伤口愈合与组织工程

摘要

本发明涉及与干细胞群共移植的伤口愈合骨架，其中所述干细胞群为ABCB5+干细胞。所述骨架例如为胶原蛋白糖胺聚糖骨架。

说明书

相关申请

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2013年5月10日提交的名称为 “WOUNDHEALINGANDTISSUEENGINEERING”的美国临时申请 序列No.61/822134的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

政府资助

本发明是在由NIH/NCI授予的资助号5R01CA113796的政府支持下 完成的。政府对本发明享有某些权利。

技术领域

本发明涉及用于伤口愈合与组织工程的方法和组合物，涉及胶原蛋白 糖胺聚糖骨架中的ABCB5阳性干细胞。

背景技术

再生医学涉及使用外源材料(例如骨架)对组织和器官进行修复、再 生、维持及替换。可用细胞(例如原代细胞或干细胞)及多种因子接种骨 架以促进组织生长。然而，在设计用于再生医学和组织工程的合适材料中 还存在很多挑战。

在美国每年会产生超过一百万的新慢性伤口，据估计治疗花费达数十 亿美元。可将伤口概念化为单个器官或器官系统之保护性覆盖物的缺陷。 缺少该生理学屏障，通常被该覆盖物保护的组织就会经受生物区室化的损 失。当组织不再生理上区室化时，其就会经受流体损失、微生物入侵、电 解质紊乱及某些情况下的代谢功能障碍。未区室化组织损失的流体包括但 不限于：血液、血浆、淋巴、肠内含物、胆汁、脑脊液、粘液。这些流体 损失导致下方组织干燥并使得微生物能够入侵，从而导致潜在感染及许多 情况下的进行性组织损失。例如，下肢的慢性皮肤伤口不能愈合会导致受 影响肢体之部分或全部的截肢。这种慢性下肢皮肤伤口的病因有很多，包 括机械创伤、烧伤、辐射、动脉功能不全、静脉淤滞、慢性感染、神经病 及全身性疾病(如糖尿病)。当前改善伤口愈合的方法强调有效引流、防 止感染、减轻炎症及最小化组织和流体损失。

慢性皮肤伤口对患有不同医学病症(例如糖尿病、烧伤、创伤(如战 时持续的创伤)、脊髓损伤及血管功能不全)的患者造成重大健康问题。 这些患者中的一些处于发生由于固定和压力性溃疡造成的慢性伤口以及 由糖尿病或外周血管疾病造成的慢性非愈合性溃疡的风险。对出生后人皮 肤中损伤的默认响应是通过伤口迅速闭合的必要性驱动的，并且一定会导 致疤痕的形成。虽然疤痕对于皮肤屏障功能的恢复是足够的，但是疤痕经 常会通过用结缔组织替换必要皮肤结构而损害其他正常功能。在胎儿时 期，在其中产生皮肤的更具保护作用的环境是沐浴在无菌羊水中，人的皮 肤完全有能力无瘢痕再生，即再生性伤口愈合。目前对成体干细胞固有可 塑性的理解认为可在出生后复制这种现象。

发明内容

本发明包括且至少部分地基于以下发现：当单独使用或者在生物可降 解骨架的情况下使用时，表达ABCB5的干细胞示出分化可塑性并且进一 步增强伤口愈合和/或组织再生。

在某些方面，本发明为伤口愈合骨架，其包含与干细胞群共移植的胶 原蛋白糖胺聚糖骨架(collagenglycosaminoglycanscaffold)，其中所述 干细胞群的至少80％为ABCB5+干细胞。

在另一些方面，本发明为伤口愈合骨架，其包含与干细胞群共移植的 胶原蛋白糖胺聚糖骨架，其中所述组合物之少于50％的细胞为ABCB5(-) 干细胞。

在另一些方面，本发明为伤口愈合骨架，其包含与ABCB5+干细胞 群共移植的胶原蛋白糖胺聚糖骨架，其中所述细胞群包含少于5％的角质 形成细胞和/或表皮细胞。

本发明的另一些方面提供了伤口愈合骨架，其包含与ABCB5+眼干 细胞群共移植的胶原蛋白糖胺聚糖骨架，其中所述细胞群不含非眼细胞。

另一些方面提供了伤口愈合骨架，其包含与从对象的组织分离的 ABCB5+干细胞群共移植的胶原蛋白糖胺聚糖骨架，其中使用ABCB5的 特异性抗体将ABCB5+干细胞与对象的其他细胞分离。

ABCB5+干细胞可为ABCB5+真皮间充质干细胞。在一些实施方案 中，所述干细胞群的至少85％或90％为ABCB5+干细胞。

在一些实施方案中，所述骨架为交联的胶原蛋白和糖胺聚糖的多孔基 质。胶原蛋白可例如为牛腱胶原蛋白。在一些实施方案中，所述糖胺聚糖 选自6-硫酸软骨素、4-硫酸软骨素、肝素、硫酸肝素、硫酸角蛋白、硫酸 皮肤素及其组合。

骨架可包含半透层(semi-permeablelayer)，例如聚硅氧烷(硅酮 (silicone))。在另一些实施方案中，所述骨架为网状(mesh)骨架。 任选地，可以使骨架成形以用于插入组织。

在一些实施方案中，所述骨架为MeshedBilayerWound Matrix。

骨架可具有不同的孔径，例如，骨架的孔径可为约10至500微米或 约50至350微米或约70至200微米。

骨架可包含至少一种有效增强伤口愈合的生物活性分子，例如，生物 活性分子可以为选自以下的成员：生长因子、抗炎剂、伤口愈合剂、抗疤 痕形成剂、抗微生物剂、细胞粘附肽、组织生成调节细胞(tissuegeneration modulatingcell)、核酸、核酸类似物、蛋白质、肽、氨基酸、陶瓷(ceramic) 及其组合。

在一些实施方案中，所述骨架的尺寸为2英寸×2英寸(25平方厘米)、 4英寸×5英寸(125平方厘米)、4英寸×10英寸(250平方厘米)或8 英寸×10英寸(500平方厘米)。

本发明的另一些方面提供了促进伤口愈合的方法，其通过使伤口与本 文所述的伤口愈合骨架接触以促进愈合来实现。在一些实施方案中，所述 接触包括向出血部位施加所述组合物以控制出血。

在一些实施方案中，所述伤口为烧伤或糖尿病性溃疡。

在一些实施方案中，将负压伤口疗法与骨架一起使用。

在另一些实施方案中，所述方法可包括随后用可医用覆盖物 (medicallyacceptablecovering)固定伤口以处理所述伤口。

伤口可选自部分厚度伤口和全厚度伤口、压力性溃疡、静脉溃疡、糖 尿病性溃疡、慢性血管溃疡、隧道性/潜伏性伤口(tunneled/undermined wound)、手术伤口、创伤伤口(traumawound)及引流伤口。

在另一些方面，本发明为用于组织工程的方法，其通过用ABCB5+ 干细胞接种胶原蛋白糖胺聚糖骨架，并且在使组织形成的条件下维持所述 骨架来实现。在一些实施方案中，所述组织工程的方法是用于组织再生的 方法，并且在使组织再生的条件下维持骨架。在另一些实施方案中，所述 组织再生的方法是用于治疗衰老皮肤的方法。

本发明的另一些方面提供了用于组织工程的方法，其通过用ABCB5+ 干细胞接种生物学组织骨架并且在使组织形成的条件下维持所述骨架来 实现。

生物学组织骨架可例如为同种异体移植物或自体移植物、异种组织和 /或脱细胞化的(decellularize)组织。

考虑结合附图，通过下面对本发明的多个非限制性实施方案的详细描 述，本发明的其他优势和新特征将变得明显。在本说明书和通过引用并入 的文件包含冲突和/或不一致公开内容时，应以本说明书为准。

