混合纳米颗粒中并通过非共价相互作用固定在一起的聚合物。化学连接的偏振敏感纳米颗粒可包括聚合物混合纳米颗粒中互相共价接合的聚合物。化学结合的聚合物在形成偏振敏感纳米颗粒之前互相共价接合。

例如，这些偏振敏感纳米颗粒可包括直接官能化和/或具有低密度官能化的那些。

在一些方面中，第一基质聚合物和第二基质聚合物相同。在其他方面中，第一基质聚合物和第二基质聚合物不同。

官能化的聚合物

在一些方面中，使用的发色偏振敏感纳米颗粒含有在末端单体单元上官能化的聚合物，例如使用羧基、氨基、巯基、酯、琥珀酰酯、叠氮化物、炔、环辛炔、膦或类似官能团。使用的聚合物的示例包括但不限于：聚(甲基)丙烯酸酯聚合物、聚丙烯酰胺聚合物、聚异丁烯、聚二烯、聚亚苯基、聚乙烯、聚乙二醇、聚丙交酯、聚苯乙烯、聚硅氧烷、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚氨酯，其嵌段共聚物，其随机或交替共聚物，等。

在一些方面中，使用的发色偏振敏感纳米颗粒含有具有一个或多个官能化的单体单元的共聚物，例如，两性聚合物，包括但不限于：基于聚((甲基)丙烯酸)-的共聚物，如：聚(丙烯酸-b-丙烯酰胺)、聚(丙烯酸-b-甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸-b-N-异丙基丙烯酰胺)、聚(丙烯酸正丁酯-b-丙烯酸)、聚(丙烯酸钠-b-甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸-b-甲基丙烯酸新戊酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-甲基丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-N，N-二甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-丙烯酸钠)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-甲基丙烯酸钠)、聚(甲基丙烯酸新戊酯-b-甲基丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸叔丁酯-b-环氧乙烷)、聚(2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸-b-丙烯酸)；基于聚二烯的共聚物，如：聚(丁二烯(1，2加聚)-b-环氧乙烷)、聚(丁二烯(1，2加聚)-b-甲基丙烯酸、聚(丁二烯(1，4加聚)-b-丙烯酸)、聚(丁二烯(1，4加聚)-b-环氧乙烷、聚(丁二烯(1，4加聚)-b-丙烯酸钠)、聚(丁二烯(1，4加聚)-b-碘化N-甲基4-乙烯基吡啶鎓)、聚(异戊二烯-b-环氧乙烷)、聚(异戊二烯-b-环氧乙烷)，和聚(异戊二烯-b-碘化N-甲基2-乙烯基吡啶鎓)；基于聚(环氧乙烷)的共聚物，如：聚(环氧乙烷-b-丙烯酸)、聚(环氧乙烷-b-丙烯酰胺)、聚(环氧乙烷-b-环氧丁烷)、聚(环氧乙烷-b-c-己内酯)、聚(环氧乙烷-b-交酯)、聚(环氧乙烷-b-交酯)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸)、聚(环氧乙烷-b-丙烯酸甲酯)、聚(环氧乙烷-b-N-异丙基丙烯酰胺)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸甲酯)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸硝基苄酯)、聚(环氧乙烷-b-N，N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯)、聚(环氧乙烷-b-环氧丙烷)、聚(环氧乙烷-b-丙烯酸叔丁酯)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸叔丁酯)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸四氢糠基酯)、聚(环氧乙烷-b-2-乙基噁唑啉)、聚(环氧乙烷-b-2-甲基丙烯酸羟乙酯)、聚(环氧乙烷-b-2-甲基噁唑啉)；基于聚异丁烯的共聚物，如聚(异丁烯-b-丙烯酸)、聚(异丁烯-b-环氧乙烷)、聚(异丁烯-b-甲基丙烯酸)；基于聚苯乙烯的共聚物，如：聚(苯乙烯-b-丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-b-丙烯酸)、聚(苯乙烯-b-丙烯酸铯)、聚(苯乙烯-b-环氧乙烷)、在嵌段连接处可切割的聚(苯乙烯-b-环氧乙烷)酸、聚(苯乙烯-b-甲基丙烯酸)、聚(4-苯乙烯磺酸-b-环氧乙烷)、聚(苯乙烯磺酸-b-甲基丁二烯)、聚(苯乙烯-b-N，N-二甲基丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-b-N-异丙基丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-b-碘化N-甲基2-乙烯基吡啶鎓)、聚(苯乙烯-b-碘化N-甲基-4-乙烯基吡啶鎓)、聚(苯乙烯-b-丙基丙烯酸)、聚(苯乙烯-b-丙烯酸钠)聚(苯乙烯-b-甲基丙烯酸钠)、聚对氯甲基苯乙烯-b-丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-共-对氯甲基苯乙烯-b-丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-共-对氯甲基苯乙烯-b-丙烯酸)、聚(苯乙烯-b-甲基丁烯-共-磺酸异戊二烯酯)；基于聚硅氧烷的共聚物，如：聚(二甲基硅氧烷-b-丙烯酸)、聚(二甲基硅氧烷-b-环氧乙烷)、聚(二甲基硅氧烷-b-甲基丙烯酸)；基于聚(二茂铁基二甲基甲硅烷)的共聚物，如：聚(二茂铁基二甲基甲硅烷-b-环氧乙烷)；基于聚(2-乙烯基萘)的共聚物，如：聚(2-乙烯基萘-b-丙烯酸)、基于聚(乙烯基吡啶和碘化N-甲基乙烯基吡啶鎓)的共聚物，如：聚(2-乙烯基吡啶-b-环氧乙烷)、聚(2-乙烯基吡啶-b-甲基丙烯酸)、聚(碘化N-甲基2-乙烯基吡啶鎓-b-环氧乙烷)、聚(碘化N-甲基4-乙烯基吡啶鎓-b-甲基丙烯酸甲酯)、聚(4-乙烯基吡啶-b-环氧乙烷)PEO端官能性OH；以及基于聚(乙烯基吡咯烷酮)的共聚物，如：聚(乙烯基吡咯烷酮-b-D/L-交酯)；等。

官能化的混合纳米颗粒

本发明描述了包含超过一种聚合物的纳米颗粒和混合纳米颗粒的组合物、制备方法和使用方法。在一些方面中，混合纳米颗粒包含半导体聚合物和至少一种类型的非半导体聚合物，其包括官能化的非半导体聚合物和/或基质非半导体聚合物。

在一些方面中，第一基质聚合物包含能够共轭的第一官能团。在某些方面中，第一官能团选自：醛、烯、烷基、炔、链炔、氨基、叠氮化物、羰基、羧基、氰基、环辛炔、二烯、酯、琥珀酰亚胺基酯、卤代烷基、羟基、亚氨基、酮、马来酰亚胺、巯基、磷酸酯/盐、膦、硫酸酯/盐、磺酸酯/盐，其取代的衍生物，或其组合。在某些方面中，第一官能团是羧基。

在一些方面中，第二基质聚合物包含能够共轭的第二官能团。在某些方面中，第二官能团选自：醛、烯、烷基、炔、链炔、氨基、叠氮化物、羰基、羧基、氰基、环辛炔、二烯、酯、琥珀酰亚胺基酯、卤代烷基、羟基、亚氨基、酮、马来酰亚胺、巯基、磷酸酯/盐、膦、硫酸酯/盐、磺酸酯/盐，其取代的衍生物，或其组合。在某些方面中，第二官能团是羧基。

在一些方面中，发色聚合物在第一官能团处共轭、第二官能团处共轭，或其组合。在其他方面中，偏振敏感纳米颗粒与结合部分共轭并且其中结合部分经设置与靶标结合。在某些方面中，靶标是生物分子。在其他方面中，靶标是生物标志物。在其他方面中，靶标选自抗体、抗原、细胞、核酸、酶、酶的底物、蛋白质、脂质、碳水化合物或其组合。

在某些方面中，第一官能团、第二官能团或其组合适于生物共轭。在其他方面中，偏振敏感纳米颗粒与链霉亲和素生物共轭。在其他方面中，偏振敏感纳米颗粒与蛋白质、抗体、核酸分子、脂质、肽、适体、药物，或其组合生物共轭。在其他方面中，偏振敏感纳米颗粒与聚乙二醇共轭。

在其他方面中，偏振敏感纳米颗粒包含官能团，其中官能团抑制偏振敏感纳米颗粒与其他偏振敏感纳米颗粒聚集。在其他方面中，官能团抑制偏振敏感纳米颗粒处的非特异性吸附。

在一些方面中，优势可来自于使用包含单个聚合物分子的偏振敏感纳米颗粒，该聚合物分子在末端单元处具有至少一个官能团。例如，在聚合物合成中良好地控制仅一个官能团与发色聚合物末端单元的接合。例如，包含官能团的化学单元可用作聚合引发剂以及聚合物合成中的生长催化剂，且在该方法中各聚合物分子在末端处仅包含一个官能团。还在聚合物合成中良好地控制官能团仅与线性发色聚合物的两个末端单元接合。例如，包含官能团的化学单元用作封端剂以终止聚合物合成中的聚合物生长，从而导致各线性聚合物分子仅在两个末端单元中包含两个官能团。类似地，可在聚合物合成中良好地控制多价偏振敏感纳米颗粒的官能团的接合，例如，可仅将官能团添加至三臂分支聚合物的三个末端单元。如本文所述官能化任意聚合物，例如半导体或非半导体聚合物。

在多个实施方式中，本发明提供了“官能化”偏振敏感纳米颗粒的应用，且具体而言作为修饰聚合物混合纳米颗粒表面的方法。在发色偏振敏感纳米颗粒的上下文中，本文所用术语“官能化”指与一种或多种官能团连接(如共价连接)的发色偏振敏感纳米颗粒。本文所用术语“官能团”指满足下述条件的任何化学单元，其与发色聚合物接合(如通过任何稳定的物理或化学连接)，从而改变发色聚合物混合纳米颗粒的表面，例如形成可用于共轭(如生物共轭)的表面。该官能团可共价连接发色聚合物的主链、侧链或末端单元之一。官能团是以下中的任意(但不限于)：醛、烯、烷基、炔、链炔、氨基、叠氮化物、羰基、羧基、氰基、环辛炔、二烯、酯、琥珀酰亚胺酯、卤代烷基、羟基、亚氨基、酮、马来酰亚胺、巯基、磷酸酯/盐、膦、硫酸酯/盐、磺酸酯/盐，其取代的衍生物或其组合。通常，使用适用于生物共轭的任何其他官能团。本领域的普通技术人员可在例如BioconjugateTechniques(《生物共轭技术》)(学术出版社(AcademicPress)，纽约，1996年或之后的版本)中找到这类官能团，其通过引用全文纳入本文用于所有目的。

在一些方面中，本发明的官能团选自：醛、烯、烷基、炔、链炔、氨基、叠氮化物、羰基、羧基、氰基、环辛炔、二烯、酯、琥珀酰亚胺基酯、卤代烷基、羟基、亚氨基、酮、马来酰亚胺、巯基、磷酸酯/盐、膦、硫酸酯/盐、磺酸酯/盐，其取代的衍生物或其组合。

在多个实施方式中，该聚合物偏振纳米颗粒包含与聚合物混合纳米颗粒接合的官能团。在某些实施方式中，该官能团选自疏水性官能团、亲水性官能团或其组合。在一些方面中，该官能团适用于生物共轭。

在某些实施方式中，该官能团选自：醛、烯、烷基、炔、链炔、氨基、叠氮化物、羰基、羧基、氰基、环辛炔、二烯、酯、琥珀酰亚胺酯、卤代烷基、羟基、亚氨基、酮、马来酰亚胺、巯基、磷酸酯/盐、膦、硫酸酯/盐、磺酸酯/盐，或其组合。

在一个情况中，本发明还提供发色聚合物混合纳米颗粒和仅一个官能团。发色聚合物混合纳米颗粒含有至少一种发色聚合物。本文所用的术语“单价”是指仅一个与发色偏振敏感纳米颗粒接合的官能团。官能团通过任意合适的物理连接或化学结合与发色聚合物混合纳米颗粒接合，并且在发色聚合物混合纳米颗粒的表面上仅提供一个用于生物共轭的反应位点。

在另一个情况中，本发明提供发色聚合物混合纳米颗粒和仅2个官能团。发色聚合物混合纳米颗粒含有至少一种发色聚合物。本文所用的术语“二价”是指仅2个与各发色聚合物混合纳米颗粒接合的官能团。官能团通过任意合适的物理连接或化学结合与发色聚合物混合纳米颗粒接合，并且在发色聚合物混合纳米颗粒的表面上仅提供2个用于生物共轭的反应位点。这2个反应位点可以具有不同的反应性(例如，通过2种不同类型的官能团)或相同的反应性。

在一些方面中，发色偏振敏感纳米颗粒可包括至少一种半导体聚合物。在某些实施方式中，发色偏振敏感纳米颗粒可包括具有离域电子的发光半导体聚合物。本领域中公认术语“半导体聚合物”。一般的发光半导体聚合物包括，但不限于芴聚合物、亚苯基亚乙烯基聚合物、亚苯基聚合物、苯并噻唑聚合物、噻吩聚合物、咔唑芴聚合物、硼-二吡咯亚甲基聚合物和相关的共聚物。在某些实施方式中，本发明的半导体聚合物包括沿着聚合物主链没有三键的聚合物。在一些方面中，发色偏振敏感纳米颗粒可包括单分子半导体聚合物。在某些实施方式中，发色偏振敏感纳米颗粒可包括若干分子的半导体聚合物，其中半导体聚合物分子相同或不同。该若干分子可以例如是相同类型的半导体聚合物或不同聚合物的掺混物(例如，半导体聚合物和/或非半导体聚合物)。在一种情况中，本发明提供官能化的发色聚合物，其中亲水性官能团以足够低的密度导入聚合物的侧链中，使得官能团不会对聚合物链塌缩成混合纳米颗粒形式有不良影响，和/或不会对形成的发色偏振敏感纳米颗粒的稳定性和性能有不良影响，和/或不会对紧密内部结构有不良松动，和/或荧光亮度没有不良降低，和/或没有不良增加非特异性标记。如本文所述，官能团的亲水性程度可能影响构成对给予偏振敏感纳米颗粒所需性质而言足够低的密度。在一些方面中，侧链上官能团的密度低于约50％。在一些方面中，侧链上官能团的密度低于约40％。在一些方面中，侧链上官能团的密度低于约30％。在一些方面中，侧链上官能团的密度低于约25％。在另一个情况中，侧链上官能团的密度低于约20％。在另一个情况中，侧链上官能团的密度低于约15％。在另一个情况中，侧链上官能团的密度低于约10％。在另一个情况中，侧链上官能团的密度低于约5％。在某些实施方式中，侧链上官能团的密度低于约25％，或低于约24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％，或更低。在某些示例实施方式中，在混合纳米颗粒形成之后(后官能化)，发色混合纳米颗粒表面上官能团的密度通过表面修饰增加，因为已经形成混合纳米颗粒并且亲水性部分不会对偏振敏感纳米颗粒的形成、稳定性、内部结构和荧光亮度有不良影响。此外，亲水性部分可提供某些性质如通过PEG基团减少非特异性相互作用，和/或通过高度带电物质生成高表面ζ电势和/或通过两性离子性部分产生两性离子性表面。

在另一种情况中，本发明提供官能化的发色聚合物，其中亲水性官能团仅导入聚合物主链的末端基团中，其中官能团不会对聚合物链塌缩成混合纳米颗粒形式有不良影响，和/或不会对形成的发色偏振敏感纳米颗粒的稳定性有不良影响，和/或不会对紧密内部结构有不良松动，和/或不会使荧光亮度有不良降低，和/或不会使非特异性标记有不良增加。在另一种情况中，亲水性官能团同时导入聚合物主链的末端基团和聚合物的侧链中，但是以足够低的密度其中官能团不会对聚合物链塌缩成混合纳米颗粒形式有不良影响，或不会对形成的发色偏振敏感纳米颗粒的稳定性有不良影响，或不会对紧密内部结构有不良松动，或不会使荧光亮度有不良降低，或不会使非特异性标记有不良增加。官能团的亲水性程度可能影响构成对给予偏振敏感纳米颗粒所需性质而言足够低的密度。在某些示例实施方式中，在混合纳米颗粒形成之后(后官能化)，通过表面修饰增加发色混合纳米颗粒表面上的亲水性部分，因为已经形成混合纳米颗粒并且亲水性部分不会对偏振敏感纳米颗粒的形成、稳定性、内部结构和荧光亮度有不良影响，但是可能提供某些性质，如通过PEG基团减少非特异性相互作用，和/或通过高度带电物质生成高表面ζ电势和/或通过两性离子性部分产生两性离子性表面。

在一些方面中，本发明提供了包含疏水性官能团的官能化的发色聚合物。疏水性官能团包括但不限于用于点击化学的那些，如炔、张力炔、叠氮化物、二烯、烯烃、环辛炔和膦基团。疏水性官能团的密度在0％到100％之间变化。在某些实施方式中，疏水性官能团的密度为约100％、低于约100％、低于约90％、低于约80％、低于约70％、低于约60％、低于约50％、低于约40％、低于约30％、低于约20％、低于约10％、低于约5％、低于约1％，或更低。在一些方面中，用疏水性官能团官能化的密度不会对聚合物链塌缩成混合纳米颗粒形式有不良影响，和/或不会对形成的发色偏振敏感纳米颗粒的稳定性有不良影响，和/或不会对紧密内部结构有不良松动，和/或不会使荧光亮度有不良降低，和/或不会使非特异性标记有。不良增加在某些实施方式中，疏水性官能团枝节连接到本文进一步所述的生物相关分子(例如，抗体)或者转化成可连接到生物相关分子的亲水性官能团或转化成其他亲水性部分为了在形成发色聚合物混合纳米颗粒之后具有某些性质。

在另一种情况中，官能化的发色聚合物可包括疏水性发色聚合物，其与另一种或多种带有疏水性官能团的发色聚合物物理混合或化学交联。疏水性发色聚合物可能不包括亲水性官能团，但是可能具有疏水性官能团(例如，用于点击化学的那些，包括但不限于炔、张力炔、叠氮化物、二烯、烯烃、环辛炔和膦基)。在某些实施方式中，用一种或多种发色聚合物官能化发色偏振敏感纳米颗粒的表面，该发色聚合物包含亲水性官能团，其导入聚合物侧链或聚合物主链的末端基团中。在这些实施方式中，官能化的发色聚合物中官能化的密度是0％至100％，但是官能化的发色聚合物与疏水性聚合物的掺混比率应足够低，使得官能化不会对聚合物链塌缩成混合纳米颗粒形式有不良影响，和/或不会对形成的发色偏振敏感纳米颗粒的稳定性有不良影响，和/或不会对紧密内部结构有不良松动，和/或不会使荧光亮度有不良降低，和/或不会使非特异性标记有不良增加。