本文公开了向对象施用组合物以治疗特定病症的多种方法。应该理解 在本发明的每一这样的方面，本发明还具体包括用于治疗特定病症的组合 物以及所述组合物用于制备用于治疗该特定病症之药物的用途。

本发明并不将其应用局限于下文说明书提出的或附图所示的结构细 节或组件布置。本发明适用于其他实施方案并且能以不同方式实践或实 施。另外，本文使用的措辞和术语是为了描述的目的，不应看作是对本发 明的限制。本文中“包括”、“包含”或“具有”、“含有”、“涉及” 及其变体的使用意在涵盖其后列出的项和其同等物以及附加项。

附图说明

附图并未旨在按比例绘制。图中，各图中所示的各个相同的或几乎相 同的组成部分用相同数字表示。为了清楚起见，并非在每一幅图中都标记 每个组成部分。附图中：

图1.ABCB5+细胞的多能分化潜能。前三行：分化前及分化后，表达 血影蛋白(肌发生测定)、CD31(血管发生测定)和TUJ1(神经发生测 定)的ABCB5+(左图)或ABCB5-(右图)人皮肤细胞的免疫荧光染色。 通过DAPI观察细胞核。底部两行：分化前及分化后，ABCB5+(左图) 或ABCB5-(右图)人皮肤细胞的油红(脂肪生成测定)和茜素红(骨发 生测定)染色。在重复试样(n＝3)中对每个标志物的像素强度(在肌 发生测定、血管发生和神经发生测定中)或阳性染色细胞百分比(在脂肪 生成和骨发生测定中)的综合分析示于右边的柱形图中。＊，P＜0.05。

图2.鼠ABCB5基因座和蛋白质拓扑结构的示意图。鼠Abcb5基因 包含28个外显子并且在12qF2基因座处跨越102kb的基因组DNA。其 编码含有11个跨膜螺旋和5个胞外环的1255AA蛋白质。外显子23编码 AA911-957，其形成含有3C2-1D12抗-ABCB5抗体结合表位的胞外环。

图3.对Abcb5WT(上图)和Abcb5KO(下图)小鼠的分析。H&E 染色示出KO动物中具有减少的皮下脂肪和无序平滑肌系统的真皮变薄 (WT和KO试样采用相同的放大率)。IHC和流式细胞术示出 Abcb5null/null小鼠中Abcb5蛋白的表达完全丧失。罗丹明-123流出研究 (effluxstudy)鉴定了Abcb5null/null小鼠中一种新的保持染料细胞群 (R1设门，右下图)，这与罗丹明-123流出1丧失特征Abcb5功能一致。

图4A-4C.ABCB5对干细胞静止期的调控。鼠皮肤细胞的代表性双色 流式细胞术分析，所述鼠皮肤细胞来自体内标记有BrdU的Abcb5WT(B) 和Abcb5KO(C)小鼠及未标记的Abcb5WT对照(A)。用抗-BrdUFITC 抗体和7-AAD共染色细胞。R1设门示出Brdu-阳性细胞处于细胞周期的 G0期。R2设门示出Brdu-阴性细胞处于细胞周期的S/G2/M期。

图5A-5B.涉及Abcb5KO小鼠和Abcb5WT小鼠细胞周期调控的基 因差异表达。(A)通过实时PCR分析测定的Abcb5KO相对于Abcb5WT 小鼠的下调基因列表。(B)这里描述的是Abcb5KO小鼠中下调的基因。 带箭头的线示出已知的基因相互作用。用不带箭头的线对典型途径(例如 p53信号转导、G1/S检查点调控、细胞周期蛋白和细胞周期调控、钙信 号转导途径)的基因关系进行标注。基因关系和相互作用以Ingenuity PathwayAnalysis(Ingenuity，CA)为基础。

图6A-6C.Abcb5KO和Abcb5WT小鼠的创伤愈合比较分析。(A) Abcb5WT(上图)和Abcb5KO(下图)小鼠中产生的全厚度皮肤伤口 之第0天和第7天的代表性数码照片。(B)在实验第7天时，从Abcb5WT (上图)和Abcb5KO(下图)小鼠收获的位于皮肤和下方肌肉组织周围 之中央伤口截面的代表性H&E染色。(C)Abcb5KO和Abcb5WT伤口 的伤口闭合(上图)和炎性基质厚度(下图)的定量分析。

图7A-7C.Abcb5KO和Abcb5WT小鼠的CD31表达比较分析。(A) 和(B)，在实验第7天时，从Abcb5WT(上图)和Abcb5KO(下图)小 鼠收获的位于皮肤和下方肌肉组织周围之中央伤口截面的代表性H&E和 CD31染色。(C)Abcb5KO和Abcb5WT伤口中CD31+血管层厚度(上 图)和CD31-无血管层厚度(下图)的定量分析。

图8.Abcb5KO和Abcb5WT小鼠中血管形成的比较分析。在实验 第7天时，从Abcb5WT(左图)和Abcb5KO(右图)小鼠收获的组织 之中央伤口截面血管层的代表性CD31染色。

图9A-9B.Abcb5KO相对于WT小鼠伤口中参与血管发生的基因差 异表达。(A)通过实时PCR分析测定的基因表达水平。(B)示出并标记 Abcb5KO伤口中下调的促血管发生细胞因子。箭头表明促血管发生作 用。Abcb5KO伤口中过表达的抗血管发生跨膜受体Bai1。底部的柱状图 表示抗血管发生作用。基因关系以IngenuityPathwayAnalysis(Ingenuity， CA)为基础。

图10A-10D.ABCB5+细胞对NSG小鼠中伤口愈合的作用。(A)四个 实验组中所遭受伤口的炎性基质厚度的定量分析。(B)在实验第14天时收 获的伤口截面的代表性H&E染色。(C)移植后14天，通过人特异性β2M 来检测注射入基质的人细胞。黑色箭头指向β2M+人细胞簇 和单个β2M+人细胞。(D)鼠伤口关于人特异性GAPDH、β2-微球蛋白及 用作上样对照的鼠β-肌动蛋白之所有表达的RT-PCR分析。

图11A-11C.示出植入后8周在小鼠背上建立的人皮肤移植物的人-小 鼠异种移植模型(A)。(B)中示出证明人-鼠皮肤吻合的相应组织病理学。人 异种移植的伤口(C)能够使得在受伤后为第0、2、4和7天的时间点对特 定真皮细胞和胞外基质成分进行免疫组织化学检测(从上至下)。

图12.ABCB5在人再生伤口愈合中的作用。可确定检查因疤痕形成 和骨架诱导的再生(scarv.scaf)导致之愈合响应的免疫组 织化学谱的比较研究(注意到具有骨架的伤口中表达肌动蛋白之肌成纤维 细胞的显著重排及ABCB5+真皮细胞明显增强的表达)。

具体实施方式

本发明部分地基于以下发现：用ABCB5阳性干细胞接种胶原蛋白糖 胺聚糖骨架证明增强的伤口愈合和组织工程性质。已经示出本发明的构建 体具有导致组织合成的独特再生活性。增强的组织合成对组织的修复和产 生及伤口修复和愈合有用。

根据本发明可用的细胞为ABCB5阳性干细胞。ABCB5是一种用于 从正常人组织中分离多能干细胞群的新的重要的标志物。本文所用的 “ABCB5(+)干细胞”是指具有自我更新和分化成多种成体细胞谱系的成 熟细胞之能力的细胞。这些细胞的特征在于在细胞表面上表达ABCB5。 在本发明的一些实施方案中，ABCB5(+)干细胞为真皮干细胞或眼干细胞。

本文使用的“ABCB5阳性真皮间充质干细胞”是指具由自我更新和 分化成多种成体细胞谱系的成熟细胞(例如骨、脂肪及软骨)之能力的皮 肤细胞。这些细胞的特征在于在细胞表面上表达ABCB5。在培养中，可 使用特定培养基诱导间充质干细胞分化成骨、脂肪、软骨或肌肉细胞。 (HirschiKK和GoodellMA.GeneTher.2002；9：648-652.PittengerMF等， Science.1999；284：143-147.SchwartzRE等，JClinInvest.2002；109： 1291-1302.HirschiK和GoodellM.Differentiation.2001；68：186-192.)。

ABCB5阳性真皮间充质干细胞可从皮肤中获得。皮肤可来源于具有 皮肤的任何对象，但是在一些实施方案中优选人皮肤。皮肤可来源于任何 年龄的对象，但是在一些实施方案中优选成体皮肤，而不是青少年或婴幼 儿皮肤。

在本发明的另一些实施方案中，ABCB5(+)干细胞为视网膜干细胞。 ABCB5(+)干细胞可获自(例如，分离自或衍生自)眼睛的基底缘上皮或 视网膜色素上皮(RPE)。在一些实施方案中，ABCB5(+)干细胞获自人眼。 另一些ABCB5(+)干细胞(例如从中央角膜获得的那些)可用于本发明的 多个方面和实施方案。

ABCB5(+)干细胞可为分离的。本文中使用的“分离的ABCB5(+)干 细胞”是指从最初发现所述细胞的生物体中取出的细胞或这样的细胞的后 代。分离的细胞也指处于自然环境以外的条件中的细胞。以后可将这样的 细胞引入第二生物体或重新引入分离出所述细胞(或者所述细胞起源的细 胞或细胞群)的生物体。一旦根据本发明的方法操作，这样的细胞仍然被 认为是分离的细胞。术语“分离的”不排除细胞随后与其他细胞组合或混 合或在体内环境中的后续使用。

ABCB5(+)干细胞可如下从对象获得：分离组织样品(包括皮肤细胞 (例如真皮细胞)和基底缘上皮或RPE的眼细胞)，接着纯化ABCB5(+) 干细胞。本领域的普通技术人员应理解可以以多种方式富集样品中的 ABCB5+干细胞。例如，可使用抗体或与细胞上之ABCB5细胞表面分子 结合的其他结合分子来选择干细胞。干细胞可直接从供体获得或可从冷藏 储库中取出。例如可使用抗ABCB5抗体分离干细胞，并使用标准方法维 持培养或冷冻在例如液氮中以后续使用。

具体而言，例如可使用已建立的灵敏且特异性的ABCB5单克隆抗体 (mAb)从健康人皮肤的手术试样分离具有间充质干细胞分子表型的纯 ABCB5+真皮细胞群。分离的ABCB5+真皮干细胞具有多能分化能力，以 使得它们分化成全部三个胚层(即外胚层、中胚层和内胚层)的细胞谱系。

本发明考虑使用ABCB5-结合分子(例如单克隆抗体、多克隆抗体、 人抗体、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、F(ab′)2、Fab、Fd、Fv或 单链Fv片段)来从混合细胞群中分离ABCB5(+)干细胞的任何合适方法。 因此，方法包括产生ABCB5(+)干细胞群的方法，其包括以下步骤：提供 细胞的细胞悬浮液；将细胞悬浮液与识别ABCB5(+)细胞上的表位(包括 ABCB5)的单克隆抗体或单克隆抗体的组合接触；以及从细胞悬浮液中 分离和回收与单克隆抗体结合的细胞。单克隆抗体可与固相连接并且用于 捕获ABCB5+干细胞。然后可以根据抗体和固相的性质通过已知的方法从 固相分离结合的细胞。

本文使用的“单克隆抗体”是指从与抗原的相同表位结合的免疫球蛋 白的单个克隆群获得的抗体。适合用于制备本发明细胞群的基于单克隆的 系统包括利用抗体的磁性珠/顺磁性颗粒柱以进行阳性或阴性选择；基于 生物素或链霉亲和素亲和力的分离；以及在其他细胞悬浮液中混合的免疫 荧光染色之LSC的高速流式细胞术分选。因此，本发明的方法包括使用 针对表面抗原ABCB5而产生的单克隆抗体(例如选择性结合ABCB5的 单克隆抗体)分离细胞群以及增强。在某些情况下，选择性结合ABCB5 的市售抗体或抗体片段可用于本文公开的方法。如果同单克隆抗体可与其 他抗原(即除ABCB5外的抗原)结合的亲和力相比，其以更大的亲和力 与ABCB5结合或能够与ABCB5结合，则认为所述抗体与ABCB5选择 性结合。这样的结合可通过标准蛋白-蛋白相互作用测定(如抗体-抗原或 配体-受体测定)来测量或确定，例如竞争性测定、饱和测定或标准免疫 测定，所述标准免疫测定包括但不限于酶联免疫吸附测定、放射免疫测定 及放射-免疫-过滤结合测定。

ABCB5(+)干细胞可被制备为基本纯的制备物。本文使用的术语“基 本纯的”是指制备物中基本不含除ABCB5(+)干细胞外的细胞。例如，基 本纯的ABCB5(+)干细胞制备物可构成这样的制备物，其中所述制备物中 总细胞的至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至 少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至 少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的百分比为ABCB5(+) 干细胞。

本发明的组合物(composition)包含基底，例如促进伤口愈合的生 物相容性材料，包括生物可降解骨架。可将ABCB5(+)干细胞添加至基底 或骨架以形成例如用于移植的组织或组织移植物。骨架是含有胶原蛋白和 糖胺聚糖的高度多孔的晶格，即胶原蛋白糖胺聚糖基质或骨架。胶原蛋白 糖胺聚糖骨架的实例包括美国专利号4,060,081、4,280,954及4,505,266中 列出的那些。可用于胶原蛋白糖胺聚糖骨架的其他材料包括但不限于6- 硫酸软骨素、4硫酸软骨素、肝素、硫酸肝素、硫酸角蛋白、硫酸皮肤素、 几丁质及脱乙酰壳多糖。胶原蛋白糖胺聚糖骨架充当从组织腔内迁移血管 及其周围组织细胞至其中的支持或骨架结构，这个过程称为“浸润 (infiltration)”。浸润负责产生新组织，随着骨架生物降解，其将代替骨 架。

在一些实施方案中，骨架为是FDA批准 的包含胞外基质(胶原蛋白和GAG)的非细胞真皮皮肤替代物。其已被 用于处理多种组织缺陷或非愈合性伤口(如静脉性下肢溃疡)。

本文的“组合物”是指分离的细胞制备物或骨架，包括组织骨架和人 造骨架。在某些情况下，本发明的组合物富含分离的ABCB5(+)干细胞。 如果ABCB5(+)干细胞是存在于制备物中的主要细胞亚型，则认为组合物 富含分离的ABCB5(+)干细胞。例如，富含ABCB5(+)干细胞的组合物是 这样的组合物，其中组合物之至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、 至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、 至少98％、至少99％或100％的细胞为ABCB5(+)干细胞。在一些实施方 案中，富含分离的ABCB5(+)干细胞的组合物是这样的组合物，其中组合 物之少于50％、少于45％、少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、 少于20％、少于15％、少于10％、少于9％、少于8％、少于7％、少于 6％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％或少于1％的细胞为ABCB5(-) 细胞。在一些实施方案中，组合物的细胞仅是真皮细胞。例如，用细胞接 种骨架以使得所有细胞是ABCB5+真皮细胞。也就是说，在一些实施方案 中，组合物可不含非真皮细胞。在一些实施方案中，细胞不含角质形成细 胞和/或表皮细胞。在一些实施方案中，组合物的细胞仅是眼细胞。也就 是说，在一些实施方案中，组合物可不含非眼细胞。在一些实施方案中， 组合物可不含ABCB5(-)眼细胞。