在一些方面中，官能化的发色聚合物包含在形成颗粒之前互相化学交联的一个或多个官能化的发色聚合物并且也包含用于生物共轭的表面官能团。在这种情况中，官能团导入聚合物侧链或聚合物主链的末端基团中。官能化发色聚合物中的官能化密度在0％到100％之间变化以形成具有化学交联的结构的发色偏振敏感纳米颗粒，其中甚至在高密度的官能化下，化学交联可辅助聚合物链塌缩成混合纳米形式，形成紧密内部结构，保持形成的发色偏振敏感纳米颗粒的良好稳定性和荧光亮度。

电子、空穴或电子能量沿共轭聚合物的共轭结构传导。在一些方面中，大部分聚合物主链是共轭的。在一些方面中，整个聚合物主链是共轭的。在一些方面中，该聚合物可在其侧链或末端中包含共轭结构。在一些方面中，该共轭聚合物可具有传导性质，例如，该聚合物可导电。在一些方面中，该共轭聚合物可具有半导体性质，例如，该聚合物可显示直接带隙，导致带边缘处有效的吸收或发射。在一些方面中，可将发色偏振敏感纳米颗粒描述为一种混合纳米颗粒，其包含至少一种浓缩(或塌缩)的共轭聚合物(如半导体聚合物)以形成混合纳米颗粒结构。

聚合物，或包含聚合物的混合纳米颗粒，与另一部分共轭，所述另一部分具有可用于治疗、诊断、成像或研究的性质。例如，聚合物或混合纳米颗粒通过接头与其他部分共轭。该接头是亲水性的或疏水性的。接头的非限制性示例包括化学键，小分子，如氨基酸，官能团，如酯，和酰胺，氨基甲酸酯，醚，亚烷基，亚烯基，和亚炔基，或亚芳基，或聚合物，如聚醚、聚酯、聚酰胺、聚氨基甲酸酯、聚芳基、聚苯乙烯或聚烯烃。在一些方面中，该接头是聚乙二醇或聚苯乙烯聚乙二醇。

在一些方面中，该聚合物与亲水性部分，例如亲水性官能团共轭。亲水性官能团的非限制性示例包括羧基、羟基、氨基、酰氨基、巯基、硫酸基团、磷酸基团和任何氢键供体或受体。

该聚合物与反应性部分共轭，例如，酸酐、酰卤、亲核试剂、亲电试剂、电子供体、电子受体、烯、炔、酸性基团、碱性基团、氧化基团、还原基团、电子转移剂或光化学反应物质。酸酐的非限制性示例包括马来酸酐和琥珀酸酐，两者都可以是取代或未取代的。

在一些方面中，提供了使用经官能化的发色偏振敏感纳米颗粒的方法、组合物和试剂盒。根据本发明，使发色偏振敏感纳米颗粒适合于进一步修饰(如生物共轭)或随后在检测蛋白质或肽中应用的任意方式来对发色偏振敏感纳米颗粒进行官能化。例如，官能团与发色聚合物的主链、侧链或末端单元之一连接(如共价连接)。在一些方面中，单价聚合物混合纳米颗粒可包含单个聚合物分子，其仅包含一个官能团，例如在单个线性聚合物分子的两个末端单元之一处。二价聚合物混合纳米颗粒可包含单个聚合物分子，其包含两个官能团，例如在单个线性聚合物分子的两个末端单元的每一个处。三价聚合物混合纳米颗粒可包含单个聚合物分子，其包含三个官能团，例如官能团仅接合三臂分支聚合物的三个末端单元。类似地，分支的聚合物用于制备其他多价偏振敏感纳米颗粒，例如，其在四臂、五臂、六臂和具有更多分支数目的分支聚合物的末端单元处接合官能团。

单价、二价或多价官能化聚合物和混合纳米颗粒

本文所述的官能团以多种方式包括在发色聚合物中。例如，官能团与发色聚合物的主链、侧链或末端单元之一连接(如共价连接)。如本文所述，单价聚合物混合纳米颗粒可包含单个聚合物分子，其仅包含一个官能团，例如在单个线性聚合物分子的两个末端单元之一处。二价聚合物混合纳米颗粒可包含单个聚合物分子，其包含两个官能团，例如在单个线性聚合物分子的两个末端单元的每一个处。三价聚合物混合纳米颗粒可包含单个聚合物分子，其包含三个官能团，例如官能团仅接合三臂分支聚合物的三个末端单元。类似地，分支的聚合物用于制备其他多价偏振敏感纳米颗粒，例如，其在四臂、五臂、六臂和具有更多分支数目的分支聚合物的末端单元处接合官能团。

在一些方面中，优势可来自于包含单个聚合物分子的偏振敏感纳米颗粒，该聚合物分子在末端单元处具有至少一个官能团。在一些方面中，优势可来自于包含超过一个聚合物分子的偏振敏感纳米颗粒，该聚合物分子在末端单元处具有至少一个官能团。例如，在聚合物合成中良好地控制仅一个官能团与发色聚合物末端单元的接合。例如，包含官能团的化学单元可用作聚合引发剂以及聚合物合成中的生长催化剂，且在该方法中各聚合物分子在末端处仅包含一个官能团。还在聚合物合成中良好地控制官能团仅与线性发色聚合物的两个末端单元接合。例如，包含官能团的化学单元用作封端剂以终止聚合物合成中的聚合物生长，从而导致各线性聚合物分子仅在两个末端单元中包含两个官能团。类似地，可在聚合物合成中良好地控制多价偏振敏感纳米颗粒的官能团的接合，例如，可仅将官能团添加至三臂分支聚合物的三个末端单元。

在某些实施方式中，向聚合物末端基团加入官能团与官能团沿着主链随机分布的聚合物相比。例如，通过侧链官能化或主链官能化的聚合物中官能团的数量难以产生具有精确数量的官能团的聚合物。相反，聚合物上官能团的数量通常按照一定分布。在某些实施方式中，末端单位中的官能团也优于其他实施方式中的侧链。与侧链和主链官能化相比，末端单元的官能化对聚合物塌缩没有太多的影响以形成偏振敏感纳米颗粒。同时，末端官能团对于水性环境的生物共轭而言可及性更高，其中侧链官能团包埋在聚合物混合纳米颗粒内部并且对于生物共轭而言不可及。

在一种情况中，发色聚合物混合纳米颗粒仅包含一个与一个官能团(例如，R)连接的发色聚合物分子。这种发色聚合物混合纳米颗粒是单价单分子混合纳米颗粒，其可提供独特的性质，如单分尺寸和均匀荧光亮度。该官能团可共价连接发色聚合物的主链、侧链或末端单元之一。官能团任意以下基团，如羧酸或其盐、氨基、巯基、叠氮基、炔、膦、环辛炔、醛、羟基、羰基、硫酸盐、磺酸盐、磷酸盐、氰酸盐、酯、琥珀酰亚胺酯、其取代的衍生物。通常，使用适用于生物共轭的任何其他官能团。本领域的普通技术人员可在例如BioconjugateTechniques(《生物共轭技术》)(学术出版社(AcademicPress)，纽约，1996年或之后的版本)中找到这类官能团，其内容通过引用全文纳入本文用于所有目的。可通过许多方法合成包含一个官能团的发色聚合物。例如，包含官能团的化学单元可用作聚合引发剂以及聚合物合成中的生长催化剂，且在该方法中各聚合物分子最后末端是仅一个官能团。

在另一种情况中，发色聚合物混合纳米颗粒仅包含超过一个与一个官能团(例如，R)连接的发色聚合物分子。这种发色聚合物混合纳米颗粒是单价单分子混合纳米颗粒，其可提供独特的性质，如单分尺寸和均匀荧光亮度。该官能团共价连接发色聚合物的主链、侧链或末端单元之一。官能团可以是任意以下基团，如羧酸或其盐、氨基、巯基、叠氮基、炔、膦、环辛炔、醛、羟基、羰基、硫酸盐、磺酸盐、磷酸盐、氰酸盐、酯、琥珀酰亚胺酯、其取代的衍生物。通常，使用适用于生物共轭的任何其他官能团。本领域的普通技术人员可在例如BioconjugateTechniques(《生物共轭技术》)(学术出版社(AcademicPress)，纽约，1996年或之后的版本)中找到这类官能团，其内容通过引用全文纳入本文用于所有目的。通过许多方法合成包含一个官能团的发色聚合物。例如，包含官能团的化学单元可用作聚合引发剂以及聚合物合成中的生长催化剂，且在该方法中各聚合物分子最后末端是仅一个官能团。

在一些方面中，发色偏振敏感纳米颗粒可包括具有2个官能团(例如，R¹和R²)的一个聚合物分子。这种发色聚合物混合纳米颗粒是二价单分子混合纳米颗粒，其可提供独特的性质，如单分尺寸和均匀荧光亮度乙基与两种不同类型的生物分子共轭。这两个官能团共价连接发色聚合物的主链、侧链和/或末端单元。在某些方面中，发色聚合物混合纳米颗粒包含具有2个末端官能团的一个线性聚合物分子。这类发色聚合混合纳米颗粒是二价单分子混合纳米颗粒，即，可用于某些应用中，如用于形成偏振化的荧光生物共轭物，或将混合纳米颗粒组装成一维结构。这2个官能团R¹和R²是相同的，或者它们是不同的。官能团任意以下基团，如羧酸或其盐、氨基、巯基、叠氮基、炔、膦、环辛炔、醛、羟基、羰基、硫酸盐、磺酸盐、磷酸盐、氰酸盐、酯、琥珀酰亚胺酯、其取代的衍生物、及其任意组合。通常，使用允许生物共轭的任何其他官能团。本领域的普通技术人员可在例如BioconjugateTechniques(《生物共轭技术》)(学术出版社(AcademicPress)，纽约，1996年或之后的版本)中找到这类官能团，其内容通过引用全文纳入本文用于所有目的。

在一些方面中，发色偏振敏感纳米颗粒可包括超过一个具有2个官能团(例如，R¹和R²)的聚合物分子。这种发色聚合物混合纳米颗粒是二价单分子混合纳米颗粒，其可提供独特的性质，如单分尺寸和均匀荧光亮度乙基与两种不同类型的生物分子共轭。这两个官能团共价连接发色聚合物的主链、侧链和/或末端单元。在某些方面中，发色聚合物混合纳米颗粒包含具有2个末端官能团的一个线性聚合物分子。这类发色聚合混合纳米颗粒是二价单分子混合纳米颗粒，即，可用于某些应用中，如用于形成偏振化的荧光生物共轭物，或将混合纳米颗粒组装成一维结构。这2个官能团R¹和R²是相同的，或者它们是不同的。官能团任意以下基团，如羧酸或其盐、氨基、巯基、叠氮基、炔、膦、环辛炔、醛、羟基、羰基、硫酸盐、磺酸盐、磷酸盐、氰酸盐、酯、琥珀酰亚胺酯、其取代的衍生物、及其任意组合。通常，使用允许生物共轭的任何其他官能团。本领域的普通技术人员可在例如BioconjugateTechniques(《生物共轭技术》)(学术出版社(AcademicPress)，纽约，1996年或之后的版本)中找到这类官能团，其内容通过引用全文纳入本文用于所有目的。

在另一个情况中，发色聚合物混合纳米颗粒包含具有3个亲水性官能团(例如，R¹、R²和R³)的一个聚合物分子。这种发色聚合物混合纳米颗粒是三价单分子混合纳米颗粒，其可提供独特的性质，如单分尺寸和均匀荧光亮度。这三个官能团共价连接发色聚合物的主链、侧链和/或末端单元。这三个官能团(例如，R¹、R²和R³)是相同的，或者它们是不同的。官能团任意以下基团，如羧酸或其盐、氨基、巯基、叠氮基、炔、膦、环辛炔、醛、羟基、羰基、硫酸盐、磺酸盐、磷酸盐、氰酸盐、酯、琥珀酰亚胺酯、其取代的衍生物、及其任意组合。通常，使用允许生物共轭的任何其他官能团。本领域的普通技术人员可在例如BioconjugateTechniques(《生物共轭技术》)(学术出版社(AcademicPress)，纽约，1996年或之后的版本)中找到这类官能团，其内容通过引用全文纳入本文用于所有目的。这种单分子混合纳米颗粒是三价的，但是具有充分控制的官能团(由主链分支数量所确定)，其可用于某些应用如偏振化的荧光共轭物，或定向混合纳米颗粒组装。

在另一个情况中，发色聚合物混合纳米颗粒包含超过一个具有3个亲水性官能团(例如，R¹、R²和R³)的聚合物分子。这种发色聚合物混合纳米颗粒是三价单分子混合纳米颗粒，其可提供独特的性质，如单分尺寸和均匀荧光亮度。这三个官能团共价连接发色聚合物的主链、侧链和/或末端单元。这三个官能团(例如，R¹、R²和R³)是相同的，或者它们是不同的。官能团任意以下基团，如羧酸或其盐、氨基、巯基、叠氮基、炔、膦、环辛炔、醛、羟基、羰基、硫酸盐、磺酸盐、磷酸盐、氰酸盐、酯、琥珀酰亚胺酯、其取代的衍生物、及其任意组合。通常，使用允许生物共轭的任何其他官能团。本领域的普通技术人员可在例如BioconjugateTechniques(《生物共轭技术》)(学术出版社(AcademicPress)，纽约，1996年或之后的版本)中找到这类官能团，其内容通过引用全文纳入本文用于所有目的。这种单分子混合纳米颗粒是三价的，但是具有充分控制的官能团(由主链分支数量所确定)，其可用于某些应用如偏振化的荧光共轭物，或定向混合纳米颗粒组装。

在一些方面中，发色偏振敏感纳米颗粒可包括具有4个官能团、或5个官能团、或6个官能团、或更多官能团的一个聚合物。这种发色聚合物混合纳米颗粒是多价单分子混合纳米颗粒，其可提供独特的性质，如单分尺寸、均匀荧光亮度或生物共轭能力。这些官能团共价连接发色聚合物的主链、侧链和/或末端单元。在某些方面中，发色聚合物混合纳米颗粒包含四臂分支聚合物、五臂分支聚合物、六臂分支聚合物等的单分子，其中各臂含有一个官能团。官能团任意以下基团，如羧酸或其盐、氨基、巯基、叠氮基、炔、膦、环辛炔、醛、羟基、羰基、硫酸盐、磺酸盐、磷酸盐、氰酸盐、酯、琥珀酰亚胺酯、其取代的衍生物、及其任意组合。通常，使用适用于生物共轭的任何其他官能团。本领域的普通技术人员可在例如BioconjugateTechniques(《生物共轭技术》)(学术出版社(AcademicPress)，纽约，1996年或之后的版本)中找到这类官能团，其内容通过引用全文纳入本文用于所有目的。官能团是相同的，或者它们是不同的。这种单分子混合纳米颗粒是多价的，但是具有充分控制的官能团(由主链分支数量所预确定)，其可用于某些应用如偏振化的荧光共轭物，或定向混合纳米颗粒组装，或生物共轭。

在一些方面中，发色偏振敏感纳米颗粒可包括超过一个具有4个官能团、或5个官能团、或6个官能团、或更多官能团的聚合物。这种发色聚合物混合纳米颗粒是多价单分子混合纳米颗粒，其可提供独特的性质，如单分尺寸、均匀荧光亮度或生物共轭能力。这些官能团共价连接发色聚合物的主链、侧链和/或末端单元。在某些方面中，发色聚合物混合纳米颗粒包含四臂分支聚合物、五臂分支聚合物、六臂分支聚合物等的单分子，其中各臂含有一个官能团。官能团任意以下基团，如羧酸或其盐、氨基、巯基、叠氮基、炔、膦、环辛炔、醛、羟基、羰基、硫酸盐、磺酸盐、磷酸盐、氰酸盐、酯、琥珀酰亚胺酯、其取代的衍生物、及其任意组合。通常，使用适用于生物共轭的任何其他官能团。本领域的普通技术人员可在例如BioconjugateTechniques(《生物共轭技术》)(学术出版社(AcademicPress)，纽约，1996年或之后的版本)中找到这类官能团，其内容通过引用全文纳入本文用于所有目的。官能团是相同的，或者它们是不同的。这种单分子混合纳米颗粒是多价的，但是具有充分控制的官能团(由主链分支数量所预确定)，其可用于某些应用如偏振化的荧光共轭物，或定向混合纳米颗粒组装，或生物共轭。

在一些方面中，发色偏振敏感纳米颗粒可包括官能化的多分子发色聚合物混合纳米颗粒，其经修饰以形成单价混合纳米颗粒。通过使用含有官能团(如PDHF-COOH)的发色聚合物分子来制备官能化发色混合纳米颗粒。这些官能团共价连接发色聚合物的主链、侧链和/或末端单元。或者，发色聚合物混合纳米颗粒通过官能化试剂官能化。官能化试剂和方法是已知的，例如，参见美国临时专利申请系列号61/259,611，其内容通过引用全文纳入本文用于所有目的。官能团任意以下基团，如羧酸或其盐、氨基、巯基、叠氮基、炔、膦、环辛炔、醛、羟基、羰基、硫酸盐、磺酸盐、磷酸盐、氰酸盐、酯、琥珀酰亚胺酯、其取代的衍生物、及其任意组合。通常，使用适用于生物共轭的任何其他官能团。本领域的普通技术人员可在例如BioconjugateTechniques(《生物共轭技术》)(学术出版社(AcademicPress)，纽约，1996年或之后的版本)中找到这类官能团，其内容通过引用全文纳入本文用于所有目的。

混合纳米颗粒的生物共轭物

在一些方面中，本发明提供了可包含上述的官能化发色聚合物混合纳米颗粒和生物分子的生物共轭物，其中该生物分子通过官能团直接或间接接合至聚合物混合纳米颗粒。该生物共轭物也可包括上述的官能化发色偏振敏感纳米颗粒，其与生物颗粒如病毒、细菌、细胞、生物或合成囊泡如脂质体结合。这些官能化发色偏振敏感纳米颗粒可包括一种或多种官能团，其形成自具有一个或两个末端官能团或低密度侧链官能团的发色聚合物。

在某些实施方式中，本发明提供了可包含上述的单价发色聚合物混合纳米颗粒和生物分子的生物共轭物，其中该生物分子通过官能团直接或间接接合至聚合物混合纳米颗粒。该生物共轭物也包括上述的单价发色聚合物混合纳米颗粒，其与生物颗粒如病毒、细菌、细胞、生物或合成囊泡如脂质体结合。术语“生物分子”用于描述合成的或天然产生的蛋白质、糖蛋白、肽、氨基酸、代谢物、药物、毒素、核酸、核苷酸、碳水化合物、糖、脂质、脂肪酸等。合乎需要地，生物分子通过共价键与单价发色聚合物混合纳米颗粒的官能团接合。例如，如果聚合物混合纳米颗粒的官能团是羧基，则蛋白质生物分子通过使该羧基与蛋白质分子的氨基交联来直接接合聚合物混合纳米颗粒。