可以以多种方式格式化(format)本发明的骨架，例如，单片、包含 多层的层压片或胶原蛋白片。在某些实施方案中，骨架包含2至15个片， 可通过缝线或缝合线将这些片保持在一起。

在一个特定实施方案中，聚合物进一步包含生物活性分子，例如除干 细胞以外的小分子或肽。生物活性分子可非共价地并入到聚合物中，例如 可作为悬浮液、包封为颗粒、微颗粒或胶体或者其混合物。使用任何合适 的化学将生物活性分子附着到聚合物，也可将生物活性分子共价地并入到 聚合物中。生物活性分子可为任何治疗上需要的分子，例如生长因子、抗 微生物剂、止痛剂、止血剂、促血管发生剂或抗血管发生剂。在一些示范 性的实施方案中，聚合物包含FGF2、NGF、多西环素、阿莫西林和聚-L- 赖氨酸中的一种或更多种。

在另一个特定实施方案中，骨架的宽度为至少10cm。例如骨架的宽 度可为至少10cm，且长度可为至少10cm，因此，某些骨架的表面积可 大于100cm²(如4002)。本发明骨架的双轴强度可为至少80N或更大。

本发明中的组织骨架可用于多种应用，包括但不限于覆盖组织缺陷或 伤口、增强组织(例如软组织)及器官/组织产生或再生。因此，在另一 个方面，本发明的特征在于诱导修复受损组织的方法，所述方法包括使受 损组织与本发明骨架相接触。本发明的另一些特征在于促进软组织再生的 方法，所述方法包括使软组织与本发明骨架相接触。当骨架与组织接触时， 骨架可提高位于所述骨架周围之细胞的增殖。另外，骨架可促进其粘附的 组织内的血管形成。因此，在另一个方面，本发明提供了促进组织中细胞 增殖的方法，所述方法包括使组织与骨架接触以刺激细胞增殖。本发明另 外还提供了诱导组织血管形成的方法，所述方法包括使组织与骨架接触以 使组织内发生血管形成。

可将骨架成形以填充组织缺陷。在大多数情况下，这可通过使用剪刀 或刀修剪聚合物纤维来实现；或者，骨架可由聚合物溶液浇铸，所述聚合 物溶液通过加热或溶解在挥发性溶剂中形成。

通过将细胞悬浮液施加到骨架来将间充质干细胞接种到骨架上。这可 通过将骨架浸泡在细胞培养容器中、或者将细胞注射或另外直接施加到骨 架来实现。

使用标准的手术技术将接种了细胞的骨架植入缺陷部位。可以在植入 前在体外接种和培养骨架，接种并且立即植入骨架，或者植入骨架然后用 细胞接种。在一个实施方案中，将细胞接种到骨架上或骨架中并在体外培 养大约16小时至2周，但是时间可以更长。在此情况下，接种时或植入 时的细胞密度可以变化。例如，细胞密度可为约25,000个细胞/mm³。技 术人员将知晓适当的细胞密度。

本文中使用的对象可为哺乳动物，例如人、非人灵长类动物、牛、马、 猪、绵羊、山羊、狗、猫或啮齿类动物。人ABCB5(+)干细胞和人对象是 特别重要的实施方案。

在一些实施方案中，分离的ABCB5(+)干细胞(例如作为ABCB5(+) 干细胞移植物形式的组合物或作为向植入移植物递送的细胞制备物)可向 对象施用超过一次。因此，在一些实施方案中，可在几周、几个月或几年 内向对象施用分离的ABCB5(+)干细胞的多个剂量或移植物(如，2个、3 个、4个或者更多)。在一些实施方案中，在首次施加后3个月、6个月、 9个月、12个月、18个月、21个月或24个月再次施用干细胞。施加的数 量和施加的频率可取决于例如首次干细胞施用/移植后获得的细胞再生程 度。干细胞施加的数量和频率可由医学专业人员(例如外科医生、医师) 确定。

本发明的组合物(接种有ABCXB5+干细胞的骨架)可用于伤口愈合。 皮肤和其他器官系统中的大部分伤口的特征在于保护性外层以及下面的 层和组织中细胞和结缔组织基质的损失。在皮肤伤口的情况下，表皮是损 失的外层。表皮覆盖真皮以及更深的结构，例如脂肪、肌肉和骨。皮肤和 其他器官系统中大伤口的闭合通常需要产生数十亿的细胞、穿过血管网络 的营养物以及存在于新生胞外基质(ECM)中的蛋白质和糖胺聚糖的机械 强度。

按照本文目的，术语“伤口”泛指对器官或器官系统的损伤。在皮肤 的情况下，所述损伤可为表皮、真皮和/或皮下组织的损伤。根据伤口深 度，可将皮肤伤口分为以下四个等级之一：i)等级I：限于上皮的伤口；ii) 等级II：延伸至真皮的伤口；iii)等级III：延伸至皮下组织的伤口；以及 iv)等级IV(或全厚度伤口)：暴露骨的伤口(例如骨压力点(如大转子 (greatertrochanter)或骶骨))。术语“部分厚度伤口”是指涵盖等级 I-III的伤口；部分厚度伤口的实例包括烧伤伤口、压力溃疡、静脉淤滞 溃疡及糖尿病性溃疡。术语“深伤口”包括等级III和等级IV伤口。可 用本发明方法处理所有等级的伤口，包括慢性和急性伤口。术语“慢性伤 口”是指30天内未愈合的伤口。

按照本文目的，术语“促进伤口愈合”是指能够使得器官或器官系统 的正常生理屏障重构。在皮肤伤口的情况下，促进伤口愈合可包括诱导肉 芽组织形成、和/或诱导伤口收缩、和/或诱导血管再形成和/或诱导表皮形 成(即表皮中新细胞的产生)。在一些实施方案中，ABCB5+细胞可至少 部分通过介体(如VEGF)的分泌发挥其功能。

通过本发明方法处理的伤口类型包括多种伤口，包括但不限于：手术 伤口、创伤伤口、辐射损伤伤口、中毒性表皮坏死伤口、感染性伤口、瘤 性伤口、全厚度伤口、部分厚度伤口和烧伤伤口以及由多种类型溃疡产生 的伤口，所述溃疡例如为皮肤溃疡、角膜溃疡、动脉阻塞性溃疡、持续压 力诱发的褥疮溃疡和糖尿病性溃疡、烧伤溃疡、损伤溃疡、辐射溃疡、药 物诱发溃疡、术后溃疡、炎性溃疡、胃肠道溃疡、单纯溃疡和其他类型的 血管性溃疡以及慢性(顽固性)溃疡。

本发明中多个实施方案的方法可特别用于处理复杂伤口或难愈性伤 口。很多因素可不利地影响伤口愈合过程，包括感染、经辐射的组织、全 身性疾病、药物、患者年龄、患者健康及对象的营养状态。另外，任何阻 碍外周血液循环的过程(例如动脉硬化、长期压力、静脉曲张疾病及静脉 淤滞)可对在受伤对象中介导愈合的氧、营养物、化学信号及合适细胞类 型的递送产生不利的影响，将损害伤口愈合。抑制伤口愈合的因素包括伤 口干燥、药物(例如化疗或类固醇)、及患者不良的健康和/或营养。某 些部分厚度损伤和全厚度损伤(如烧伤、皮肤移植物及不同类型的溃疡) 抵抗修复并对患者产生明显的疼痛和不适。

患者的一般身体状况对伤口愈合也非常重要。随着年龄的增长，因为 皮肤变得更薄以及成纤维细胞数目和总皮肤胶原蛋白量的降低，修复损伤 组织的能力就会下降。疾病状态(例如酗酒、贫血、糖尿病、营养不良、 休克及尿毒症)导致对伤口部位受损的氧和营养物递送，从而抑制愈合过 程。另外导致单核细胞减少症的疾病会显著损害伤口愈合。

用于治疗病症的药物可产生受损的伤口愈合。用于清除癌症患者中分 裂的细胞的化疗也可阻抑这样的患者也依赖于新细胞生长之愈合伤口的 能力。类固醇不利地影响伤口修复的全部三个阶段，抑制最初的炎性反应， 延缓新表皮和血管组织的产生，以及削弱瘢痕组织中的胶原蛋白基质。

细菌伤口感染是延长伤口愈合的常见局部原因。人皮肤通常会集居大 量的微生物，包括白色念珠菌(Candidaalbicans)、表皮葡萄球菌 (Staphylococcusepidermidis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) 及一些链球菌(Streptococcus)菌株。因此，任何将下方组织暴露于环境 的伤口受到至少驻留微生物菌群的感染。高度血管化组织中被良好护理的 伤口抵抗感染，然而局部缺血组织中的伤口却相当容易受到感染。

在一些实施方案中，对象可具有皮肤伤口。在另一些实施方案中，对 象可患有眼病症例如角膜上皮中的眼伤口(例如，死亡的、受伤的或受到 感染的眼细胞)。因此，根据本发明，患有眼病症的对象的角膜上皮可受 伤。

在一些实施方案中，本发明的骨架可与对伤口施加压力的装置组合。 必要时，可以使用以稳定方式或时间依赖性方式机械地诱导张力或压缩的 装置使伤口内的细胞受到受控制的拉力。为了对伤口表面施加受控的局部 力，可使用具有与例如基质内的微结构(例如，微室)流体连接的大量微 通道的装置，所述基质可以置于伤口表面上。通过微通道控制施加于每一 个微室的真空压力(或正压力)。按照本文目的，术语“真空压力”是指 目的室或材料中的压力，其在量级上低于参照腔室、材料、组织或气氛中 的压力。按照本文目的，术语“正压力”是指目的腔室或材料中的压力， 其在量级上高于参照腔室、材料、组织或气氛中的压力。按照本文目的， 术语“压力”旨在涵盖真空压力和正压力。在用装置施加压力之前、之后 或间歇，可对伤口施加本发明的骨架。

伤口愈合包括纤维蛋白凝块形成、炎性细胞的募集、再上皮化以及基 质形成和重塑。紧接组织损伤之后，血管破坏导致血液溢出和伴随的血小 板聚集和血液凝固，致使纤维蛋白凝块形成。受困于纤维蛋白凝块的活化 血小板脱粒并释放多种细胞因子和生长激素。这些细胞因子和生长激素有 助于将炎性细胞募集至损伤部位，有助于促进血管发生，以及有助于起始 与再上皮化和结缔组织收缩有关的组织运动。

通过大量的趋化信号将嗜中性粒细胞和单核细胞募集至损伤部位，所 述趋化信号包括由脱粒血小板释放的生长因子和细胞因子、裂解于细菌蛋 白质的甲酰甲硫氨酰肽以及纤维蛋白蛋白水解作用的副产物和其他基质 蛋白质。几天以后嗜中性粒细胞浸润停止，但通过单核细胞持续募集至伤 口部位，巨噬细胞继续累积。活化的巨噬细胞释放生长因子和细胞因子， 从而放大来自于脱粒血小板的早期信号。可将外源因子施加于伤口以辅助 这些过程。

因此，本发明的一些实施方案也包括涉及使用可溶性因子和ABCB5+ 细胞的方法。在将装置置于伤口上之后，添加至装置的可溶性因子(例如， 生长因子，如表皮生长因子、细胞因子、PGDF、胰岛素样生长因子、 TGF-β、角质形成细胞生长因子细胞因子、TNF、趋化因子、趋化肽、金 属蛋白酶的组织抑制剂等)进入组织中。

已经注意到大量重组生长因子可加速动物模型中急性和慢性伤口二 者的伤口愈合过程。这些重组衍生因子包括血小板衍生生长因子(PDGF)、 成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)以及转化生长因子α和 β(TGF-α和TGF-β)。此外，另一些重组生长因子(包括胰岛素、胰岛 素样生长因子I和II(分别为IGF-I和IGF-II)、干扰素(IFN)、白细胞 介素(IL)、角质形成细胞生长因子(KGF)、巨噬细胞集落刺激因子 (M-CSF)、血小板衍生内皮细胞生长因子(PD-ECGF)以及及干细胞因子 (SCF))可促进伤口愈合过程中涉及之细胞类型的活化、增殖和/或刺激。

可溶性因子可为蛋白质或可以在细胞中表达。蛋白质、肽或多肽是指 氨基酸的聚合物，并且这些术语可互换使用。聚合物可包含天然和非天然 氨基酸。蛋白质或多肽可在体内或体外通过天然、重组、合成或其他方式 产生。蛋白质或多肽可具有翻译后修饰或可以被化学修饰以包括磷酸化、 糖基化、法尼基化、乙酰化、甲基化、硫醇氧化等。

本发明组合物的另一个用途是在组织再生方面。伤口愈合可通过组织 修复或组织再生完成。相较于经常导致疤痕形成的修复，组织再生提供正 常结构完整的形态和功能恢复。出生后，自发性组织再生不再发生，然而 其可至少部分地借助于外源生物学基质来发生，例如骨架，临床上称为 (IntegraLifeSciences，Plainsboro，N.J.)，美国食品药品管理 局已经批准其用于大面积烧伤患者，以及用于对重构缺损和慢性伤口的处 理。再生的皮肤为机械上有效、完全血管化以及对触摸、热或冷⁶敏感， 但是其缺乏关键皮肤附属结构，例如毛囊和汗腺⁵。

凭借再生响应相关之多潜能干细胞群的提高的局部可用性，包含 ABCB5-阳性干细胞的移植物(而不是ABCB5-缺陷真皮移植物)的移植 会进一步增强-诱导的再生伤口愈合并潜在地增强皮肤附属 结构形成。在此预期伤口愈合响应的显著改善伴随着真皮和表皮的同时再 生以及疤痕形成的减少。

在本发明的这一方面，使用接种了ABCB5阳性细胞的骨架以通过诱 导分化来产生组织。分离且纯化的间充质干细胞经过特定介质中的有丝分 裂扩增可以以未分化状态生长。然后可收获这些细胞并可通过大量因素 (包括机械刺激、细胞刺激及生物化学刺激)将其活化以分化成骨、软骨 以及多种其他类型的结缔组织。人间充质干细胞具有分化成细胞(如成骨 细胞和软骨细胞)的潜力，其可产生很多种间充质组织细胞以及腱、韧带 和真皮，并且为了在培养时扩增多个细胞群，分离后仍保留该潜力。因此， 通过分离、纯化、大量增殖及随后通过间充质干细胞以分化为所需的特定 类型间充质细胞，例如骨骼组织和结缔组织(如骨、软骨、腱、韧带、肌 肉和脂肪)，存在治疗骨骼和另一些结缔组织病症的方法。本文使用的术 语结缔组织包括支持特定要素的身体组织，并且包括骨、软骨、韧带、腱、 基质、肌肉和脂肪组织。

在另一方面，本发明涉及用于修复结缔组织损伤的方法。所述方法包 括步骤：在适于将干细胞分化为修复所需之结缔组织类型的条件下，将骨 架施加于结缔组织损伤区域。

术语“结缔组织缺陷”所指的缺陷包括可由于创伤、疾病、年龄、出 生缺陷、手术干预等发生和正常结缔组织相比的任何损伤和不规则。结缔 组织缺陷也指在其中只需要骨形成(例如用于美容填充)的非受损区域。