本文所用术语“交联剂”用于描述以下化合物或部分，其能够在类似或不类似的分子上的分子基团之间形成化学键以将这些分子共价连接在一起。常见交联剂的示例是本领域已知的。参见，例如BioconjugateTechniques(《生物共轭技术》)(学术出版社(AcademicPress)，纽约，1996年或之后的版本)，其内容通过引用全文纳入本文用于所有目的。生物分子与单价发色偏振敏感纳米颗粒的间接接合可通过使用“接头”分子发生，例如，亲和素、链霉亲和素、中性亲和素、生物素或类似分子。

在多个实施方式中，本发明的偏振敏感纳米颗粒经生物共轭以促进蛋白质或肽的检测。在一些方面中，提供了使用与生物分子共轭的发色偏振敏感纳米颗粒的方法、组合物和试剂盒，例如，发色偏振敏感纳米颗粒的官能化，其中生物分子直接或间接通过官能团与发色聚合物混合纳米颗粒接合。

术语“生物分子”用于描述合成的或天然产生的蛋白质、糖蛋白、肽、氨基酸、代谢物、药物、毒素、核酸、核苷酸、碳水化合物、糖、脂质、脂肪酸等。与生物分子共轭的发色偏振敏感纳米颗粒在本文中有时称作“生物共轭物”。生物共轭物还可包括与生物颗粒(如病毒、细菌、细胞和天然产生的或合成的囊泡如脂质体)相连的官能化发色偏振敏感纳米颗粒。这些官能化发色偏振敏感纳米颗粒可包括一种或多种官能团，其形成自具有一个或两个末端官能团或低密度侧链官能团的发色聚合物。

在某些实施方式中，这些生物共轭物包含单价发色聚合物混合纳米颗粒和生物分子，该生物分子通过官能团直接或间接接合聚合物混合纳米颗粒。这些生物共轭物还可包含与生物颗粒(如病毒、细菌、细胞和天然产生的或合成的囊泡如脂质体)相连的单价发色偏振敏感纳米颗粒。

在本发明的一些方面中，该生物分子通过共价键接合单价发色聚合物混合纳米颗粒的官能团。例如，如果聚合物混合纳米颗粒的官能团是羧基，则蛋白质生物分子通过使该羧基与蛋白质分子的氨基交联直接接合至聚合物混合纳米颗粒。

在一些方面中，该聚合物与生物分子，例如肽、蛋白质、适体、抗体、酶、碳水化合物、核酸、脱氧核糖核酸、核糖核酸或脂质共轭。在一些方面中，发色聚合物混合纳米颗粒与小分子、药物、生物模拟物、药物化合物、同位素、放射性同位素或化学品共轭。在一些方面中，聚合物或混合纳米颗粒与链霉亲和素共轭。在一些方面中，聚合物或混合纳米颗粒与聚乙二醇(PEG)共轭。在一些方面中，聚合物或混合纳米颗粒与生物素共轭，或通过链霉亲和素间接连接生物素。在一些方面中，聚合物或混合纳米颗粒与标签共轭，例如血细胞凝集素(HA)、水泡性口炎病毒(VSV)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、组氨酸、超过一个组氨酸、六个组氨酸(6xHis)或c-myc。

在一些方面中，提供了使用与特异性结合靶标的生物分子共轭的偏振敏感纳米颗粒来分析目标分子(例如蛋白质)的方法、组合物和试剂盒。

在一些方面中，荧光发色偏振敏感纳米颗粒与一种或多种提供某项功能或其他益处(包括但不限于对目标分子的结合亲和力)的分子共轭。

在一些方面中，该目标分子是感兴趣的蛋白质，且与发色聚合物混合纳米颗粒共轭的生物分子是特异性结合该目标蛋白质的一抗。

在其他实施方式中，该目标分子是感兴趣的蛋白质，其连接所述蛋白质的一抗，且与发色聚合物混合纳米颗粒共轭的生物分子是特异性结合该一抗的二抗。

本文所用术语“生物素”指能够与亲和素有效结合的多种生物素衍生物和类似物中的任一种。合适的生物素部分包括能够通过亲和素和相关亲和素蛋白来分离生物素化肽片段的那些部分。代表性生物素部分包括生物素衍生物(如亚氨基生物素、生物胞素和己酰基氨基生物素)和生物素类似物(如脱硫生物素和生物素砜)。

本文所用术语“亲和素”指结合生物素的不同于免疫球蛋白的任何生物素结合蛋白，包括天然蛋白质以及重组和遗传工程改造的蛋白质。该术语包括两种常见的生物素结合蛋白，称为“蛋白”或“禽”亲和素和“链霉亲和素”。蛋白或禽亲和素，通常简称为亲和素，是一种蛋白质，其是蛋白的组分且与生物素形成非共价复合物。链霉亲和素是一种亲和素蛋白，其分离自放线菌链霉菌(Streptomycesavidinii)且也与生物素形成非共价复合物。生物素结合蛋白的其他细菌来源也是已知的。蛋白亲和素和链霉亲和素都是四聚体蛋白质，其中生物素结合位点成对排列在亲和素分子的相对面上。该术语还指亲和素衍生物，包括琥珀酰亲和素、铁蛋白亲和素、酶亲和素和交联亲和素。

在一些方面中，荧光发色偏振敏感纳米颗粒与一种或多种改变发色偏振敏感纳米颗粒的其他性质(例如其尺寸、荧光、疏水性、非特异性结合或吸收性质等)的分子共轭。

在一些方面中，生物分子与发色偏振敏感纳米颗粒的共轭可包括官能团的接合，包括但不限于羧基基团与发色偏振敏感纳米颗粒的接合。在一些方面中，羧基基团在碳二亚胺(如盐酸1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺(EDC))存在时与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)反应以生成羧酸根/羧酸酯基团的氨基反应性酯(amine-reactiveester)用于与某些生物分子上存在的伯胺基团交联。

在一些方面中，通过混合发色偏振敏感纳米颗粒与生物分子使羧化发色偏振敏感纳米颗粒与生物分子(如蛋白质)共轭，例如在含有0.1％PEG(MW3350)的HEPES缓冲液(20mM，pH＝7.4)中。发色偏振敏感纳米颗粒上羧基与生物分子上氨基之间肽键的形成由EDC催化。然而，由于发色偏振敏感纳米颗粒的内在疏水本质，生物分子倾向于非特异性吸附在颗粒表面上。在一些方面中，可导入曲通X-100和/或牛血清白蛋白(BSA)以减少生物分子在发色聚合物混合纳米颗粒表面上的非特异性吸附。

在一些方面中，聚合物混合纳米颗粒与多种标记物中的一种或多种共轭。例如，该聚合物混合纳米颗粒与标记试剂共轭，例如荧光标记物(如荧光染料)。在某些实施方式中，该荧光标记物可具有特定应用所需的发射性质。例如，该荧光标记物是具有以下发射波长最大值的荧光染料：500nm至1100nm、600nm至1000nm、600nm至800nm、650nm至850nm，或700nm至800nm。对于另一个实施例，荧光标记物是具有以下发射波长最大值的荧光染料：约500nm至约1100nm、约600nm至约1000nm、约600nm至约800nm、约650nm至约850nm，或约700nm至约800nm。本领域技术人员应理解，多种染料用作可检测标记物并具有上述发射性质。

可用作本发明的共轭分子的荧光染料的非限制性示例包括：若丹明、罗多尔(rhodol)、荧光素、硫代荧光素、氨基荧光素、羧基荧光素、氯代荧光素、甲基荧光素、磺基荧光素、氨基罗多尔、羧基罗多尔、氯代罗多尔、甲基罗多尔、磺基罗多尔；氨基若丹明、羧基若丹明、氯代若丹明、甲基若丹明、磺基若丹明，和硫代若丹明，花青、吲哚羰花青、噁羰花青、硫羰花青、部花青、花青染料(如花青2、花青3、花青3.5、花青5、花青5.5、花青7)、噁二唑衍生物、吡啶基噁唑、硝基苯并噁二唑、苯并噁二唑、芘衍生物、级联蓝(cascadeblue)、噁嗪衍生物、尼罗红、尼罗蓝、甲酚紫、噁嗪170、吖啶衍生物、二氨基吖啶、吖啶橙、吖啶黄、芳基甲川衍生物、呫吨染料、磺化呫吨染料、AlexaFluor(如AlexaFluor594、AlexaFluor633、AlexaFluor647、AlexaFluor700)、金胺、结晶紫、孔雀石绿、四吡咯衍生物、卟吩、酞菁，和胆红素。在一些方面中，这些染料是近红外染料，包括，例如，Cy5.5、IRdye800、DyLight750或吲哚菁绿(ICG)。在一些方面中，近红外染料可包括花青染料(如花青2、花青3、花青3.5、花青5、花青5.5、花青7)。在某些实施方式中，该可检测标记物可包括呫吨染料或磺化呫吨染料，例如AlexaFluor(如AlexaFluor594、AlexaFluor633、AlexaFluor647、AlexaFluor700)。

在一些方面中，偏振敏感纳米颗粒与肽共轭，在多个方面中，该肽可与可检测标记物共轭。这些可检测标记物是荧光标记物(如荧光染料)。在某些实施方式中，该荧光标记物可具有特定应用所需的发射性质。例如，该荧光标记物是具有以下发射波长最大值的荧光染料：500nm至1100nm、600nm至1000nm、600nm至800nm、650nm至850nm，或700nm至800nm。对于另一个实施例，荧光标记物是具有以下发射波长最大值的荧光染料：约500nm至约1100nm、约600nm至约1000nm、约600nm至约800nm、约650nm至约850nm，或约700nm至约800nm。本领域技术人员应理解，多种染料用作可检测标记物并具有上述发射性质。

可用作本发明的共轭分子的荧光染料的非限制性示例包括：若丹明、罗多尔(rhodol)、荧光素、硫代荧光素、氨基荧光素、羧基荧光素、氯代荧光素、甲基荧光素、磺基荧光素、氨基罗多尔、羧基罗多尔、氯代罗多尔、甲基罗多尔、磺基罗多尔；氨基若丹明、羧基若丹明、氯代若丹明、甲基若丹明、磺基若丹明，和硫代若丹明，花青、吲哚羰花青、噁羰花青、硫羰花青、部花青、花青染料(如花青2、花青3、花青3.5、花青5、花青5.5、花青7)、噁二唑衍生物、吡啶基噁唑、硝基苯并噁二唑、苯并噁二唑、芘衍生物、级联蓝(cascadeblue)、噁嗪衍生物、尼罗红、尼罗蓝、甲酚紫、噁嗪170、吖啶衍生物、二氨基吖啶、吖啶橙、吖啶黄、芳基甲川衍生物、呫吨染料、磺化呫吨染料、AlexaFluor(如AlexaFluor594、AlexaFluor633、AlexaFluor647、AlexaFluor700)、金胺、结晶紫、孔雀石绿、四吡咯衍生物、卟吩、酞菁，和胆红素。在一些方面中，这些染料是近红外染料，包括，例如，Cy5.5、IRdye800、DyLight750或吲哚菁绿(ICG)。在一些方面中，近红外染料可包括花青染料(如花青2、花青3、花青3.5、花青5、花青5.5、花青7)。在某些实施方式中，该可检测标记物可包括呫吨染料或磺化呫吨染料，例如AlexaFluor(如AlexaFluor594、AlexaFluor633、AlexaFluor647、AlexaFluor700)。如果可以找到针对染料的抗体，则共轭的染料可用作追踪、检测或观察标志物和用作检索把手(retrievalhandle)。

本发明的文库中的肽与生物素共轭。除了延长半衰期外，生物素还可作为亲和把手(affinityhandle)以从组织或其他位置中检索肽。在一个情况中，这些肽通过PEG接头与例如生物素酶耐受的生物素(例如NHS-dPEG4-生物素酶耐受的生物素)共轭。在一些方面中，使用可用作检测标记物和亲和把手的荧光生物素共轭物。市售可得的荧光生物素共轭物的非限制性示例包括：Atto425-生物素、Atto488-生物素、Atto520-生物素、Atto-550生物素、Atto565-生物素、Atto590-生物素、Atto610-生物素、Atto620-生物素、Atto655-生物素、Atto680-生物素、Atto700-生物素、Atto725-生物素、Atto740-生物素、荧光素生物素、生物素-4-荧光素、生物素-(5-荧光素)共轭物，和生物素-B-藻红蛋白、alexafluor488生物胞素、alexaflour546、alexafluor549、萤光黄尸胺生物素-X、萤光黄生物胞素、Oregon绿488生物胞素、生物素-若丹明和四甲基若丹明生物胞素。在一些其他实施例中，这些共轭物可包括化学发光化合物、胶体金属、发光化合物、酶、放射性同位素和顺磁性标记物。

除了本文所述实施例外，在一些方面中使用其他策略和方法以共轭生物分子和发色偏振敏感纳米颗粒，例如参见WO2011/057295和WO2013/101902。本领域的普通技术人员可在例如BioconjugateTechniques(《生物共轭技术》)(学术出版社(AcademicPress)，纽约，1996年或之后的版本)中找到用于共轭生物分子和发色偏振敏感纳米颗粒的其他策略和方法。

制备混合纳米颗粒的方法

本发明使用的发色偏振敏感纳米颗粒通过塌缩聚合物领域的任何已知方法形成，包括但不限于，依赖沉淀的方法、依赖乳液(如细乳液或微乳液)形成的方法和依赖缩聚的方法。

如本文所述，使用多种方法制备发色偏振敏感纳米颗粒。例如，本文所述的是包括沉淀聚合物以形成偏振敏感纳米颗粒的方法。将理解形成偏振敏感纳米颗粒的各种方式，其也可包括，例如，基于乳液的技术。类似地，本领域普通技术人员将理解本文所述的多种方法，对于通过例如用官能团，如疏水性官能团、亲水性官能团或其组合预官能化或后官能化来官能化偏振敏感纳米颗粒。

在一些方面中，通过沉淀形成发色偏振敏感纳米颗粒。该技术涉及将发色聚合物稀溶液(例如将发色聚合物溶解在有机溶剂中)快速加入(例如辅以声波处理或剧烈搅拌)过量的非溶剂介质(但与有机溶剂混溶)如水或另一种生理水溶液中。例如，在一些本发明所述方法中，先将疏水性发色聚合物溶解在溶解能力良好的有机溶剂(良溶剂)如THF(四氢呋喃)中，然后将溶解在THF中的聚合物加入过量的水或缓冲液中，水或缓冲液是疏水性发色聚合物的不良溶剂，但与良溶剂(THF)混溶。对所得混合物进行超声或剧烈搅拌以帮助形成发色偏振敏感纳米颗粒，随后除去有机溶剂以留下充分分散的发色混合纳米颗粒。在使用此程序时，发色聚合物应具有足够的疏水性，以便溶解在有机溶剂(例如THF)中。在侧链上导入高密度的亲水性官能团以与生物分子或高密度亲水性侧链共轭将使所得聚合物以与聚电解质的性质类似或相同的方式在有机溶剂(例如THF)中不溶或溶解性较差。

在一些方面中，掺混的聚合物的溶液混合到THF溶液中并且快速注射到水中，在多个方面中，使用高超声功率来沉淀混合纳米颗粒。在多个方面中，任意疏水性聚合物，例如半导体聚合物如PFBT在混合纳米颗粒的芯中是分离的。使用热和通过鼓泡过程加入氮气的组合来从混合纳米颗粒中去除THF。

在一些方面中，提供了使用发色偏振敏感纳米颗粒的方法、组合物和试剂盒，这些发色聚合物点采用其他的方法形成，包括但不限于各种基于乳液(例如细乳液或微乳液)或沉淀或浓缩的方法。使用具有疏水性官能团的其他聚合物，其中这些疏水性官能团不影响发色聚合物混合纳米颗粒的塌缩和稳定性。混合纳米颗粒表面上的疏水性官能团随后可转化为亲水性官能团(例如通过后官能化)用于生物共轭或将疏水性官能团直接连接至生物分子。若使用既疏水又可点击(即包括在点击化学框架内的化学反应)的官能团，包括但不限于炔、张力炔、叠氮化物、二烯、烯烃、环辛炔和膦基团，则后一种方法可能特别奏效。

在一种情况中，本发明提供了一种制备随机官能化的单链发色混合纳米颗粒的方法，所述纳米颗粒在其表面上具有确定数量的反应性官能团，所述方法包括以下步骤：(a)在水性环境中塌缩与一个或多个反应性官能团共轭的半导体聚合物均一群以形成包含多个反应性官能团的发色混合纳米颗粒；(b)通过形成混合纳米颗粒上的反应性官能团和固体相之间的共价键来在单个点处将混合纳米颗粒接合至固体相；(c)洗涤有机溶剂中的混合纳米颗粒以破坏混合纳米颗粒的结构并仅保留与固体表面共轭的聚合物；(d)洗涤接合的表面回到水性环境中以将聚合物塌缩成单链发色混合纳米颗粒；和(e)切割固体相和反应性官能团之间的键以从固体相上释放单链发色混合纳米颗粒。在一些方面中，切割键的步骤在混合纳米颗粒的表面上保留反应性官能团。在某些实施方式中，切割键的步骤修饰了反应性官能团，在混合纳米颗粒的表面上生成不同的反应性官能团。

在另一个情况中，本发明提供了一种制备在其表面上具有单个反应性官能团的单价发色混合纳米颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在水性环境中将与一个或多个反应性官能团共轭的半导体聚合物塌缩以形成包含多个反应性官能团的发色混合纳米颗粒；(b)通过在混合纳米颗粒上的反应性官能团与固体相之间形成共价键来在单个点处将混合纳米颗粒接合至固体相；(c)处理混合纳米颗粒以从混合纳米颗粒组上去除所有未结合的反应性官能团；和(d)切割固体相和反应性官能团之间的键以从固体相上释放发色混合纳米颗粒。在一些方面中，切割键的步骤在混合纳米颗粒的表面上保留反应性官能团。在某些实施方式中，切割键的步骤修饰了反应性官能团，在混合纳米颗粒的表面上生成不同的反应性官能团。

对于单个聚合物分子，可用例如低聚合物浓度来促进塌缩成单聚合物混合纳米颗粒，其中聚合物在空间上分布在溶液中，使得仅发生分子内塌缩，而不是与另一个聚合物分子的分子间塌缩。单个聚合物混合纳米颗粒的稀释溶液形成的范围可以是低于约1000ppm、低于约500ppm、低于约100ppm、低于约50ppm、低于约20ppm、低于约10ppm、低于约5ppm、低于约1ppm，或更低。本发明的方法的示例第一步骤是合成含有官能团的发色聚合物分子，如羧酸或其盐、氨基、巯基、叠氮基、炔、膦、环辛炔、醛、羟基、羰基、硫酸盐、磺酸盐、磷酸盐、氰酸盐、酯、琥珀酰亚胺酯、其取代的衍生物、及其组合。通常，使用允许生物共轭的任何其他官能团。本领域的普通技术人员可在例如BioconjugateTechniques(《生物共轭技术》)(学术出版社(AcademicPress)，纽约，1996年或之后的版本)中找到这类官能团，其内容通过引用全文纳入本文用于所有目的。可通过与发色聚合物的主链、侧链或末端单元成键来产生官能团。在第二步骤中，官能化的发色聚合物用作用于通过使用实施例1所示的溶剂混合方法制备单分子混合纳米颗粒的前体。在一个情况中，当各聚合物前体分子只有一个官能团时，单分子混合纳米颗粒可以是单价的(例如，仅带一个可用于生物共轭的官能团)。在其他实施方式中，当各聚合物前体分子具有2个或更多个可用于某些应用的官能团时，单分子混合纳米颗粒可能是二价的，或多价的。

在一些方面中，可修饰任意官能化的多分子发色聚合物混合纳米颗粒以形成单价、二价或多价的单分子聚合物混合纳米颗粒。该修饰旨在从混合纳米颗粒中除去一些聚合物分子，但仅留下一个分子，其可只具有一个官能团、两个或更多个官能团。在一个情况中，工程改造的表面可用于促进修饰。经工程改造的表面可具有某些官能团，如羧酸或其盐、氨基、巯基、叠氮基、炔、膦、环辛炔、醛、羟基、羰基、硫酸盐、磺酸盐、磷酸盐、氰酸盐、酯、琥珀酰亚胺酯、其取代的衍生物、及其组合。通常，使用适用于生物共轭的任何其他官能团。本领域的普通技术人员可在例如BioconjugateTechniques(《生物共轭技术》)(学术出版社(AcademicPress)，纽约，1996年或之后的版本)中找到这类官能团，其内容通过引用全文纳入本文用于所有目的。该表面可以是平坦的表面(如盖玻片)或者来自任何颗粒的弯曲的表面。这些表面是二氧化硅、金属、半导体、硅和不同聚合物表面。上文所述官能化多分子发色聚合物混合纳米颗粒经由任何稳定的物理或化学结合仅通过一个发色聚合物分子接合至表面。发色聚合物混合纳米颗粒中的所有游离分子都移除(与表面相连的分子除外)，例如通过使用有机溶剂清洗表面，从而仅保留一个分子与表面相连。随后可通过任何物理或化学方法从表面上释放单分子发色混合纳米颗粒。所得单分子混合纳米颗粒可以是单价、二价或多价，这取决于原始聚合物分子中官能团的数目。聚合物内或表面上的官能团包括但不限于用于点击化学的那些，如炔、张力炔、叠氮化物、二烯、烯烃、环辛炔和膦基团。

在一些方面中，通过修饰任意官能化的多价发色偏振敏感纳米颗粒至单价混合纳米颗粒来制备单价发色偏振敏感纳米颗粒。原始官能化多价聚合物混合纳米颗粒可包含一个或多个发色聚合物分子。原始官能化的聚合物纳米颗粒也可包含发色聚合物，其与其他组分(包括，例如荧光染料、无机发光材料、磁性材料、金属材料)物理混合或化学交联，其具有额外的功能(如磁性功能、等离振子共振功能等)。

这种情况包括2-步骤过程：第一步骤是制备含有官能团的官能化的发色偏振敏感纳米颗粒，如羧酸或其盐、氨基、巯基、叠氮基、炔、膦、环辛炔、醛、羟基、羰基、硫酸盐、磺酸盐、磷酸盐、氰酸盐、酯、琥珀酰亚胺酯、其取代的衍生物、及其组合。通常，使用允许生物共轭的任何其他官能团。本领域的普通技术人员可在例如BioconjugateTechniques(《生物共轭技术》)(学术出版社(AcademicPress)，纽约，1996年或之后的版本)中找到这类官能团，其内容通过引用全文纳入本文用于所有目的。通过将任意有机分子，如通过任意稳定物理或化学结合接合至发色偏振敏感纳米颗粒来官能化发色偏振敏感纳米颗粒。官能化分子通过物理结合或化学成键来接合至发色偏振敏感纳米颗粒，并且在发色聚合物混合分子上提供表面官能团。优选地，官能化分子是聚合物，其可以发色或不发色。制备官能化多价混合纳米颗粒的方法是已知的，例如，参见美国临时专利申请系列号61/259,611，其内容通过引用全文纳入本文用于所有目的。

第二步骤是将官能化的多价发色聚合物混合纳米颗粒修饰成单价聚合物混合纳米颗粒。修饰是为了钝化或去除大多数官能团，但是仅留下一个活性官能团。在一个情况中，经工程改造的表面可用于促进修饰。经工程改造的表面可具有某些官能团，如羧酸或其盐、氨基、巯基、叠氮基、炔、膦、环辛炔、醛、羟基、羰基、硫酸盐、磺酸盐、磷酸盐、氰酸盐、酯、琥珀酰亚胺酯、其取代的衍生物、及其组合。该表面可以是平坦的表面(如盖玻片)或者来自任何颗粒的弯曲的表面。这些表面是二氧化硅、金属、半导体、硅和不同聚合物表面。经工程改造的表面可以是平坦的表面(如盖玻片)或者来自任何颗粒的弯曲的表面。在一些情况中，偏振敏感纳米颗粒通过点击化学接合至表面。聚合物分子内或表面上的官能团包括但不限于用于点击化学的那些，如炔、张力炔、叠氮化物、二烯、烯烃、环辛炔和膦基团。在表面钝化之后切割PFBT混合纳米颗粒以形成单价混合纳米颗粒。上文所述原始官能化多分子发色混合纳米颗粒经由任何稳定的物理或化学结合仅通过一个官能团接合至表面。发色混合纳米颗粒上的所有三个官能团(除了与表面连接的一个以外)经钝化或去除。然后，可通过物理或化学方法从表面上释放发色混合纳米颗粒并且经修饰的发色混合纳米颗粒将仅具有一个官能团，其可以是原始的或不同的。

如没有临时专利申请系列号61/259,611中所示，在一种情况中，官能化的混合纳米颗粒可含有基于聚苯乙烯的梳状聚合物。基于聚苯乙烯的梳状聚合物的非限制性示例包括，聚苯乙烯枝接丙烯酸、羧基官能化的聚苯乙烯枝接环氧乙烷、胺官能化的聚苯乙烯枝接环氧乙烷、巯基官能化的聚苯乙烯枝接环氧乙烷、琥珀酰亚胺基酯官能化的聚苯乙烯枝接环氧乙烷、叠氮化物官能化的聚苯乙烯枝接环氧乙烷、炔官能化的聚苯乙烯枝接环氧乙烷、环辛炔官能化的聚苯乙烯枝接环氧乙烷、酯官能化的聚苯乙烯枝接环氧乙烷、膦、聚苯乙烯枝接丁醇等。

在另一个情况中，官能化的混合纳米颗粒可含有基于聚(甲基丙烯酸甲酯)的梳状聚合物。基于聚(甲基丙烯酸甲酯)的梳状聚合物的非限制性示例包括，聚(甲基丙烯酸甲酯)枝接丙烯酸、羧基官能化的聚(甲基丙烯酸甲酯)枝接环氧乙烷、胺官能化的聚(甲基丙烯酸甲酯)枝接环氧乙烷、巯基官能化的聚(甲基丙烯酸甲酯)枝接环氧乙烷、琥珀酰亚胺基酯官能化的聚(甲基丙烯酸甲酯)枝接环氧乙烷、叠氮化物官能化的聚(甲基丙烯酸甲酯)枝接环氧乙烷、炔官能化的聚(甲基丙烯酸甲酯)枝接环氧乙烷、环辛炔官能化的聚(甲基丙烯酸甲酯)枝接环氧乙烷、酯官能化的聚(甲基丙烯酸甲酯)枝接环氧乙烷、膦官能化的聚(甲基丙烯酸甲酯)枝接环氧乙烷等。

在另一个情况中，官能化的混合纳米颗粒可含有梳状聚合物，该聚合物包含羧基、氨基、巯基、酯、琥珀酰酯、叠氮化物、炔、环辛炔或膦基团。

类似地，在一个情况中，官能化的混合纳米颗粒可含有在末端单体单元上官能化的聚合物，例如使用羧基、氨基、巯基、酯、琥珀酰酯、叠氮化物、炔、环辛炔、膦或类似官能团。使用的聚合物的示例包括但不限于：聚(甲基)丙烯酸酯聚合物、聚丙烯酰胺聚合物、聚异丁烯、聚二烯、聚亚苯基、聚乙烯、聚乙二醇、聚丙交酯、聚苯乙烯、聚硅氧烷、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚氨酯，其嵌段共聚物，其随机或交替共聚物，等。

虽然本发明提供了形成包含半导体聚合物、非半导体聚合物、本文所述的各种重量、比率和参数的半导体聚合物的掺混物的混合纳米颗粒，但是示例性混合纳米颗粒可包含除半导体聚合物如PFBT以外的2种基质聚合物、P70和PS-PEG-COOH。在一些方面中，具有2种基质聚合物的混合纳米颗粒可产生具有对激发聚合和高偏振化的发射有高敏感性的小混合纳米颗粒，2种基质聚合物都是两性聚合物。

混合纳米颗粒的特征

本发明的混合纳米颗粒了可具有任意数量的特征。本文所述的特征并不是对混合纳米颗粒可能具有的潜在特征的限制。混合纳米颗粒的特征包括形状、溶解性、临界尺寸、质量、质量比率、各向异性、量子产率、吸收、发射、猝灭、亮度等。

本发明的混合纳米颗粒，或其片段或化学前体可溶于或不溶于各种溶剂中。溶剂类型包括，例如，极性溶剂、非极性溶剂、水性溶剂、非水性溶剂、离子液体、有机溶剂和聚合溶剂。溶剂的非限制性示例包括：水；四氢呋喃(THF)；吗啉；N-甲基吗啉；甲醇(MeOH)；乙醇(EtOH)；丙醇(PrOH)；异丙醇(iPrOH)；叔丁醇(tBuOH)；乙酸(AcOH)；乙二醇；丙二醇；乙酸甲酯(MeOAc)；乙酸乙酯(EtOAc)；乙醚(Et₂O)；甲基-叔丁基醚(MTBE)；二甲氧基乙烷(DME)；甘醇二甲醚；二甘醇二甲醚；四甘醇二甲醚；二氯甲烷(CH₂Cl₂)；氯仿(CHCl₃)；四氯化碳(CCl₄)；1，1-二氯乙烷(CHCl₂CH₃)；1，2-二氯乙烷(CH₂ClCH₂Cl)；二硫化碳(CS₂)；二甲亚砜(DMSO)；二甲基甲酰胺(DMF)；丙酮(MeAc)；2-丁酮(EtAc)；戊烷；己烷；己烷；环己烷；苯；甲苯；二甲苯；二甲苯和吡啶。

本发明的混合纳米颗粒或其片段或化学前体与聚乙二醇(PEG)基团物理结合或化学连接。PEG基团可包括，例如，约4、约6、约8、约10、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约150、约200、约250、约300、约350、约400、约450、约500、约550、约600、约650、约700、约750、约800、约850、约900、约950、约1000、约1250、约1500、约1750、约2000、约2250、约2500、约2750、约3000、约3250、约3500、约3750、约4000、约4250、约4500、约4750、或约5000个乙二醇亚基。用本文所述的任意取代基例如，羟基、巯基、卤素、氨基、硝基、亚硝基、氰基、叠氮基、亚砜基、砜基、磺酰胺基、羧基、甲醛基、亚胺基、烷基、卤素-烷基、烯基、卤素-烯基、炔基、卤素-炔基、烷氧基、芳基、芳氧基、芳烷基、芳基烷氧基、杂环基、酰基、酰氧基、碳酸酯基、氨基甲酸酯基、酰氨基、氨基甲酸酯基、和酯基修饰一个或多个乙二醇亚基。

本发明的混合纳米颗粒，或其片段或化学前体可具有至少一个临界尺寸。在一些方面中，所用发色聚合物混合纳米颗粒的临界尺寸是200nm或更小。在一些方面中，所用发色聚合物混合纳米颗粒的临界尺寸是180nm或更小。在一些方面中，该临界尺寸是170nm或更小。在一些方面中，该临界尺寸是160nm或更小。在一些方面中，该临界尺寸是150nm或更小。在一些方面中，该临界尺寸是155nm或更小。在一些方面中，该临界尺寸是150nm或更小。在一些方面中，该临界尺寸是145nm或更小。在一些方面中，该临界尺寸是140nm或更小。在一些方面中，该临界尺寸是135nm或更小。在一些方面中，该临界尺寸是130nm或更小。在一些方面中，该临界尺寸是125nm或更小。在一些方面中，该临界尺寸是120nm或更小。在一些方面中，该临界尺寸是115nm或更小。在一些方面中，该临界尺寸是110nm或更小。在一些方面中，该临界尺寸是105nm或更小。在一些方面中，该临界尺寸是100nm或更小。在一些方面中，该临界尺寸是95nm或更小。在一些方面中，该临界尺寸是90nm或更小。在一些方面中，该临界尺寸是85nm或更小。在一些方面中，该临界尺寸是80nm或更小。在一些方面中，该临界尺寸是75nm或更小。在一些方面中，该临界尺寸是70nm或更小。在一些方面中，该临界尺寸是65nm或更小。在一些方面中，该临界尺寸是60nm或更小。在一些方面中，该临界尺寸是55nm或更小。在一些方面中，该临界尺寸是50nm或更小。在一些方面中，该临界尺寸是45nm或更小。在一些方面中，该临界尺寸是40nm或更小。在一些方面中，该临界尺寸是35nm或更小。在一些方面中，该临界尺寸是30nm或更小。在一些方面中，该临界尺寸是25nm或更小。在一些方面中，该临界尺寸是20nm或更小。在一些方面中，该临界尺寸是15nm或更小。在一些方面中，该临界尺寸是10nm或更小。在一些方面中，该临界尺寸是5nm或更小。

在一些方面中，所用发色聚合物混合纳米颗粒的临界尺寸是200nm或更大。在一些方面中，所用发色聚合物混合纳米颗粒的临界尺寸是180nm或更大。在一些方面中，该临界尺寸是170nm或更大。在一些方面中，该临界尺寸是160nm或更大。在一些方面中，该临界尺寸是150nm或更大。在一些方面中，该临界尺寸是155nm或更大。在一些方面中，该临界尺寸是150nm或更大。在一些方面中，该临界尺寸是145nm或更大。在一些方面中，该临界尺寸是140nm或更大。在一些方面中，该临界尺寸是135nm或更大。在一些方面中，该临界尺寸是130nm或更大。在一些方面中，该临界尺寸是125nm或更大。在一些方面中，该临界尺寸是120nm或更大。在一些方面中，该临界尺寸是115nm或更大。在一些方面中，该临界尺寸是110nm或更大。在一些方面中，该临界尺寸是105nm或更大。在一些方面中，该临界尺寸是100nm或更大。在一些方面中，该临界尺寸是95nm或更大。在一些方面中，该临界尺寸是90nm或更大。在一些方面中，该临界尺寸是85nm或更大。在一些方面中，该临界尺寸是80nm或更大。在一些方面中，该临界尺寸是75nm或更大。在一些方面中，该临界尺寸是70nm或更大。在一些方面中，该临界尺寸是65nm或更大。在一些方面中，该临界尺寸是60nm或更大。在一些方面中，该临界尺寸是55nm或更大。在一些方面中，该临界尺寸是50nm或更大。在一些方面中，该临界尺寸是45nm或更大。在一些方面中，该临界尺寸是40nm或更大。在一些方面中，该临界尺寸是35nm或更大。在一些方面中，该临界尺寸是30nm或更大。在一些方面中，该临界尺寸是25nm或更大。在一些方面中，该临界尺寸是20nm或更大。在一些方面中，该临界尺寸是15nm或更大。在一些方面中，该临界尺寸是10nm或更大。在一些方面中，该临界尺寸是5nm或更大。

在一些方面中，所用发色聚合物混合纳米颗粒的临界尺寸是约200nm。在一些方面中，所用发色聚合物混合纳米颗粒的临界尺寸是约180nm。在一些方面中，该临界尺寸是约170nm。在一些方面中，该临界尺寸是约160nm。在一些方面中，该临界尺寸是约155nm。在一些方面中，该临界尺寸是约150nm。在一些方面中，该临界尺寸是约145nm。在一些方面中，该临界尺寸是约140nm。在一些方面中，该临界尺寸是约135nm。在一些方面中，该临界尺寸是约130nm。在一些方面中，该临界尺寸是约125nm。在一些方面中，该临界尺寸是约120nm。在一些方面中，该临界尺寸是约115nm。在一些方面中，该临界尺寸是约110nm。在一些方面中，该临界尺寸是约105nm。在一些方面中，该临界尺寸是约100nm。在一些方面中，该临界尺寸是约95nm。在一些方面中，该临界尺寸是约90nm。在一些情况中，该临界尺寸是约85nm。在一些方面中，该临界尺寸是约80nm。在一些方面中，该临界尺寸是约75nm。在一些方面中，该临界尺寸是约70nm。在一些方面中，该临界尺寸是约65nm。在一些方面中，该临界尺寸是约60nm。在一些方面中，该临界尺寸是约55nm。在一些方面中，该临界尺寸是约50nm。在一些方面中，该临界尺寸是约45nm。在一些方面中，该临界尺寸是约40nm。在一些方面中，该临界尺寸是约35nm。在一些方面中，该临界尺寸是约30nm。在一些方面中，该临界尺寸是约25nm。在一些方面中，该临界尺寸是约20nm。在一些方面中，该临界尺寸是约15nm。在一些方面中，该临界尺寸是约10nm。在一些方面中，该临界尺寸是约5nm。