骨架也可用于治疗肝疾病。肝疾病包括例如导致损害肝组织之肝炎的 疾病。更普遍地，本发明的骨架可用于肝疾病、病症、状况的治疗，所述 肝疾病、病症、状况包括但不限于：酒精性肝病、肝炎(甲型、乙型、丙 型、丁型等)、肝局灶性病变、原发性肝细胞癌、大的肝囊性病变、局灶 性结节性增生的肉芽肿性肝病、肝肉芽肿瘤、血色沉着病例如遗传性血色 沉着病、铁过负荷综合征、急性脂肪肝、妊娠剧吐、怀孕期间的并发肝病、 肝内胆汁阻塞、肝衰竭、暴发性肝衰竭、黄疸或无症状性高胆红素血症、 克-纳二氏综合征(Crigler-Najiarsyndrome)、威尔逊病(Wilson‘s disease)、α1抗胰蛋白酶缺乏、吉尔伯特综合征(Gilbert’ssyndrome)、 高胆红素血症、非酒精性脂肪性肝炎、卟啉病、非硬化性门静脉高压 (noncirrhoticportalhypertension)、非硬化性门静脉高压、门静脉纤维 化、血吸虫病、原发性胆汁性肝硬化、布-加综合征(Budd-Chiari syndrom)、骨髓移植后肝静脉闭塞病等。

在一些实施方案中，本发明涉及用本发明的骨架治疗神经退行性疾 病。在一些情况下，本发明考虑治疗具有神经退行性疾病或对神经细胞有 损伤(其可导致神经退行)的对象。神经细胞主要基于其局部/区域的突 触连接(例如，局部回路中间神经元相对比远程投射神经元(longrange proiectionneuron))和受体组以及相关的第二信来进行分类。神经细胞 包括中枢神经系统(CNS)神经元和外周神经系统(PNS)神经元。存在许多 不同的神经元细胞类型。例如包括但不限于感觉和交感神经元、胆碱能神 经元、背根神经节神经元、本体感觉神经元(在三叉神经中脑核中)、睫 状神经节神经元(在副交感神经系统中)等。本领域普通技术人员将能够 容易地鉴定神经元细胞，并通常利用细胞的形态特征，细胞特异性标志物 的表达，某些分子的分泌等区分它们与非神经元细胞(如神经胶质细胞)。 本文中定义“神经退行性病症”或“神经退行性疾病”为这样的病症，其 中神经元的进行性损失发生于外周神经系统或中枢神经系统中。这些病症 包括神经元损伤相关的损伤，如脊椎损伤和头损伤。

大多数的慢性神经退行性疾病通常发生在中年时期并导致神经系统 内特定的神经元亚群的迅速退行，最终导致过早死亡。包含真皮间充质干 细胞的组合物可单独施用于对象以治疗神经退行性疾病或者与其他治疗 化合物组合施用以治疗或预防这些病症或疾病。

已经描述了成体干细胞治疗神经退行性疾病的用途。已证明间充质干 细胞可以在经历过中风的小鼠中变成神经元样细胞，JournalofCell Transplantation第12卷，第201-213页，2003。另外，衍生自骨髓的干 细胞发展成有望用于治疗患有帕金森病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)和脊椎 损伤患者的神经细胞。

本发明的方法也可用于治疗与肾疾病相关的病症。已证明之前注射入 肾的间充质干细胞几乎能立即改善肾功能和细胞更新。Resnick，Mayer， StemCellsBringsFastDirectImprovement，WithoutDifferentiation，in AcuteRenalFailure，EurekAlert！，2005年8月15日。因此，本发明的骨 架可单独施用于患有肾疾病的患者或与其他治疗或过程(如透析)组合施 用以改善肾功能和细胞更新。

根据本发明的方法可治疗的其他疾病包括角膜和肺疾病。基于将间充 质干细胞施用于这些组织的疗法表现出了积极的结果。例如，已将人间充 质干细胞用于重建受损的角膜。MaY等，StemCells，2005年8月18日。 此外，已发现衍生自骨髓的干细胞对肺修复和针对肺损伤进行保护重要。 Rojas，Mauricio等，AmericanJournalofRespiratoryCellandMolecular Biology，第33卷，第145-152页，2005年5月12日。因此，本发明的真 皮间充质干细胞也可用于角膜组织或肺组织的修复。

ABCB5(+)干细胞对于对象可以是自体的(从同一对象获得)或对于 对象是非自体的，例如细胞为同种异体或同种同基因。或者，ABCB5(+) 干细胞可从对象的异种来源获得。

同种异体是指在遗传上不同但是属于或获自与对象相同的物种的细 胞。因此，同种异体人ABCB5(+)干细胞是从人获得的干细胞，而非从所 述干细胞的预期接受者。同基因是指与对象在遗传上相同或密切相关且免 疫学上相容的细胞(即，来自具有相同基因型的个体或组织)。异种是指 来源于或者获自于与对象不同物种之生物体的细胞。

可离体或在施加于骨架之前在体外或施用后在体内对根据本发明的 ABCB5(+)干细胞进行扩增。因此，在一些情况下，ABCB5表达为体外鉴 定、分离、克隆、繁殖以及扩增ABCB5(+)干细胞提供了基础。可以使用 任何合适的方法使用结合ABCB5的物质(例如分离的肽、例如抗体)将 ABCB5(+)干细胞与其他细胞分离。使用例如培养基、补充物及试剂的组 合可将分离的ABCB5(+)干细胞维持在适当的培养环境中。任选地，可使 用饲养细胞群或从饲养细胞群获得的条件化培养基以扩增ABCB5(+)干 细胞群。

根据本发明，可用于干细胞扩增的粘附因子、附着因子及基质因子包 括不限于E-钙黏蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白、超级纤连蛋白 (superfibronectin)、硫酸肝素蛋白聚糖、ICAM-I、层粘连蛋白、骨桥 蛋白、蛋白聚糖、E-选择素、L-选择素、VCAM和玻连蛋白。

根据本发明，可用于干细胞扩增的生物活性物和补充物包括不限于酶 (例如组织蛋白酶G、Flt-3/Fc)、蛋白质和肽(例如激活蛋白A、白蛋 白、血管生成素(angiogenin)、促血管生成素(angiopoietin)、BAX 抑制肽、调蛋白β-1、SMAC/Diablo)、维生素、激素和多种其他物质(例 如L-抗坏血酸、地塞米松、EGF、EGF-受体、胚胎液(牛)、flt3-配体、 孕酮、维甲酸、视黄醇乙酸酯、促血小板生成素(thrombopoietin)和TPO)、 抗体、趋化因子、细胞因子、生长因子及受体。

根据本发明，可用于干细胞扩增的培养试剂包括不限于抗生素(例如 放线菌酮、依托泊苷、庆大霉素、丝裂霉素、青霉素-链霉素)、经典培 养基(例如Claycomb培养基、Dulbecco的改良Eagle培养基、Iscove 的改良Dulbecco培养基、最低必需培养基)、细胞冷冻培养基-DMSO、 不含L-谷氨酰胺的Claycomb培养基、培养基(Sigma-Aldrich， 美国)。

本发明的组合物可包含干细胞或分离的干细胞制剂，干细胞的特征在 于在与糖胺聚糖骨架共移植的ABCB5细胞表面上表达ABCB5。组合物 可包含富含分离的ABCB5(+)干细胞的制剂，或者其可包含基本上纯的 ABCB5(+)干细胞群。组合物意在涵盖本文所讨论的骨架。