在一些方面中，所用发色聚合物混合纳米颗粒的临界尺寸为大于1nm且小于1000nm。在一些方面中，所用发色聚合物混合纳米颗粒的临界尺寸为大于10nm且小于1000nm。在一些方面中，所用发色聚合物混合纳米颗粒的临界尺寸为大于20nm且小于1000nm。在一些方面中，所用发色聚合物混合纳米颗粒的临界尺寸为大于30nm且小于1000nm。在一些方面中，所用发色聚合物混合纳米颗粒的临界尺寸为大于40nm且小于1000nm。在一些方面中，所用发色聚合物混合纳米颗粒的临界尺寸为大于50nm且小于1000nm。在一些方面中，所用发色聚合物混合纳米颗粒的临界尺寸为大于1nm且小于100nm。在一些方面中，所用发色聚合物混合纳米颗粒的临界尺寸为大于1nm且小于90nm。在一些方面中，所用发色聚合物混合纳米颗粒的临界尺寸为大于1nm且小于80nm。在一些方面中，所用发色聚合物混合纳米颗粒的临界尺寸为大于1nm且小于70nm。在一些方面中，所用发色聚合物混合纳米颗粒的临界尺寸为大于1nm且小于60nm。在一些方面中，所用发色聚合物混合纳米颗粒的临界尺寸为大于1nm且小于50nm。在一些方面中，所用发色聚合物混合纳米颗粒的临界尺寸为大于1nm且小于40nm。在一些方面中，所用发色聚合物混合纳米颗粒的临界尺寸为大于1nm且小于30nm。在一些方面中，所用发色聚合物混合纳米颗粒的临界尺寸为大于1nm且小于20nm。在一些方面中，所用发色聚合物混合纳米颗粒的临界尺寸为大于1nm且小于10nm。

在一些方面中，所用发色聚合物混合纳米颗粒的临界尺寸为大于约1nm且小于约1000nm。在一些方面中，所用发色聚合物混合纳米颗粒的临界尺寸为大于约10nm且小于约1000nm。在一些方面中，所用发色聚合物混合纳米颗粒的临界尺寸为大于约20nm且小于约1000nm。在一些方面中，所用发色聚合物混合纳米颗粒的临界尺寸为大于约30nm且小于约1000nm。在一些方面中，所用发色聚合物混合纳米颗粒的临界尺寸为大于约40nm且小于约1000nm。在一些方面中，所用发色聚合物混合纳米颗粒的临界尺寸为大于约50nm且小于约1000nm。在一些方面中，所用发色聚合物混合纳米颗粒的临界尺寸为大于约1nm且小于约100nm。在一些方面中，所用发色聚合物混合纳米颗粒的临界尺寸为大于约1nm且小于约90nm。在一些方面中，所用发色聚合物混合纳米颗粒的临界尺寸为大于约1nm且小于约80nm。在一些方面中，所用发色聚合物混合纳米颗粒的临界尺寸为大于约1nm且小于约70nm。在一些方面中，所用发色聚合物混合纳米颗粒的临界尺寸为大于约1nm且小于约60nm。在一些方面中，所用发色聚合物混合纳米颗粒的临界尺寸为大于约1nm且小于约50nm。在一些方面中，所用发色聚合物混合纳米颗粒的临界尺寸为大于约1nm且小于约40nm。在一些方面中，所用发色聚合物混合纳米颗粒的临界尺寸为大于约1nm且小于约30nm。在一些方面中，所用发色聚合物混合纳米颗粒的临界尺寸为大于约1nm且小于约20nm。在一些方面中，所用发色聚合物混合纳米颗粒的临界尺寸为大于约1nm且小于约10nm。

该混合纳米颗粒的可能形状是基本不受限制的。然而，在某些实施方式中，该形状选自球形、圆柱形、椭圆形、多面体、棱镜形、杆状和线状。本领域技术人员应理解，混合纳米颗粒的形状可影响检测性质(例如，纳米杆的光学性质不同于纳米球)。

混合纳米颗粒的纳米级尺寸是必要的，从而绕过大颗粒尺寸带来的问题。例如，在将混合纳米颗粒接合至目标分子(如蛋白质)以进行光致发光成像时，相对大的颗粒具有较大的表面积用于与目标以外的分子非特异性结合，或使目标以外的分子吸收至表面。

对提供的混合纳米颗粒进行优化以用作接合至目标分子的光致发光报道物，作为分析方法、系统或试剂盒的一部分。这些混合纳米颗粒应能够使用光致发光容易地检测到并应对其目标分子具有特异性。

可通过改变给定发色聚合物混合纳米颗粒的组成和几何形状来调节其光学性质(如吸收波长)。已使用范围为UV至红外(包括整个可见光谱)的吸收波长来开发半导体聚合物。在一些方面中，使用具有以下峰吸收波长的发色偏振敏感纳米颗粒：200nm至300nm、250nm至350nm、300nm至400nm、350nm至450nm、400nm至500nm、450nm至550nm、500nm至600nm、550nm至650nm、600nm至700nm、650nm至750nm、700nm至800nm、750nm至850nm、800nm至900nm、850nm至950nm，或900nm至1000nm。

在其他实施方式中，所用发色偏振敏感纳米颗粒的峰值吸收波长为约200nm至约300nm、约250nm至约350nm、约300nm至约400nm、约350nm至约450nm、约400nm至约500nm、约450nm至约550nm、约500nm至约600nm、约550nm至约650nm、约600nm至约700nm、约650nm至约750nm、约700nm至约800nm、约750nm至约850nm、约800nm至约900nm、约850nm至约950nm，或约900nm至约1000nm。

已使用范围为UV至红外(包括整个可见光谱)的发射波长来开发半导体聚合物。在一些情况中，使用具有以下峰发射波长的发色偏振敏感纳米颗粒：200nm至300nm、250nm至350nm、300nm至400nm、350nm至450nm、400nm至500nm、450nm至550nm、500nm至600nm、550nm至650nm、600nm至700nm、650nm至750nm、700nm至800nm、750nm至850nm、800nm至900nm、850nm至950nm、900nm至1000nm、950nm至1050nm、1000nm至1100nm、1150nm至1250nm，或1200nm至1300nm。

在其他实施方式中，使用具有以下峰发射波长的发色偏振敏感纳米颗粒：约200nm至约300nm、约250nm至约350nm、约300nm至约400nm、约350nm至约450nm、约400nm至约500nm、约450nm至约550nm、约500nm至约600nm、约550nm至约650nm、约600nm至约700nm、约650nm至约750nm、约700nm至约800nm、约750nm至约850nm、约800nm至约900nm、约850nm至约950nm、约900nm至约1000nm、约950nm至约1050nm、约1000nm至约1100nm、约1150nm至约1250nm、或约1200nm至约1300nm。

在一些方面中，提供的方法、组合物和试剂盒将利用具有发射的发色偏振敏感纳米颗粒。发射对于某些应用是有利的，包括但不限于多重应用。偏振敏感纳米颗粒的发射波长可在紫外至近红外区域中变化。发射带的半宽度(FWHM)小于7.0nm。在一些方面中，该FWHM小于6.5nm。在一些方面中，该FWHM小于6.0nm。在一些方面中，该FWHM小于5.5nm。在一些方面中，该FWHM小于5.0nm。在一些方面中，该FWHM小于4.5nm。在一些方面中，该FWHM小于4.0nm。在一些方面中，该FWHM小于3.5nm。在一些方面中，该FWHM小于3.0nm。在一些方面中，该FWHM小于2.5nm。在一些方面中，该FWHM小于2.0nm。在一些方面中，该FWHM小于1.0nm。在一些方面中，本发明所述偏振敏感纳米颗粒的FWHM的范围可以是0.5nm至7.0nm、1.0nm至6.0nm、2.0nm至5.0nm，或3.0nm至4.5nm。

在其他实施方式中，提供的方法、组合物和试剂盒将利用发光的发色偏振敏感纳米颗粒，其对于某些应用是有优势的，包括但不限于多重应用。偏振敏感纳米颗粒的发射波长可在紫外至近红外区域中变化。发射带的半宽度(FWHM)小于7.0nm。在一些方面中，该FWHM小于约6.5nm。在一些方面中，该FWHM小于约6.0nm。在一些方面中，该FWHM小于约5.5nm。在一些方面中，该FWHM小于约5.0nm。在一些方面中，该FWHM小于约4.5nm。在一些方面中，该FWHM小于约4.0nm。在一些方面中，该FWHM小于约3.5nm。在一些方面中，该FWHM小于约3.0nm。在一些方面中，该FWHM小于约2.5nm。在一些方面中，该FWHM小于约2.0nm。在一些方面中，该FWHM小于约1.0nm。在一些方面中，本发明所述偏振敏感纳米颗粒的FWHM的范围可以是约0.5nm至约7.0nm、约1.0nm至约6.0nm、约2.0nm至约5.0nm，或约3.0nm至约4.5nm。

在一些方面中，FHWM可在官能化之后改变。在一个示例性情况中，FHWM在官能化之前是1.5nm并且在官能化之后是3.7nm。

在一些方面中，用于制备单体形式的发色偏振敏感纳米颗粒的发射聚合物包括硼-二吡咯亚甲基(4，4-二氟-4-硼-3a，4a-二氮杂-s-二环戊二烯并苯(indacene)，BODIPY)和或其衍生物，和/或其他含硼单体及其衍生物。BODIPY和其他含硼单体及其衍生物包括但不限于其烷基衍生物、芳基衍生物、炔衍生物、芳族衍生物、醇盐衍生物、氮杂衍生物、BODIPY扩展物和其他BODIPY衍生物。发射聚合物还可包括任何其他单体。BODIPY-基-单体是能量受体并且其他单体是能量供体，使得最终的发色偏振敏感纳米颗粒可显示发光。良好溶剂中的窄带发射发色聚合物可显示宽发射或窄发射。具有发射的发色偏振敏感纳米颗粒(包括BODIPY和其他含硼单体及其衍生物)的综合性描述参见WO2013/101902，其通过引用全文纳入本文。

在多个方面中，混合纳米颗粒是小的，例如，具有给定的直径和给定的宽度。在一些方面中，直径可以是平均直径，例如7.5nm。在其他实施方式中，平均直径可以是3nm、3.5nm、4nm、4.5nm、5nm、5.5nm、6nm、6.5nm、7nm、7.5nm、8nm、8.5nm、9nm、9.5nm或10nm。平均直径可以是约3nm、3.5nm、4nm、4.5nm、5nm、5.5nm、6nm、6.5nm、7nm、7.5nm、8nm、8.5nm、9nm、9.5nm或10nm。平均直径可以超过3nm、3.5nm、4nm、4.5nm、5nm、5.5nm、6nm、6.5nm、7nm、7.5nm、8nm、8.5nm、9nm、9.5nm或10nm。平均直径可以低于3nm、3.5nm、4nm、4.5nm、5nm、5.5nm、6nm、6.5nm、7nm、7.5nm、8nm、8.5nm、9nm、9.5nm或10nm。在一些方面中，宽度可以是峰宽度，例如1.5nm。在其他实施方式中，峰宽度可以是0.5nm、1nm、1.5nm、2nm、2.5nm、3nm、3.5nm、4nm、4.5nm或5nm。在其他实施方式中，峰宽度超过0.5nm、1nm、1.5nm、2nm、2.5nm、3nm、3.5nm、4nm、4.5nm或5nm。在其他实施方式中，峰宽度可以低于0.5nm、1nm、1.5nm、2nm、2.5nm、3nm、3.5nm、4nm、4.5nm或5nm。在其他实施方式中，峰宽度可以是约0.5nm、1nm、1.5nm、2nm、2.5nm、3nm、3.5nm、4nm、4.5nm或5nm。在多个方面中，直径和宽度可在官能化之前和之后变化。例如，在官能化之前，直径可以超过、低于或等于约3nm、3.5nm、4nm、4.5nm、5nm、5.5nm、6nm、6.5nm、7nm、7.5nm、8nm、8.5nm、9nm、9.5nm或10nm，而在官能化之后，直径可以超过、低于或等于约7nm、7.5nm、8nm、8.5nm、9nm、9.5nm、10nm、10.5nm、11nm、11.5nm、12nm、12.5nm、13nm、13.5nm、14.5nm或15nm。在一个示例性情况中，直径在官能化之前可以是7.5nm并且在官能化之后可以是12.0nm。

混合纳米颗粒可具有ζ电势，例如，其在不同缓冲液中变化。在一些方面中，混合纳米颗粒的ζ电势可以是低的，例如，在pH7.2的20mMHEPES缓冲液中-28mV。在其他实施方式中，ζ电势在各种pH的不同缓冲液中是-40mV、-39mV、-38mV、-37mV、-36mV、-35mV、-34mV、-33mV、-32mV、-31mV、-30mV、-29mV、-28mV、-27mV、-26mV、-25mV、-24mV、-23mV、-22mV、-21mV、-20mV、-19mV、-18mV、-17mV、-16mV、-15mV、-14mV、-13mV、-12mV、-11mV或-10mV。在其他实施方式中，ζ电势在各种pH的不同缓冲液中超过-40mV、-39mV、-38mV、-37mV、-36mV、-35mV、-34mV、-33mV、-32mV、-31mV、-30mV、-29mV、-28mV、-27mV、-26mV、-25mV、-24mV、-23mV、-22mV、-21mV、-20mV、-19mV、-18mV、-17mV、-16mV、-15mV、-14mV、-13mV、-12mV、-11mV或-10mV。在其他实施方式中，ζ电势在各种pH的不同缓冲液中低于-40mV、-39mV、-38mV、-37mV、-36mV、-35mV、-34mV、-33mV、-32mV、-31mV、-30mV、-29mV、-28mV、-27mV、-26mV、-25mV、-24mV、-23mV、-22mV、-21mV、-20mV、-19mV、-18mV、-17mV、-16mV、-15mV、-14mV、-13mV、-12mV、-11mV或-10mV。在其他实施方式中，ζ电势在各种pH的不同缓冲液中是约-40mV、-39mV、-38mV、-37mV、-36mV、-35mV、-34mV、-33mV、-32mV、-31mV、-30mV、-29mV、-28mV、-27mV、-26mV、-25mV、-24mV、-23mV、-22mV、-21mV、-20mV、-19mV、-18mV、-17mV、-16mV、-15mV、-14mV、-13mV、-12mV、-11mV或-10mV。

混合纳米颗粒可能具有给定的质量，其基于各混合纳米颗粒中聚合物的数量变化。在一些方面中，在一个示例性情况中，包含单一半导体聚合物的混合纳米颗粒可具有200kDa的质量。在其他实施方式中，混合纳米颗粒可具有500kDa、450kDa、400kDa、350kDa、300kDa、275kDa、250kDa、225kDa、200kDa、175kDa、150kDa、125kDa、100kDa、90kDa、80kDa、70kDa、60kDa、50kDa、40kDa、30kDa、20kDa、10kDa或5kDa的质量。在其他实施方式中，混合纳米颗粒可具有超过500kDa、450kDa、400kDa、350kDa、300kDa、275kDa、250kDa、225kDa、200kDa、175kDa、150kDa、125kDa、100kDa、90kDa、80kDa、70kDa、60kDa、50kDa、40kDa、30kDa、20kDa、10kDa或5kDa的质量。在其他实施方式中，混合纳米颗粒可具有低于500kDa、450kDa、400kDa、350kDa、300kDa、275kDa、250kDa、225kDa、200kDa、175kDa、150kDa、125kDa、100kDa、90kDa、80kDa、70kDa、60kDa、50kDa、40kDa、30kDa、20kDa、10kDa或5kDa的质量。在其他实施方式中，混合纳米颗粒可具有约500kDa、450kDa、400kDa、350kDa、300kDa、275kDa、250kDa、225kDa、200kDa、175kDa、150kDa、125kDa、100kDa、90kDa、80kDa、70kDa、60kDa、50kDa、40kDa、30kDa、20kDa、10kDa或5kDa的质量。

混合纳米颗粒可具有大的强度，取决于用于激发的光的偏振。在一些方面中，可使用λ/2波片来确定用于激发的光的偏振。例如，测量100∶1的I_||∶I_⊥激发偏振强度比率。在一些方面中，强度比率为90∶1、80∶1、70∶1、60∶1、50∶1、40∶1、30∶1、20∶1、10∶1或5∶1。例如，在一些方面中，混合纳米颗粒吸附到玻璃通道的表面上，澄清APTES-包被的玻璃通道。在多个方面中，例如，用水填充该通道。

在多个方面中，超过一种方法可与偏振确定联用。在一些方面中，一种方法可包括固定激发偏振同时可手动旋转聚合物混合纳米颗粒样品，例如使用旋转位移台(rotationstage)。在一些方面中，位移台旋转时在I_||和I_⊥通道中测量的发射强度是负相关的。在其他实施方式中，位移台旋转时在I_||和I_⊥通道中测量的发射强度是相关的。在其他实施方式中，位移台旋转时在I_||和I_⊥通道中测量的发射强度可能不是负相关的。在其他实施方式中，位移台旋转时在I_||和I_⊥通道中测量的发射强度是负相关的。在一些方面中，各聚合物混合纳米颗粒的发射偶极的取向是随机的。在另一个情况中，该方法可包括在激发路径中的旋转架置中放置λ/2波片。在这种情况中，可移动旋转架置同时使样品保持静止。

在某些方面中，该临界尺寸是20nm或更小。在其他方面中，临界尺寸是1nm至100nm、1nm至75nm、1nm至50nm、5nm至100nm、5nm至75nm、5nm至50nm、5nm至40nm、5nm至30nm、5nm至20nm、10nm至100nm、10nm至75nm、10nm至50nm、10nm至40nm、10nm至30nm、或10nm至20nm。在多个方面中，临界尺寸是流体动力学直径。

在一些方面中，使用纳米沉淀形成偏振敏感纳米颗粒。

在一些方面中，偏振敏感纳米颗粒是荧光的。在其他方面中，偏振敏感纳米颗粒能够在用偏振化的光照射时发射偏振化的光。

在多个方面中，偏振敏感纳米颗粒是荧光各向异性的。在一些方面中，偏振敏感纳米颗粒的荧光各向异性是0.01至1.00、0.01至0.90、0.01至0.80、0.01至0.07、0.02至1.00、0.02至0.90、0.02至0.80、0.02至0.70、0.03至1.00、0.03至0.90、0.03至0.80、0.03至0.70、0.05至1.00、0.05至0.90、0.05至0.80、0.05至0.70、0.10至1.00、0.10至0.90、0.10至0.80、0.10至0.70、0.20至1.00、0.20至0.90、0.20至0.80、0.20至0.70、0.50至1.00、0.50至0.90、0.50至0.80、0.50至0.70、0.60至1.00、0.60至0.90、0.60至0.80、或0.60至0.70。

在一些方面中，偏振敏感纳米颗粒具有范围为400nm至900nm的荧光发射峰、范围为500nm至600nm的荧光发射峰、范围为600nm至700nm的荧光发射峰、或范围为700nm至800nm的荧光发射峰。