在一些实施方案中，组合物可包含促进细胞再生和分化的另外的生物 活性物和补充物。根据本发明，可使用的这样的生物活性物和补充物如上 所述并且包括但不限于多种酶、蛋白质和肽、维生素、抗体、趋化因子、 细胞因子、生长因子和受体。在一些实施方案中，组合物可包含免疫抑制 剂和/或抗血管发生剂。例如，在一些实施方案中，组合物可包含可用于 预防和/或治疗移植排斥的环孢素(例如CyA)。在一些实施方案中，组 合物可包含贝伐单抗(如)。在一些情况下，可使用抗血管 发生剂以阻止血管形成，这通常发生在移植后并可能导致移植排斥。在一 些实施方案中，没有将免疫抑制剂和/或抗血管发生剂作为组合物或骨架 的组分施用，而是在施用ABCB5(+)干细胞之前或之后独立地施用。

可对ABCB5+细胞进行遗传或重组工程。重组体可指生物体，细胞， 核酸和蛋白质。重组细胞和重组生物体是含有重组DNA的细胞和生物体。 重组DNA是指通常不会在自然界中发现的核酸序列。通常该术语是指两 个或更多个DNA片段剪接在一起以形成非自然产物。重组蛋白质为由重 组DNA(即，不同于在自然界中存在的核酸的核酸)产生的蛋白质。在 产生重组蛋白质时，编码蛋白质之基因的调节序列通常与天然基因中存在 的序列不同。为了在期望生物体中产生该蛋白质，也可将基因置于通常不 具有该基因的生物体中。

将期望的基因或其他核酸构建体插入接种到骨架上的细胞中可以使 用常规的基因和重组工程技术完成，例如Ausubel等，编辑，1989， CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenPublishingAssociates，Inc. 和JohnWiley&Sons，Inc.，NewYork中所述。

可对真皮间充质干细胞进行修饰以表达也可用于治疗适应症的蛋白 质，如本文中更详细的描述。例如，细胞可包含产生至少一种生物活性因 子的核酸，所述生物活性因子进一步诱导或加速间充质干细胞分化为分化 的谱系和/或细胞，所述谱系和/或细胞可包含产生分泌介体的核酸。在正 在形成骨的情况下，生物活性因子可为包括多种组织生长因子之TGF-β 超家族的成员，特别是骨形态发生蛋白，例如选自BMP-2、BMP-3、 BMP-4、BMP-6和BMP-7的至少一种。在另一些情况下，分泌介体可为 VEGF。

多种技术可用于将核酸引入细胞中。这样的技术包括核酸CaPO₄沉 淀的转染、与DEAE关联的核酸的转染、用包含目的核酸之逆转录病毒 的转染，脂质体介导的转染等。对于某些用途，优选将核酸靶向特定细胞。 在这些情况下，根据本发明，用于将核酸递送到细胞中的载体(例如逆转 录病毒或其他病毒、脂质体)可具有附着在其上的靶向分子。例如，可将 分子(例如靶细胞上对表面膜蛋白质特异的抗体或靶细胞上受体的配体) 结合到或整合入核酸递送载体。例如，当使用脂质体递送本发明的核酸时， 与内吞作用相关的表面膜蛋白质结合的蛋白质可被整合入脂质体制剂中， 以靶向和/或促进摄取。

将外源遗传物质引入真皮间充质干细胞中的一种方法为通过使用复 制缺陷型逆转录病毒对细胞进行转导。复制缺陷型逆转录病毒能够指导合 成所有病毒体蛋白质，但是不能产生感染性颗粒。因此，这些遗传改变的 逆转录病毒载体对于培养的细胞中的高效基因转导具有一般性效用。逆转 录病毒已被广泛用于将遗传物质转移到细胞中。本领域提供了用于产生复 制缺陷型逆转录病毒的标准方案(包括以下步骤：将外源遗传物质并入质 粒中，用所述质粒转染包装细胞系，通过所述包装细胞系产生重组逆转录 病毒，从组织培养基收集病毒颗粒以及用所述病毒颗粒感染靶细胞)。

使用逆转录病毒的主要优势在于病毒有效地将编码治疗剂的基因的 单拷贝插入到宿主细胞基因组中，从而允许在细胞分裂时将外源遗传物质 递送给细胞后代。另外，已报道在LTR区的基因启动子序列增强多种细 胞类型中插入的编码序列的表达。使用逆转录病毒表达载体的主要缺点是 (1)插入诱变，即将治疗基因插入靶细胞基因组的非期望位置中，这例如 导致未调节的细胞生长以及(2)为使载体携带的治疗基因整合入靶基因组 需要靶细胞增殖。尽管存在这些明显的局限性，如果转导效率高和/或可 用于转导的靶细胞数目高，则通过逆转录病毒递送治疗有效量的治疗剂可 以有效。

可用作真皮间充质干细胞转化之表达载体的另一种候选病毒为腺病 毒，其是一种双链DNA病毒。与逆转录病毒一样，腺病毒基因组适合用 作基因转导的表达载体，即通过除去控制病毒自身产生的遗传信息。因为 腺病毒通常以染色体外方式发挥作用，所以重组腺病毒没有插入诱变的理 论问题。另一方面，靶标真皮间充质干细胞的腺病毒转化不能产生稳定转 导。然而，最近有报道称某些腺病毒序列赋予对载体序列的染色体内整合 特异性，从而产生外源遗传物质的稳定转导。

因此，本领域普通技术人员应清楚多种合适的载体可用于将外源遗传 物质转移到真皮间充质干细胞中。对递送在特定条件适合于基因替代疗法 的治疗剂的合适载体的选择和将所选择的表达载体插入细胞中的条件优 化是本领域普通技术人员的技术范围，无需过度实验。

因此，本发明使得以真皮间充质干细胞产生生物学显著量的通常人干 细胞不会产生或少量产生(然而过度产生会导致治疗益处的情况)的多肽、 激素和蛋白质的方式对真皮间充质干细胞进行遗传工程成为可能。这些产 物将被分泌到血流或身体的其他区域(如中枢神经系统)中。以这种方式 形成并包埋在骨架中的人干细胞可以作为持续的药物递送系统以取代目 前需要定期施用(通过摄入，注射，贮存输注(depotinfusion)等)所需 物质的方案。本发明适用于为需要这些物质的人提供激素，酶和药物。它 对这样的物质例如激素(如甲状旁腺素，胰岛素)特别有价值，需要长时 间持续剂量的所述物质并与所述物质与正在修复的组织相关。

可将ABCB5(+)干细胞分离以产生可发展成其他细胞、组织和/或整个 动物的全能、多能或多潜能干细胞(例如诱导性多潜能干细胞(iPSC))。 因此，在本发明的一些方面提供了用于在细胞接种于骨架之前或之后直接 重编程(reprogramming)或诱导ABCB5(+)干细胞成为全能、多能或多潜 能干细胞细胞的方法。本文所用的术语“重编程”，是指逆转细胞或细胞 群(例如ABCB5(+)干细胞)发育潜力的过程。因此，重编程是指将细胞 驱动至具有更高发育潜力状态的过程，即返回至较低分化状态。待重编程 的细胞在重编程之前可部分或终末分化。在一些实施方案中，重编程涵盖 分化状态的完全或部分逆转，即将细胞的发育潜力提高至具有全能、多能 或多潜能状态之细胞的发育潜力。在一些实施方案中，重编程涵盖将 ABCB5(+)干细胞驱动至全能、多能或多潜能状态，以使得细胞具有胚胎 干细胞发育潜力(即胚胎干细胞表型)。重编程还涵盖将细胞分化状态部 分逆转至进行另外操作时使得细胞更易完成重编程至全能、多能或多潜能 状态的状态。