在某些方面中，偏振敏感纳米颗粒具有低于100nm的荧光发射峰的FWHM、低于90nm的荧光发射峰的FWHM、低于80nm的荧光发射峰的FWHM、低于70nm的荧光发射峰的FWHM、低于60nm的荧光发射峰的FWHM、低于50nm的荧光发射峰的FWHM、低于40nm的荧光发射峰的FWHM、低于30nm的荧光发射峰的FWHM、低于20nm的荧光发射峰的FWHM、低于15nm的荧光发射峰的FWHM、低于10nm的荧光发射峰的FWHM、或低于5nm的荧光发射峰的FWHM。

在一些方面中，偏振敏感纳米颗粒的量子产率为0.10至1.00、偏振敏感纳米颗粒的量子产率为0.10至0.90、偏振敏感纳米颗粒的量子产率为0.10至0.75、偏振敏感纳米颗粒的量子产率为0.10至0.50、偏振敏感纳米颗粒的量子产率为0.25至1.00、偏振敏感纳米颗粒的量子产率为0.25至0.90、偏振敏感纳米颗粒的量子产率为0.25至0.75、偏振敏感纳米颗粒的量子产率为0.25至0.50、偏振敏感纳米颗粒的量子产率为0.50至1.00、偏振敏感纳米颗粒的量子产率为0.50至0.90、偏振敏感纳米颗粒的量子产率为0.50至0.75、偏振敏感纳米颗粒的量子产率超过0.25、偏振敏感纳米颗粒的量子产率超过0.50、偏振敏感纳米颗粒的量子产率超过0.75、或偏振敏感纳米颗粒的量子产率超过0.90。

在一些方面中，偏振敏感纳米颗粒包含每个偏振敏感纳米颗粒一条荧光聚合物链。在其他方面中，偏振敏感纳米颗粒在每个偏振敏感纳米颗粒中包含多条荧光聚合物链。

在一些方面中，第一基质聚合物和第二基质聚合物一起包含基质。在某些方面中，发色聚合物固定在基质内。在某些方面中，发色聚合物与基质的质量比率是0.01至0.50、发色聚合物与基质的质量比率是0.01至0.40、发色聚合物与基质的质量比率是0.01至0.35、发色聚合物与基质的质量比率是0.01至0.30、发色聚合物与基质的质量比率是0.01至0.25、发色聚合物与基质的质量比率是0.01至0.20、发色聚合物与基质的质量比率是0.01至0.15、发色聚合物与基质的质量比率是0.01至0.10、发色聚合物与基质的质量比率是0.01至0.05、发色聚合物与基质的质量比率是0.02至0.50、发色聚合物与基质的质量比率是0.02至0.40、发色聚合物与基质的质量比率是0.02至0.35、发色聚合物与基质的质量比率是0.02至0.30、发色聚合物与基质的质量比率是0.02至0.25、发色聚合物与基质的质量比率是0.02至0.20、发色聚合物与基质的质量比率是0.02至0.15、发色聚合物与基质的质量比率是0.02至0.10、发色聚合物与基质的质量比率是0.02至0.05、发色聚合物与基质的质量比率是0.03至0.50、发色聚合物与基质的质量比率是0.03至0.40、发色聚合物与基质的质量比率是0.03至0.35、发色聚合物与基质的质量比率是0.03至0.30、发色聚合物与基质的质量比率是0.03至0.25、发色聚合物与基质的质量比率是0.03至0.20、发色聚合物与基质的质量比率是0.03至0.15、发色聚合物与基质的质量比率是0.03至0.10、发色聚合物与基质的质量比率是0.03至0.05、发色聚合物与基质的质量比率是0.04至0.50、发色聚合物与基质的质量比率是0.04至0.40、发色聚合物与基质的质量比率是0.04至0.35、发色聚合物与基质的质量比率是0.04至0.30、发色聚合物与基质的质量比率是0.04至0.25、发色聚合物与基质的质量比率是0.04至0.20、发色聚合物与基质的质量比率是0.04至0.15、发色聚合物与基质的质量比率是0.04至0.10、发色聚合物与基质的质量比率是0.04至0.05、发色聚合物与基质的质量比率是0.05至0.50、发色聚合物与基质的质量比率是0.05至0.40、发色聚合物与基质的质量比率是0.05至0.35、发色聚合物与基质的质量比率是0.05至0.30、发色聚合物与基质的质量比率是0.05至0.25、发色聚合物与基质的质量比率是0.05至0.20、发色聚合物与基质的质量比率是0.05至0.15、发色聚合物与基质的质量比率是0.05至0.10、或发色聚合物与基质的质量比率是0.05至0.05。

应用

发色偏振敏感纳米颗粒可用于许多检测和/或成像应用。这些检测和/或成像应用可包括单细胞标记、多细胞标记、组织标记、器官标记、体外标记和体内标记。细胞的检测和/或成像可包括这些细胞所表达的分子，例如胞外分子或胞内分子。该检测和/或成像可包括接合至这些细胞的分子，例如蛋白质、糖、微粒。

在多个方面中，本发明提供了包含本发明的偏振敏感纳米颗粒的颗粒，其中该颗粒是量子点、金纳米颗粒或铁纳米颗粒。

在多个方面中，本发明提供了包含溶液中的多个本发明的偏振敏感纳米颗粒的组合物，其中该组合物是单一分散剂。在一些方面中，溶液是水性的。

在多个方面中，本发明提供了分子靶标的方法，该方法包括使本发明的偏振敏感纳米颗粒中的任一种与靶标结合；用足够产生荧光信号的电磁辐射照射纳米颗粒；并且检测荧光信号。

在一些方面中，电磁辐射是偏振化的。

在多个方面中，本发明提供了分子靶标的方法，该方法包括使本发明的偏振敏感纳米颗粒中的任一种与靶标结合；用足够产生荧光信号的电磁辐射照射纳米颗粒；并且检测荧光信号。

在一些方面中，该方法还包括检测荧光信号的变化同时分析靶标。在一些方面中，该方法还包括从荧光信号检测靶标位置。在一些方面中，该方法还包括从是否存在荧光信号检测是否存在靶标。在一些方面中，该方法还包括从荧光信号变化中检测靶标取向。在一些方面中，该方法还包括对靶标进行成像。在一些方面中，该方法还包括从偏振敏感纳米颗粒的荧光信号变化中检测偏振敏感纳米颗粒位置的变化。在一些方面中，该方法还包括从偏振敏感纳米颗粒位置变化中检测靶标取向。

在某些方面中，偏振敏感纳米颗粒和靶标都在溶液中。在其他方面中，溶液是水性的。在一些方面中，多个纳米颗粒结合至靶标。

在其他方面中，靶标是生物分子。在一些方面中，靶标是生物标志物。在其他方面中，靶标选自抗体、抗原、细胞、核酸、酶、酶的底物、蛋白质、脂质、碳水化合物、治疗剂或其组合。

在一些方面中，同时平行分析多个靶标。

本公开的某些实施方式涉及用于多种应用的发色偏振敏感纳米颗粒及其生物分子共轭物，包括但不限于：流式细胞术、荧光激活的分选、免疫荧光、免疫组化、荧光多重化(fluorescencemultiplexing)、单分子成像、单颗粒追踪、蛋白质折叠、蛋白质转动动力学、DNA和基因分析、蛋白质分析、代谢物分析、脂质分析、基于FRET的传感器、高通量筛选、细胞成像、体内成像、生物正交标记、点击反应、如免疫试验和基于酶的试验(如ELISA)的基于荧光的生物试验、western印迹以及生物试验和测量中的多种荧光技术。

本发明所述发色偏振敏感纳米颗粒可用于多种应用，包括医学诊断、医学预后、生物研究和水和土壤测试。类似地，这些发色偏振敏感纳米颗粒可用于检测多种分析物，例如细胞、微生物、细菌、病毒、蛋白质、肽、碳水化合物、核酸或其部分。

本发明提供了使用发色偏振敏感纳米颗粒标记和检测样品(如混合的样品)中分析物的方法。在一些方面中，该样品可以是流体样品。该流体样品可以是生物流体样品，例如血液样品、血浆样品、唾液样品、尿液样品、淋巴样品或脊液样品。在一些方面中，该样品可以是环境流体样品，例如来自湖、河、海洋、池塘、溪流、喷泉、沼泽或水库。在其他实施方式中，该样品是水样品，例如来自脱盐植物、水处理植物、水库、喷泉、溪流、冰川水流体、水塔或视作可饮用水来源的其他水源。

在一些方面中，可使用本发明提供的发色偏振敏感纳米颗粒检测分析物(如细胞)表达的分子。例如，使细胞接触识别分子(如细胞表面标志物、胞内标志物等)的试剂(如抗体)。在本发明提供的一些方面中，对试剂进行修饰使其结合或连接结合伙伴，该结合伙伴与发色聚合物混合纳米颗粒相连。例如，可通过将试剂与生物素或链霉亲和素共轭来进行修饰。在一些具体实施例中，该试剂与生物素共轭，使得该试剂能够识别与发色聚合物混合纳米颗粒共轭的链霉亲和素分子。这类发色偏振敏感纳米颗粒可用在广泛的应用中，包括细胞成像研究或含有分析物的流体样品。

流体样品中的分析物是细胞、蛋白质、蛋白质复合物、核酸、核蛋白复合物、碳水化合物、代谢物、分解代谢物等。在一些方面，分析物是细胞。细胞的非限制性示例包括：哺乳动物细胞、人细胞、非人哺乳动物细胞、真核生物细胞、原核生物细胞、动物细胞、昆虫细胞、细菌细胞、微生物细胞、真菌细胞、两栖动物细胞和鱼细胞。这些细胞可来源于多种组织，包括但不限于：神经嵴组织、内皮组织、外胚层组织、中胚层组织和间充质组织。细胞类型可包括但不限于：乳腺细胞、脑细胞、神经细胞、胰腺细胞、肝细胞、胆囊细胞、胃肠道细胞、胃细胞、肾细胞、生殖系统的细胞、心脏细胞、皮肤细胞、结肠细胞、尿道细胞、内皮细胞、肌肉细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、肿瘤细胞、癌细胞、病毒感染的细胞、细菌感染的细胞、干细胞、分裂细胞、凋亡细胞、坏死细胞、血液细胞、白血球细胞和基质细胞。

使样品接触适用于标记分析物的试剂。在一些方面中，该试剂是抗体、抗体片段、肽、Fab片段、Fc片段、轻链、重链、免疫球蛋白或免疫球蛋白片段。在一些方面中，该试剂是肽或小分子。在一些方面中，该试剂是经修饰的。对试剂的修饰可包括化学修饰、酶修饰、连接亲水性官能团、疏水性官能团和/或反应性部分。

本发明提供的方法可包括孵育期间。例如，发色偏振敏感纳米颗粒与试剂(如抗体)孵育；试剂(包括与发色偏振敏感纳米颗粒共轭的试剂)与分析物(如细胞)孵育。该孵育期间可持续以下长度的时间：小于或等于100小时、75小时、60小时、50小时、24小时、20小时、15小时、10小时、5小时、3小时、2小时或1小时。在一些方面中，该孵育期间超过5分钟、10分钟、30分钟、1小时、2小时、5小时、10小时、24小时、30小时、50小时、60小时、75小时或100小时。在一些方面中，该孵育期间是5分钟、10分钟、30分钟、1小时、2小时、5小时、10小时、24小时、30小时、50小时、60小时、75小时或100小时。在一些方面中，该孵育期间是约5分钟、10分钟、30分钟、1小时、2小时、5小时、10小时、24小时、30小时、50小时、60小时、75小时或100小时。

在一些方面中，该细胞可表达抗原，例如，通过特定试剂检测的抗原。例如，该试剂可以是抗体。该抗体可以是在一些癌细胞(包括MCF-7细胞)上表达的EpCAM。与发色聚合物混合纳米颗粒共轭的抗体的其他示例包括但不限于广谱细胞角蛋白抗体A45B/B3、AE1/AE3或CAM5.2(识别细胞角蛋白8(CK8)、细胞角蛋白18(CK18)或细胞角蛋白19(CK19)的广谱细胞角蛋白抗体)和针对以下的抗体：乳腺癌抗原NY-BR-1(也称作B726P、ANKRD30A、锚蛋白重复域30A)；B305D同种型A或C(B305D-A或B305D-C；也称作抗原B305D)；赫耳墨斯抗原(Hermesantigen)(也称作AntigenCD44，PGP1)；E-钙粘蛋白(也称作桑椹粘着蛋白、钙粘蛋白-1、CDH1)；癌胚抗原(CEA；也称作CEACAM5或癌胚抗原相关细胞粘着分子5)；β-人绒膜促性腺激素(β-HCG；也称作CGB、慢性促性腺激素、β多肽)；组织蛋白酶-D(也称作CTSD)；神经肽Y受体Y3(也称作NPY3R；脂多糖-相关蛋白3、LAP3、融合体(Fusion)；趋化因子(CXC基序受体4；CXCR4)；癌基因ERBB1(也称作c-erbB-1、表皮生长因子受体、EGFR)；Her-2Neu(也称作c-erbB-2或ERBB2)；GABA受体A、pi(π)多肽(也称作GABARAP、GABA-A受体、pi(π)多肽(GABAA(π)、γ-氨基丁酸A型受体pi(π)亚基或GABRP)；ppGalNac-T(6)(也称作β-1-4-N-乙酰基-氨基半乳糖基-转移酶6、GalNAc转移酶6、GalNAcT6、UDP-N-乙酰基-d-半乳糖胺：多肽N-乙酰基氨基半乳糖基转移酶6或GALNT6)；CK7(也称作细胞角蛋白7、肌凝集素、SCL、角蛋白7或KRT7)；CK8(也称作细胞角蛋白8、角蛋白8或KRT8)；CK18(也称作细胞角蛋白18、角蛋白18或KRT18)；CK19(也称作细胞角蛋白19、角蛋白19或KRT19)；CK20(也称作细胞角蛋白20、角蛋白20或KRT20)；Mage(也称作黑素瘤抗原家族A亚型或MAGE-A亚型)；Mage3(也称作黑素瘤抗原家族A3或MAGA3)；肝细胞生长因子受体(也称作HGFR、肾细胞癌乳突2、RCCP2、原癌基因met或MET)；粘蛋白-1(也称作MUC1、癌抗原15.3、(CA15.3)、癌抗原27.29(CA27.29)；CD227抗原、Episialin、上皮膜抗原(EMA)、多形上皮粘蛋白(PEM)、花生反应性尿粘蛋白(PUM)、肿瘤相关糖蛋白12(TAG12))；总囊性疾病流体蛋白(GrossCysticDiseaseFluidProtein)(也称作GCDFP-15、催乳素诱导蛋白、PIP)；尿激酶受体(也称作uPR、CD87抗原、纤溶酶原激活剂受体尿激酶型、PLAUR)；PTHrP(甲状旁腺素相关蛋白；也称作PTHLH)；BS106(也称作B511S、smallbreastepithelialmucin或SBEM)；前列腺蛋白样亲脂性蛋白B(LPB、LPHB；也称作抗原BU101、分泌球蛋白家族1-D成员2、SCGB1-D2)；乳腺珠蛋白2(MGB2；也称作乳腺珠蛋白B、MGBB、乳糖球蛋白(LGB)亲脂性蛋白C(LPC、LPHC)、分泌球蛋白家族2A成员1或SCGB2A1)；乳腺珠蛋白(MGB；也称作乳腺珠蛋白1、MGB1、乳腺珠蛋白A、MGBA、分泌球蛋白家族2A成员2或SCGB2A2)；乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂(马斯平(maspin)、也称作丝氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制剂进化枝B(卵清蛋白)成员5或SERPINB5)；前列腺上皮细胞特异性Ets转录因子(PDEF；也称作含有不育α基序点结构域的ets转录因子或SPDEF)；肿瘤相关钙信号转导因子1(也称作结直肠癌抗原CO17-1A、上皮糖蛋白2(EGP2)、上皮糖蛋白40kDa(EGP40)、上皮细胞粘连分子(EpCAM)、上皮特异性抗原(ESA)、胃肠癌相关抗原733-2(GA733-2)、KS1/4抗原、染色体4表面标志物1的膜组分(M4S1)、MK-1抗原、MIC18抗原、TROP-1抗原或TACSTD1)；端粒酶反转录酶(也称作端粒酶催化亚基或TERT)；三叶因子1(也称作乳腺癌雌激素可诱导序列、BCEI、胃肠三叶蛋白、GTF、pS2蛋白或TFF1)；叶酸；或三叶因子3(也称作肠三叶因子、ITF、p1.B；或TFF3)。

在一些方面中，制备了含有分析物的样品用于标记。在本发明所提供方法的任何阶段处，都使分析物(如细胞)与封闭缓冲液孵育以防止或减少试剂的非特异性结合。在一些方面中，测量非特异性结合，例如通过相对于另一化合物的非特异性结合的百分比、倍数、变化。例如，非特异性结合的倍数可以是小于1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。例如，非特异性结合的倍数是1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。例如，非特异性结合的倍数可以是约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。

在本发明所提供方法的任何阶段处，都使用合适的缓冲溶液来清洗分析物(如细胞)。这些细胞通过本领域已知的任何方法浓缩，包括但不限于离心或过滤。在一些方面中，作为本发明所提供方法的一部分，不对分析物(如细胞)进行浓缩。在一些方面中，该方法可包括使用固定剂固定细胞。在其他实施方式中，该方法可不包括使用固定剂固定细胞。在一些方面中，该方法可包括使用适用于透化的试剂来透化细胞。在其他实施方式中，细胞的制备可不包括使用适用于透化的试剂来透化细胞。

本发明提供了发色偏振敏感纳米颗粒用于检测蛋白质和肽的应用。在一些方面中，本发明涉及生物共轭的发色偏振敏感纳米颗粒在Western印迹试验中的应用，包括分离和检测感兴趣的蛋白质或肽。根据本发明的多个实施方式，通过色谱、过滤、毛细电泳、沉淀、液相或其他提取方法、免疫沉淀或其组合来分离蛋白质或肽。在某些实施方式中，使用发色偏振敏感纳米颗粒进行其他蛋白质检测试验，包括但不限于免疫染色、分光光度法、基于酶的试验(如ELISA)及其组合。

本发明可与包括使用发色偏振敏感纳米颗粒检测蛋白质或肽分析物的任何试验联用。在多个实施方式中，在检测前从混合物中分离蛋白质或肽。本发明的方法与免疫方法(例如ELISA试验、RIA试验、ELI-Spot试验、流式细胞试验、免疫组化试验、免疫染色、Western印迹分析和蛋白质芯片试验)、物理方法(例如单向或双向凝胶电泳试验、毛细电泳试验、FRET试验、色谱试验，或染料检测试验、分光光度试验、沉淀方法)或其组合联用。

在多个实施方式中，在使用本发明的发色偏振敏感纳米颗粒进行检测前，通过色谱方法、过滤方法、毛细管电泳方法、凝胶电泳方法、液相提取方法、沉淀方法或免疫沉淀方法来分离蛋白质或肽。此外，色谱方法可以是反向色谱。在多个实施方式中，可平行进行多个试验以改进分析通量。

在多个实施方式中，本发明提供了检测蛋白质或肽的方法，该方法包括：从混合物中分离蛋白质或肽；使分离的蛋白质或肽接触包含聚合物混合纳米颗粒的溶液，该聚合物混合纳米颗粒与特异性针对至少一些分离的蛋白质或肽的生物分子共轭；以及检测来自偏振敏感纳米颗粒的至少一种信号，该至少一种信号对应于分离的蛋白质或肽。在一些方面中，本发明的方法定量蛋白质或肽。

在一些方面中，分离所述蛋白质或肽包括色谱法、过滤法、毛细管电泳法、凝胶电泳法、液相萃取法、沉淀法、免疫沉淀法或其组合。

在一些方面中，聚合物混合纳米颗粒中包含的聚合物选自半导体聚合物、非半导体聚合物或其组合。

在一些方面中，聚合物混合纳米颗粒中包含的聚合物选自：基于聚((甲基)丙烯酸)-的聚合物、基于聚二烯的聚合物、基于聚(环氧乙烷)的聚合物、基于聚异丁烯的聚合物、基于聚苯乙烯的聚合物、基于聚硅氧烷的聚合物、基于聚(二茂铁基二甲基甲硅烷)的聚合物、基于聚(2-乙烯基萘)的聚合物、基于聚(乙烯基吡啶)的聚合物、基于聚(碘化N-甲基乙烯基吡啶鎓)的聚合物，或基于聚(乙烯基吡咯烷酮)的聚合物。

在一些方面中，本发明提供了与Western印迹试验联用对蛋白质或肽的检测。Western印迹是一种蛋白质分析方法，其中蛋白质通过质量和/或长度分离，通常使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，随后转移至由例如硝酸纤维素或氟化聚合物(如聚偏二氟乙烯(PVDF))组成的膜上，并使用标记过程观察。在本发明中，发色偏振敏感纳米颗粒显示使用Western印迹分析对含量低至50皮克的蛋白质提供检测(参见例如实施例5)。

在其他实施方式中，提供了在混合纳米颗粒印迹试验中使用发色偏振敏感纳米颗粒对分子进行超灵敏荧光成像的方法。在混合纳米颗粒印迹试验中，不首先分离待检测的蛋白质或肽。而是，将未分离的样品以混合纳米颗粒的形式直接施加于膜上并使用标记过程观察。在本发明中，发色偏振敏感纳米颗粒显示使用混合纳米颗粒印迹分析为低于两皮克含量的蛋白质提供检测。

通过以下方法从组织、细胞或流体样品中收集蛋白质或肽，包括但不限于，冻融、超声、高压匀化、过滤、透化和离心。在一些方面中，收集的蛋白质或肽还可在分析前经历一个或多个分离或纯化步骤。

在一些方面中，可对含有不同蛋白质的异质性混合物的样品进行分析。在其他实施方式中，可对纯化的蛋白质进行分析。

在一些方面中，在分析前分离样品，例如通过凝胶电泳或适用于分离样品的其他方法。在一些方面中，在分析前基于质量和/或电荷分离蛋白质或肽。

在一些方面中，将发色偏振敏感纳米颗粒悬浮在液体中，且使该液体物理接触样品，该样品悬浮在第二液体中或置于表面上。在一些方面中，该样品置于包含膜的表面上。

在一些方面中，将发色偏振敏感纳米颗粒置于表面上，并使该表面与样品物理接触，该样品悬浮于液体中。在一些方面中，其上放置发色偏振敏感纳米颗粒的表面包含膜。

在一些方面中，进行免疫沉淀试验，其中发色偏振敏感纳米颗粒置于表面上并与悬浮于液体中的蛋白质样品物理接触。根据这一情况，蛋白质样品与相应发色聚合物混合纳米颗粒的接触导致蛋白质通过结合发色聚合物混合纳米颗粒粘附于表面。

在多个实施方式中，本发明所述发色偏振敏感纳米颗粒将在由激发源正确诱导时发射荧光。在某些实施方式中，测得存在的发色偏振敏感纳米颗粒的量并随后与给定的感兴趣的分析物(如感兴趣的蛋白质)的量相关联。因此，本发明所述方法利用激发光源来诱导发色聚合物混合纳米颗粒荧光，其可随后被测量并与样品浓度相关联。在多个实施方式中，电磁辐射(如红外辐射、可见光或紫外辐射)被用于触发来自发色偏振敏感纳米颗粒的电磁辐射，且发射的信号被用于评价样品中存在的目标分子的量。在一些方面中，电磁辐射源可包含激光、LED、灯、滤光片或多向色镜(multichroicmirror)。在一些方面中，光激发源可以是凝胶成像设备、显微镜或其他合适设备的组件。可调节给定发色聚合物混合纳米颗粒的化学和物理性质以调节激发和发射波长以及其他光学性质。

在一些方面中，诱导发色聚合物混合纳米颗粒激发的电磁辐射的峰值波长为约200nm至约300nm、约250nm至约350nm、约300nm至约400nm、约350nm至约450nm、约400nm至约500nm、约450nm至约550nm、约500nm至约600nm、约550nm至约650nm、约600nm至约700nm、约650nm至约750nm、约700nm至约800nm、约750nm至约850nm、约800nm至约900nm、约850nm至约950nm，或约900nm至约1000nm。在一些方面中，样品可经历超过一种激发光谱，例如在多重分析中。

在一些方面中，诱导发色聚合物混合纳米颗粒激发的电磁辐射的峰值波长是：200nm至300nm、250nm至350nm、300nm至400nm、350nm至450nm、400nm至500nm、450nm至550nm、500nm至600nm、550nm至650nm、600nm至700nm、650nm至750nm、700nm至800nm、750nm至850nm、800nm至900nm、850nm至950nm，或900nm至1000nm。在一些方面中，样品可经历超过一种激发光谱，例如在多重分析中。

在一些方面中，所检测信号的峰值波长为约200nm至约300nm、约250nm至约350nm、约300nm至约400nm、约350nm至约450nm、约400nm至约500nm、约450nm至约550nm、约500nm至约600nm、约550nm至约650nm、约600nm至约700nm、约650nm至约750nm、约700nm至约800nm、约750nm至约850nm、约800nm至约900nm、约850nm至约950nm、约900nm至约1000nm、约950nm至约1050nm、约1000nm至约1100nm、约1050nm至约1150nm、约1100nm至约1200nm、约1150nm至约1250nm，或约1200nm至约1300nm。

在一些方面中，所检测信号的峰值波长为：200nm至300nm、250nm至350nm、300nm至400nm、350nm至450nm、400nm至500nm、450nm至550nm、500nm至600nm、550nm至650nm、600nm至700nm、650nm至750nm、700nm至800nm、750nm至850nm、800nm至900nm、850nm至950nm、900nm至1000nm、950nm至1050nm、1000nm至1100nm、1050nm至1150nm、1100nm至1200nm、1150nm至1250nm或1200nm至1300nm。

在一些方面中，该试验足够灵敏以检测低于500皮克、低于400皮克、低于300皮克、低于200皮克、低于100皮克、低于50皮克、低于40皮克、低于30皮克、低于20皮克、低于10皮克、低于5皮克、低于4皮克、低于3皮克、低于2皮克或低于1皮克的目标分子(如蛋白质)。

在一些方面中，该试验足够灵敏以检测约500皮克、约400皮克、约300皮克、约200皮克、约100皮克、约50皮克、约40皮克、约30皮克、约20皮克、约10皮克、约5皮克、约4皮克、约3皮克、约2皮克或约1皮克的目标分子(如蛋白质)。

在一些方面中，该试验足够灵敏以检测500皮克、400皮克、300皮克、200皮克、100皮克、50皮克、40皮克、30皮克、20皮克、10皮克、5皮克、4皮克、3皮克、2皮克或1皮克的目标分子(如蛋白质)。

在许多优势中(如改进的检测灵敏度和光稳定性)，与使用传统荧光探针的常规方法相比，本发明的方法无需任何额外设备或时间。

本文中，“特异性”指与共轭的发色聚合物混合纳米颗粒物理接触其他组分时相比，该共轭的发色聚合物混合纳米颗粒与其靶标的结合亲合力更高。共轭的发色聚合物混合纳米颗粒特异性针对其靶标的前提是共轭的发色聚合物混合纳米颗粒与其靶标的平衡常数大于共轭的发色聚合物混合纳米颗粒与其物理接触的其他组分的平衡常数。较高的特异性表示相对于其他组分与靶标的结合亲合力较高，且这表明针对某一靶标，试验中的检测灵敏度提高。有利地，本发明的方法对本发明的目标分子(例如蛋白质或肽)表现出非常高的特异性。

在一些方面中，使用共轭的发色偏振敏感纳米颗粒改进了检测灵敏度，因为那些发色偏振敏感纳米颗粒对表面(例如对其上具有样品的膜)的非特异性吸附水平相对较低。在某些实施方式中，通过使用封闭剂最小化非特异性吸附，所述封闭剂是能够封闭非特异性吸附的任何试剂，所述非特异性吸附会干扰使用发色偏振敏感纳米颗粒精确检测目标蛋白质或肽。例如，封闭剂有利地封闭发色偏振敏感纳米颗粒和/或生物分子非特异性吸附至这些发色偏振敏感纳米颗粒和/或生物分子物理接触的表面上。

在某些实施方式中，检测包括检测皮克量的分离的蛋白质。在其他实施方式中，检测包括检测少于2皮克的分离的蛋白质。在某些实施方式中，该方法还包括使用电磁辐射源激发聚合物混合纳米颗粒。在一些方面中，该电磁辐射源包括激光、灯、LED或其组合。在其他实施方式中，该电磁辐射在激发聚合物混合纳米颗粒前通过滤光片、多向色镜或其组合。

在一些方面中，激发样品的电磁辐射的峰值波长为约200nm至约300nm、约250nm至约350nm、约300nm至约400nm、约350nm至约450nm、约400nm至约500nm、约450nm至约550nm、约500nm至约600nm、约550nm至约650nm、约600nm至约700nm、约650nm至约750nm、约700nm至约800nm、约750nm至约850nm、约800nm至约900nm、约850nm至约950nm，或约900nm至约1000nm。在一些方面中，两种或更多种电磁辐射峰值波长激发样品。

在一些方面中，激发样品的电磁辐射的峰值波长是：200nm至300nm、250nm至350nm、300nm至400nm、350nm至450nm、400nm至500nm、450nm至550nm、500nm至600nm、550nm至650nm、600nm至700nm、650nm至750nm、700nm至800nm、750nm至850nm、800nm至900nm、850nm至950nm，或900nm至1000nm。

本发明提供了用于检测样品中分析物的方法，特别是检测本发明所提供的发色聚合物混合纳米颗粒的方法。这些分析物使用发色偏振敏感纳米颗粒标记；或者，在一些情况中，这些分析物使用发色偏振敏感纳米颗粒和其他标记试剂(如荧光团)的组合标记。在一些方面中，分析来自样品的标记的分析物中是否存在发色聚合物混合纳米颗粒。在一些方面中，使用流式细胞仪来检测发色偏振敏感纳米颗粒(如FACSCantoII)。在一些方面中，该流式细胞仪配备激光(如405nm)。在一些方面中，这些发色偏振敏感纳米颗粒使用具有滤光片(如502-nm长通和510/50nm带通滤光片)的荧光发射的检测通道和激光(如405nm)检测。在一些方面中，通过光电倍增管阵列检测散射光和荧光发射。在一些方面中，使用软件(如FlowJo)分析获自流式细胞实验的数据。

在一些方面中，可使用荧光显微镜来检测发色偏振敏感纳米颗粒。例如，可使用配备有相机的荧光显微镜来对细胞成像。该显微镜可以是共聚焦显微镜(如ZeissLSM510)。这些发色偏振敏感纳米颗粒由激光(如405-nm二极管激光或488-nm氩激光)激发。在一些方面中，对细胞成像，例如使用玻璃底培养皿。

虽然已显示和描述了本发明的优选实施方式，但应理解，本发明不限于下文本发明所述特定情况，对特定实施方式做出修改并仍落入所附权利要求的范围中。也应理解，此处使用的术语是为描述具体实施方式，而不是起限制作用。本发明的范围由所附权利要求限定。在本说明书和权利要求书中所用的单数形式“一个”，“一种”和“该”包括多个指示物，除非上下文中有明显的表示。

本文所述的特例是通过实施例的方法并且仅用于显示本发明的优选实施方式的示例性描述的目的并且在提供那些是最有用的并易于理解本发明的多个实施方式的原理描述和概念实施方式。在这方面，没有尝试去以比本发明的基本理解所需更详细地显示本发明的结构细节，附图和/或实施例的描述使得在实践中如何实施本发明的几种形式是本领域技术人员是显而易见的。

实施例

提供以下实施例的目的是向本领域普通技术人员完整地公开和描述如何制备和使用本发明，这些实施例不意在限制所认为的发明范围，也不代表下述实验是所进行的所有或仅有的实验。努力保证所用数值(如量、温度等)的准确性，但应允许一些实验误差和偏差。除非另有说明，份数是重量份数，分子量是重量均分子量，温度是摄氏度，压力是大气压或接近大气压。

实施例1

混合半导体聚合物纳米颗粒的制备和使用

该实施例描述了混合半导体聚合物纳米颗粒的制备和使用，其区分蛋白质的一部分远离和/或趋向同一蛋白的不同部分的移动。

材料

聚[(9，9-二辛基芴基-2，7-二基)-交替-共-(1，4-苯并-(2，1’，3)-噻二唑)](PFBT，10kDaMW，多分散指数(PDI)2.3)购自美国染料源公司(AmericanDyeSourceInc.)(加拿大魁北克)。用羧基官能化的聚苯乙烯-枝接-聚(环氧乙烷)(PS-PEG-COOH，主链MW8,500，枝接链MW1200，总链MW21700，PDI1.25)购自聚合物源公司(PolymerSourceInc)(加拿大魁北克)。二甲亚砜(DMSO)、酪蛋白、腺苷5’-三磷酸镁盐(MgATP)、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)(HEPES)、(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)、聚(乙二醇)(PEG)、和四氢呋喃(THF)购自西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)(密苏里州圣路易斯(St.Louis，MO))。1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)购自英杰公司(Invitrogen)(加利福尼亚州卡尔斯巴德)。30％过氧化氢购自JTBaker(马萨诸塞州马耳波罗(Mansfield，MA))。由Milli-Q水生产单元产生超纯水(Milli-Q)；该生产单元和氢氧化铵购自EMD密理博公司(马萨诸塞州比尔里卡)。微管蛋白、生物素化的微管蛋白、荧光HiLyte488微管蛋白、紫杉醇(“Taxol”)、鸟苷-5’-三磷酸(GTP)、和一般微管蛋白缓冲液(GTB)购自细胞骨架有限公司(CytoskeletonInc.)(科罗拉多州丹佛市(Denver，CO))。2种变体的全长驱动蛋白，大肠杆菌和果蝇驱动蛋白由华盛顿大学的Wordeman实验室善意提供。除非另外说明，所有化学物如是使用。

P70聚合物合成

将疏水性十二烷基胺通过自发胺连接枝接到亲水性聚(异丁烯-交替-马来酸酐)(Mw约6000)主链上来合成共聚物，其将一个马来酸酐转化成相应的胺和一个游离羧酸。0.5g(0.083mmol)的聚(异丁烯-交替-马来酸酐)分散到100-mL圆底烧瓶中的20mL无水THF中。将溶解在40mL的无水THF中的0.43g(2.32mmol)十二烷基胺迅速注射到聚合物溶液中并剧烈搅拌保持在60℃下。在3小时后，将反应混合物减压浓缩至原始体积的三分之一。浓缩的融合进一步在60℃下回流过夜。然后缓慢蒸发溶剂直至聚合物完全干燥以得到淡黄色固体。最终产物产率是约0.88g，95％。¹HNMR(500MHz，CDCl₃)：δ＝4.368-4.339(brs，2H)，3.74(s，2H)，2.516-2.483(brs，2H)，2.282-2.251(brs，2H)，1.848(s，2H)，1.264(s，22H)，0.879(s，9H)。

半导体聚合物混合纳米颗粒形成

通过纳米沉淀技术形成偏振敏感纳米颗粒。含20μL的10mg/mLP70、25μL的10mg/mLPS-PEG-COOH、和1μL的10mg/mLPFBT的THF溶液与5mL的THF混合并且所得的溶液超声处理1分钟。在超声处理之后，将THF在高超声功率下快速加入10mLMilli-Q水。聚合物不溶于水并且快速形成偏振敏感纳米颗粒。然后通过将溶液加热至85℃并且用氮气鼓泡通过溶液2小时来去除THF。在去除THF之后，混合纳米颗粒过滤通过0.2-μm过滤器。

偏振敏感纳米颗粒的制备

图1显示了用于制备偏振敏感荧光混合纳米颗粒的策略。疏水性荧光聚合物聚[(9，9-二辛基芴基-2，7-二基)-交替-共-(1，4-苯并-(2，1’，3)-噻二唑)](PFBT)与基质聚合物P70(参见图1化学式)和羧基官能化的聚苯乙烯-枝接-聚(环氧乙烷)(PS-PEG-COOH)一起纳米沉淀形成具有7.5nm的平均直径和1.5nm的峰宽度的小荧光混合纳米颗粒。混合纳米颗粒的吸收/发射光谱示于图2A，部分(A)显示偏振敏感纳米颗粒的吸收和发射光谱，并且部分(B)显示官能化之前数均混合纳米颗粒流体动力学直径。用链霉亲和素官能化该混合纳米颗粒以促进与生物分子的结合。图6显示了在pH7.2的20mMHEPES缓冲液中具有-28mV的较低ζ电势的混合纳米颗粒。为了防止聚集和非特异性吸附，也用聚乙二醇(PEG)官能化混合纳米颗粒。动态光散射(DLS)测量显示在生物共轭之前和之后在平均聚合物混合纳米颗粒流体动力学直径从7.46nm至12.07nm至增加(图2B)，其峰FWHM分别是1.46和3.72nm。发现所得的官能化混合纳米颗粒是特别单分散的并且它们的尺寸测量在4℃下保持稳定数月。

通过用1.5M蔗糖枕差异离心估计单一偏振敏感纳米颗粒的质量是200kDa。密度为1.1g/cm³的8-nm直径聚合物混合纳米颗粒重量大约是200kDa。对于约1-5％的荧光聚合物质量比率和10kDa的分子量，各偏振敏感纳米颗粒含有每个混合纳米颗粒大约1条PFBT链。这种荧光聚合物的低质量比率使这些混合纳米颗粒与之前的混合纳米颗粒分化，其一般含有至少50重量％，并且在多个实施方式中高达100％的聚合物(Wu，C.；Chiu，D.T.Angew.Chem.Int.Edit.2013，52，3086-3109；Rong，Y.；Wu，C.；Yu，J.；Zhang，X.；Ye，F.；Zeigler，M.；Gallina，M.E.；Wu，I.-C.；Zhang，Y.；Chan，Y.-H.等.ACSNano.2013，7，376-384)。泊松统计学预测混合纳米颗粒中的以下不含荧光聚合物，但是非荧光混合纳米颗粒的存在似乎不影响其他混合纳米颗粒。虽然与混合纳米颗粒相比，PFBT的较低质量比率可能降低偏振敏感纳米颗粒的亮度，但是其具有其他光物理益处。发现偏振敏感纳米颗粒具有0.75的量子产率(图7)，其甚至超过THF溶液中的PFBT的量子产率(参见Wu，C.；Chiu，D.T.Angew.Chem.Int.Edit.2013，52，3086-3109；Wu，C.；Schneider，T.；Zeigler，M.；Yu，J.；Schiro，P.G.；Burnham，D.R.；McNeill，J.；Chiu，D.T.J.Am.Chem.Soc.2010，132，15410-15417，其证明了含有80％PFBT并显示出0.3的量子产率的纳米颗粒)。高量子产率可能是由链间聚集猝灭的最小化(Nguyen，T.-Q.；Doan，V.；Schwartz，B.J.J.Chem.Phys.1999，110，4068-4078；Jakubiak，R.；Collison，C.J.；Wan，W.C.；Rothberg，L.J.J.Phys.Chem.A.1999，103，2394-2398)以及溶剂的光致发光的碰撞猝灭减少(Yu，J.；Hu，D.；Barbara，P.F.Science.2000，289，1327-1330)所导致，其是由于存在保护疏水性荧光聚合物远离水性环境的两亲性聚合物。偏振敏感纳米颗粒是光稳定的，并且当用488-nm光激发时亮度接近与量子点相同(图8和9)。同样，基于入射光的偏正化，这些低质量比率偏振敏感纳米颗粒具有高强度。

聚合物点生物共轭

偏振敏感纳米颗粒与链霉亲和素共价结合以提供将混合纳米颗粒与其他感兴趣的生物分子或结构连接的方便方式。含0.1％PEG的4mL混合纳米颗粒溶液与240μL的链霉亲和素溶液(1mg/mL)混合，然后向溶液中加入80μL的新鲜制备的EDC(5mg/mL)。这通过在室温下磁性搅拌4小时来混合。在4小时之后，胺末端的PEG与另外80μL的EDC一起加入以在混合纳米颗粒的表面上加帽任何剩余羧酸基团并减少非特异性结合。反应允许持续另外2小时，然后用80μL的10重量％BSA溶液猝灭。然后使用100,000MW截止离心管对混合纳米颗粒进行浓缩，并且在尺寸排阻柱上进行纯化。如果在4℃下冷藏，则所得的链霉亲和素-和-PEG-官能化的混合纳米颗粒持续稳定数月。

微管制备

通过混合10μLGTB和9μL的10mg/mL微管蛋白、1μL10mg/mL生物素化的微管蛋白、2μL无水DMSO、和0.5μLGTP从微管蛋白聚合微管。将溶液放置在37℃水浴中并且分别在0、10和20分钟处将紫杉醇加至2μM、20μM和200μM的终浓度。聚合持续60分钟并且通过在使用前重复抽吸微管来缩短微管。通过用HiLyte488微管蛋白代替生物素化的微管蛋白并且如本文所述聚合微管蛋白来制备用作对照的荧光标记的微管。

偏振敏感性

根据用于激发的光的偏振，偏振敏感纳米颗粒可具有大的强度。为了证明这点，使用具有偏振化的激发的光学装置。通过仔细使用定位的偏振器和λ/2波片，在物镜之后测量并实现100∶1的I||∶I⊥的激发偏振强度比率。这种偏振化的光选择性激发具有与光对准的吸收偶极的发色团；当发色团局限于特定取向时，发射的光偏振化(Lakowicz，J.R.《荧光光谱学原理》(PrinciplesofFluorescenceSpectroscopy)，第三版；施普林格出版社(Springer)，2006)。发射的光分成其垂直偏振化的组分，并且该组分在EMCCD相机上成像。可从发射的光的偏振化的组分的强度变化中推导出偏振敏感纳米颗粒的取向变化上的信息。之前已经描述了用于将发射分成其垂直偏振的设备(Zeigler，M.B.；Allen，P.B.；Chiu，D.T.Biophys.J.2011，100，2846-2851)。

通过2种分开的方法检测根据光偏振的荧光强度(参见图3A)。(A)部分的示意图显示通道中显微镜位移台和偏振敏感纳米颗粒。通过旋转λ/2片来改变偏振激发或用恒定的偏振来旋转位移台。(B)部分的曲线显示分到2个垂直偏振的通道的单一聚合物混合纳米颗粒的发射光。通过旋转位移台同时将激发偏振保持恒定来相对于激发偏振改变聚合物混合纳米颗粒的取向。发射显示对单一聚合物混合纳米颗粒取向的强依赖性。插图是在对移位台旋转后由I||通道捕获的单一混合纳米颗粒所拍摄的图像。(C)曲线显示激发偏振旋转时的单一聚合物混合纳米颗粒的发射光。标记为IA和IB的垂直偏振化的发射通道中相关强度变化是可从单发光发色团所预期。在2种方法中，偏振敏感纳米颗粒吸收到澄清APTES-包被的玻璃通道表面上；然后用Milli-Q水填充通道。在第一种方法中，激发偏振保持固定，同时使用旋转位移台手动旋转聚合物混合纳米颗粒样品。所得的垂直偏振化的发射光的负相关强度最大和最小值示于图3B。随着位移台的转动，I||和I⊥通道中测量的发射强度并不总是负相关的；2个通道的强度的关系取决于吸收到盖玻片的聚合物混合纳米颗粒的取向。各聚合物混合纳米颗粒的发射偶极的取向是随机的，因此I||和I⊥的曲线可能如图3C所示的那样相关，负相关，或者在相关和负相关之间，取决于偶极矩相对于盖玻片的取向。虽然存在最大和最小值，手动重新定位旋转位移台产生的实际问题多少扭曲了曲线。在第二种方法中，移动置于激发路径中的旋转架置的λ/2波片同时样品保持静止。图3C显示了从单一聚合混合纳米颗粒发射的光的I||和I⊥强度。来自聚合物混合纳米颗粒的发射与单个、静止荧光团所观察到的类似。

混合纳米颗粒中使用的PFBT聚合物的平均分子质量是10kDa，其对应于每条聚合物链平均20个发色团。各荧光单体长度大约为1.5nm，因此为了使聚合物链安置在7-nm-直径混合纳米颗粒中，链中必须有扭折。这些聚合物的扭折部分是局部能量最小并且优先发射光子(Lee，J.-I.；Zyung，T.；Miller，R.D.；Kim，Y.H.；Jeoung，S.C.；Kim，D.J.Mater.Chem.2000，10，1547-1550)。激发能量向这些区域的链内转移使得这些聚合物链与单个荧光团有类似性质(Huser，T.；Yan，M.；Rothberg，L.J.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2000，97，11187-11191)。Schwartz等也显示当在这些局部最小处俘获激发能量时偏振可自发增加(Schwartz，B.J.；Nguyen，T.-Q.；Wu，J.；Tolbert，S.H.Synth.Met.2001，116，35-40)，其将有利于偏振化的光从偏振敏感纳米颗粒上发射。

图4A是显示聚合物混合纳米颗粒内的EET的卡通图。PFBT聚合物与其吸收偶极对准的吸收的光子，并且吸收的能量快速转移到链上的最低能量点。最终发射光子的发色团可能有或没有与吸收偶极对准的偶极矩。这意味着对于单个荧光混合纳米颗粒而言，PFBT聚合物的吸收和发射可能对混合纳米颗粒取向上的变化给出信息。然而，由于能量转移，激发和发射偏振化互相随机取向。图4B是主体水性溶液中偏振敏感纳米颗粒的荧光寿命衰减和时间分辨的各向异性衰减的重叠。0.36的高初始各向异性可能是由于来自初始激发的发色团的发射，其对准偏振化的光并且将预期是高各向异性的。主体各向异性的后续减少可能是由于向具有不同发射偶极矩的发色团转移能量所致并且几乎与激发偏振不相关。与减少至0的完美各向同性值不同，荧光各向异性衰减至约0.1的最终值。这种残留各向异性存在多种可能的解释：(1)这是聚合物混合纳米颗粒内荧光聚合物可能保留一些优先取向的证据，或(2)聚合物链中的化学缺陷可能阻止部分能量的转移，或(3)由聚合物的局部能量最小值吸收的光的百分比足够小，使得发生进一步能量转移。各向异性衰减曲线下的积分揭示了94％的光子在各向异性衰减的寿命之后发射；绝大部分的光子可能在激发的能量转移之后发射。基于12.1nm的流体动力学直径，使用Perrin等估计偏振敏感纳米颗粒的旋转相关时间是200ns。主体水性溶液中测量的偏振敏感纳米颗粒的各向异性衰减寿命是170ps，比旋转相关时间快3个数量级，并且与沿着聚合物主链的能量转移的时间尺度相一致。

微管滑动试验

通过在2％Micro-90溶液中超声处理30分钟，之后在Milli-Q水中充分淋洗并且在Milli-Q水中超声处理30分钟来清洁所有玻璃盖玻片。玻璃然后在Milli-Q∶NH₄OH∶H₂O₂的3∶2∶1溶液中煮沸60分钟，之后在使用前用Milli-Q水充分淋洗。使用由双面粘性带接合至1”盖玻片的干净玻璃载玻片产生具有2.5cm×1cm×1μm的大致尺寸的通道。使用稍加修改的由Wang等之前描述的技术²⁵来使带接合的混合纳米颗粒的滑动微管可视化。各10μL的一系列5种溶液导入通道中并且在其导入之后允许静置5分钟。溶液1含有GTB和0.5mg/mL酪蛋白。溶液2含有GTB和0.2mg/mL酪蛋白、0.3mMMgATP和驱动蛋白。溶液3含有GTB和0.5mg/mL酪蛋白、0.3mMMgATP、10μM紫杉醇、和0.05μL的微管溶液。溶液4含有GTB和0.5mg/mL酪蛋白、0.3mMMgATP、10μM紫杉醇、和50pM的官能化的混合纳米颗粒。溶液5含有GTB和0.5mg/mL酪蛋白、1.5mMMgATP、10μM紫杉醇、和除氧系统(50μg/mL葡萄糖氧化酶、4μg/mL氧化氢酶、1％葡萄糖和0.1％β-巯基乙醇)。导入最后溶液三次以冲走游离的偏振敏感纳米颗粒。

光学装置

使用最佳形式的单球面透镜、488nmλ/2波片和偏振器(新泽西州牛顿的索雷博公司(Thorlabs))来实现偏振化的宽场照射。通过小心放置偏振光学器件，实现了100∶1的I_||∶I_⊥比率。选择488-nm分色镜对反射和透射的偏振强度。荧光发射来自Sapphire488-nm激光器(加利福尼亚州圣克拉拉市的粘合有限公司(Coherent))。使用500-nm的长通过滤器滤去激发光。使用TE-2000显微镜(纽约州梅尔维尔市的尼康仪器公司(Nikon，Melville，NY))和100×1.3数值孔径物镜进行成像。之前所述的自制装置(Zeigler等)¹⁹来分离垂直偏振化的荧光组分，并且在同一Cascade512bEMCCD相机(亚利桑那州图森的光度公司(Photometrics，Tucson，AZ))的两半上捕获所得的图像对。

单个表面接合的偏振敏感纳米颗粒的观察

通过向(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷处理的1号玻璃盖玻片(新泽西州瓦恩兰的贝尔克公司(Bellco，VinelandNJ))施涂非常稀(1pM)的偏振敏感纳米颗粒溶液来观察单个偏振敏感纳米颗粒。盖玻片经光蚀刻以辅助在亮场照射下定位盖玻片。在5分钟后，用Milli-Q水淋洗盖玻片，干燥并且置于通道中，如前所述。通过用水填充通道并且将通道插入在显微镜上固定的旋转位移台来证明偏振敏感纳米颗粒偏振敏感度。照射偏振敏感纳米颗粒并且手动旋转位移台以使得个体偏振敏感纳米颗粒的偏振化发射可视化。

偏振敏感纳米颗粒的表征

所有荧光光谱在补充0.1％PEG的pH7.4的20mMHEPES缓冲液中获取。用使用氙灯在450nm处激发的滨松绝对PL量子产率测量系统(日本静冈的滨松公司(Hamamatsu，Shizuoka，Japan))来获取量子产率测量值。使用PicoQuantFluotime100系统和470nm皮秒激光器按照生产生的说明来获取荧光寿命和时间分辨荧光各向异性测量值并且使用市售Fluo拟合软件(德国柏林的Picoquant公司(PicoquantGmbH，Berlin，Germany))来分析。使用ZetasizerNanoZS(宾夕法尼亚州费城的马尔文公司(Malvern，Philadelphia，PA))来表征混合纳米颗粒尺寸和ζ电势。使用Fluorolog-3荧光分光仪(新泽西州HJY公司(HORIBA，JobinYvon，NJ))来获取荧光光谱。荧光光谱在含0.1％PEG的pH7.4的20mMHEPES缓冲液中获取。

半导体偏振敏感纳米颗粒作为微管取向的检测器

偏振敏感纳米颗粒的小尺寸、光学稳定性、化学灵活性和偏振敏感性使得它们称为检测蛋白质取向变化的探针的良好候选物。细胞内的真核微管通常各自含有由α和β微管蛋白的重复单元组成的13根原纤维；体外聚合的微管已经显示由不同数量的原纤维组成。偏离每个微管13根原纤维的变化可能在微管的圆筒中产生周期性的扭结(twist)(Chrétien，D.；Wade，R.R.Biol.Cell.1991，71，161-174；Sanghamitra，R.；E.；Milligan，R.A.；Howard，J.J.CellBiol.1993，121，1083-1093；Wang，G.；Sun，W.；Luo，Y.；Fang，N.J.Am.Chem.Soc.2010，132，16417-16422)。机动蛋白驱动蛋白沿着微管中的原纤维轴，之后沿着微管轴中任意潜在周期性扭结行进。在微管滑动试验中，驱动蛋白被动吸附在玻璃表面上以启动用偏振敏感纳米颗粒标记的微管通过通道。由于由驱动蛋白引导微管，可能使用荧光显微镜来使微管扭结的周期性可视化(图5A)。

驱动蛋白的重链长约70nm并且滑动试验不受存在12-nm-直径的偏振敏感纳米颗粒的抑制。在该滑动试验中使用2种不同的驱动蛋白来测量微管扭结的周期：进动速率为0.8μm/s的果蝇驱动蛋白和进动速率为1.2μm/s的大肠杆菌驱动蛋白。我们测量聚合物-混合纳米颗粒-标记的微管和含有荧光微管蛋白的微管的进动速率。荧光标记的微管和聚合物-混合纳米颗粒-标记的微管的速率相同的。偏振敏感纳米颗粒似乎并不抑制驱动蛋白功能。测量的微管扭结长度的直方图示于图5B，并且扭结长度的测量分布在较慢的果蝇和较快的大肠杆菌驱动蛋白之间保持一致。详细地，(A)部分显示由结合至玻璃基材的驱动蛋白移动的滑动微管。偏振敏感纳米颗粒连接至微管内的生物素化的微管蛋白。(B)部分显示当由2种不同形式的驱动蛋白运输微管时测量的微管旋转周期。有62个使用大肠杆菌驱动蛋白测量的微管和131个使用果蝇驱动蛋白测量的微管，分别伴随有64个和148个非旋转微管。(C)部分显示单个微管的踪迹，其中单一结合的聚合物混合纳米颗粒(空心圆圈)显示了局部强度最大值，同时虚线圆圈显示在观察的通道之一中局部强度最小值的位置。由聚合物混合纳米颗粒发射的局部强度最大值之间的距离确定扭结，并且不计数，除非在3个局部强度最大值之间记录至少2个相同长度的连续周期。同时，局部强度最大值和最小值必须变化至少50％，其代表了在旋转过程中约0.75弧度的混合纳米颗粒吸收/发射偶极取向变化。与果蝇和大肠杆菌驱动蛋白结合的旋转微管的观察数量分别是131和62。与周期性显示亮和暗发射的偏振敏感纳米颗粒一起，大量的混合纳米颗粒显示连续发射同时与行进的微管结合。这可能是由于观察由13个原纤维制成的微管，其不具有对准微管的混合纳米颗粒的吸收/发射偶极或扭结。前一种情况被认为不太可能，因为在一些情况中几个偏振敏感纳米颗粒标记单一微管并且具有多个标记物的各微管显示出来自全部结合的混合纳米颗粒的周期性或恒定发射。观察了与果蝇驱动蛋白结合的171个非旋转微管和与大肠杆菌驱动蛋白结合的69个非旋转微管。图5C是用单个聚合物混合纳米颗粒标记的微管的踪迹，显示了随着微管旋转交替的亮和暗点。

用10％生物素化的微管蛋白聚合微管，其允许链霉亲和素-官能化的偏振敏感纳米颗粒和微管之间的强结合。由于高密度的生物素化的微管蛋白以及偏振敏感纳米颗粒和微管蛋白单元的尺寸，可能各聚合物混合纳米颗粒通过超过一个生物素/链霉亲和素连接结合至微管。实际上，快速零星强度波动不是可见的，其将是与微管灵活接合的偏振敏感纳米颗粒的“旋桨效应”或单个生物素/链霉亲和素连接的证据。

图8是单个聚合物混合纳米颗粒和单个量子混合纳米颗粒的强度时间踪迹。PFBT混合纳米颗粒与静止微管结合并且显示几乎没有闪烁和单一光致漂白事件。使用的混合纳米颗粒在被动吸附至玻璃盖玻片时确实显示间歇性闪烁，但是在生物共轭的混合纳米颗粒与微管结合时这种闪烁几乎完全熄灭。虽然这种PFBT混合纳米颗粒的亮度高于量子混合纳米颗粒，单颗粒亮度测量显示它们具有相当的平均亮度。

图9显示了偏振敏感纳米颗粒和Q混合纳米颗粒525的单颗粒亮度直方图比较。偏振敏感纳米颗粒和525nm发射量子混合纳米颗粒的平均亮度分别是3035±424(n＝178)和3020±492(n＝179)。