全能、多能或多潜能干细胞可使用若干重编程因子从ABCB5(+)干细 胞(本文中称为“重编程的ABCB5(+)细胞”)产生。然后，所得到之具 有比ABCB5(+)干细胞更大的发育潜力的细胞可成为后续操作的干细胞 来源。本文所用的“重编程因子”，是指其表达有助于细胞重编程(例如 将ABCB5(+)干细胞重编程至较少分化或未分化状态，例如将ABCB5(+) 干细胞重编程至多潜能状态或部分多潜能状态的细胞)的发育潜力改变因 子。重编程因子包括OCT4、SOX2、KLF4及c-MYC(或称为“Yamanaka 因子”)。另一些重编程因子包括但不限于SOX1、SOX3、SOX15、SOX18、 NANOG、KLF1、KLF2、KLF5、NR5A2、LIN28、1-MYC、正MYC、 REM2、TBX3、TERT和LIN28。可使用两种或更多种上述转录因子的 任意组合对分离的ABCB5(+)干细胞进行重编程。将细胞重编程至全能、 多能或多潜能状态的方法由Stadtfeld和Hochedlinger[33]描述，其全部内 容通过引用并入本文。

还可产生分化的细胞并将其并入来自重编程ABCB5(+)细胞的骨架 中。该方法可包括在重编程ABCB5(+)细胞中表达为了促进分化成更成熟 的分化细胞类型(例如血细胞、血小板、基质细胞、骨细胞、肌肉细胞、 皮肤细胞、脂肪细胞或神经细胞)所必需的任何一个或多个分化因子。本 文所用的术语“分化因子”是指发育潜力改变因子，如诱导细胞分化成所 需细胞类型的蛋白质或小分子，例如，分化因子降低细胞的发育潜力。向 特定细胞类型的分化可包括一种以上分化因子的同时和/或相继表达。该 方法还可包括使重编程ABCB5(+)细胞在促进分化形成分化细胞的条件 下生长。

本文所用的“干细胞”是具有自我更新能力并具有分化成多种细胞类 型的发育潜力的未分化或部分分化细胞。“多潜能细胞(pluripotentcell)” 是具有在不同条件下分化成全部三个胚细胞层特征细胞类型(即内胚层 (如肠组织)、中胚层(包括血液，肌肉和血管)及外胚层(如皮肤和神 经))之发育潜力的细胞。“多能(multipotent)”细胞是具有分化成一个 或多个胚层但非全部三个胚层细胞之发育潜力的细胞。这些细胞包括例如 成体干细胞(如造血干细胞和神经干细胞)。“全能(totipotent)”细胞是 具有分化成生物体(包括胚外组织)中所有分化细胞之发育潜力的细胞。 干细胞可具有分化表型的倾向；然而，为了逆转和重新表达干细胞表型， 可对这些细胞进行诱导。这个过程称为“去分化”或“重编程”。

对于这些细胞类型，可在标准条件下对本发明的ACB5(+)干细胞、 重编程ABCB5(+)细胞和分化细胞进行操作。细胞的处理可在将所述细胞 并入骨架之前或之后以及在体外、离体或体内进行。例如细胞可以存在于 体内或培养基中。操作可在高或低氧条件下进行。

“培养基”包含维持细胞生存力和支持增殖的营养物。典型培养基 包含：盐、缓冲剂、氨基酸、葡萄糖或其他糖类、抗生素、血清或血清替 代物和/或其他组分(如肽生长因子)。用于得到并维持全能、多能和多 潜能细胞的细胞培养基是本领域中已知的。培养基还可包括细胞特异性生 长因子，如血管生成素、骨形态发生蛋白-1、骨形态发生蛋白-2、骨形态 发生蛋白-3、骨形态发生蛋白-4、骨形态发生蛋白-5、骨形态发生蛋白-6、 骨形态发生蛋白-7、骨形态发生蛋白-8、骨形态发生蛋白-9、骨形态发生 蛋白-10、骨形态发生蛋白-11、骨形态发生蛋白-12、骨形态发生蛋白-13、 骨形态发生蛋白-14、骨形态发生蛋白-15、骨形态发生蛋白受体IA、骨形 态发生蛋白受体IB、脑源性神经营养因子、睫状神经营养因子、睫状神 经营养因子受体α、细胞因子诱导的嗜中性粒细胞趋化因子1、细胞因子 诱导的嗜中性粒细胞、趋化因子2-α、细胞因子诱导的嗜中性粒细胞趋化 因子2-β、β-内皮细胞生长因子、内皮1(endothelia1)、表皮生长因子、 上皮源性嗜中性粒细胞引诱剂(epithelial-derivedneutrophilattractant)、 成纤维细胞生长因子4、成纤维细胞生长因子5、成纤维细胞生长因子6、 成纤维细胞生长因子7、成纤维细胞生长因子8、成纤维细胞生长因子b、 成纤维细胞生长因子c、成纤维细胞生长因子9、成纤维细胞生长因子10、 酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、神经胶质细胞源性 嗜中性粒细胞因子受体α-1、神经胶质细胞源性嗜中性粒细胞因子受体 α-2、生长相关蛋白、生长相关蛋白-α生长相关蛋白-β、生长相关蛋白-γ、 肝素结合表皮生长因子、肝细胞生长因子、肝细胞生长因子受体、胰岛素 样生长因子I、胰岛素样生长因子受体、胰岛素样生长因子II、胰岛素样 生长因子结合蛋白、角质形成细胞生长因子、白血病抑制因子、白血病抑 制因子受体α、神经生长因子、神经生长因子受体、神经营养蛋白-3、神 经营养蛋白-4、胎盘生长因子、胎盘生长因子2、血小板衍生内皮细胞生 长因子、血小板衍生生长因子、血小板衍生生长因子A链、血小板衍生 生长因子AA、血小板衍生生长因子AB、血小板衍生生长因子B链、血 小板衍生生长因子BB、血小板衍生生长因子受体α、血小板衍生生长因 子受体β、前-B细胞生长刺激因子、干细胞因子、干细胞因子受体、转化 生长因子α、转化生长因子β、转化生长因子β-1、转化生长因子β-1-2、 转化生长因子β-2、转化生长因子β-3、转化生长因子β-5、潜在转化生长 因子β-1、转化生长因子β结合蛋白I、转化生长因子β结合蛋白II、转 化生长因子β结合蛋白III、肿瘤坏死因子受体I型、肿瘤坏死因子受体 II型、尿激酶型纤溶酶原活化剂受体、血管内皮生长因子和嵌合蛋白质及 其生物学或免疫学活性片段。

可以使用本领域用于作出这种评价的任何已知方法对细胞的分化状 态进行评价。例如，可将根据本文描述方法处理的细胞分化状态与未处理 的细胞或使用递送DNA的病毒载体经DNA处理从而导致表达相同重编 程因子或分化因子的细胞相比较。

干细胞的剂量可以由骨架内包含的细胞数目来限定，并且可在很宽的 范围内变化，当然，在每个特定的情况下，都要符合个体的需求。所使用 的细胞数目将取决于接受者的体重和状况以及本领域技术人员已知的其 他变量。

本发明还提供了在试剂盒中的任意上述组合物，任选地，所述试剂盒 包含用于使用所述组合物以治疗本文所描述之病症的说明书。即，试剂盒 可包含使用组合物以参与本文公开的任何生物或化学机制的说明。试剂盒 还可包含在治疗病理时病症活动的描述，而不是病症的症状。即，试剂盒 可包含本文所讨论的组合物的用途描述。试剂盒还可包含使用用于治疗疾 病的细胞和骨架之组合的说明书。还可提供用于通过任何合适的技术施用 组合物的说明书。试剂盒还可为一种或更多种与真皮间充质干细胞的分离 和纯化相关的试剂，即用于分离和/或纯化细胞的ABCB5抗体和说明书。

本文描述的试剂盒还可包含有一个或更多个容器，可包含之前所描述 的组合物和其他成分。试剂盒还可包含用于在某些情况下混合、稀释和/ 或施用本发明组合物的说明书。试剂盒还可包含含有一种或更多种溶剂、 表面活性剂、防腐剂和/或稀释剂(例如生理盐水(0.9％NaCl)或5％右 旋糖(dextrose))的另一些容器以及用于对样品中的组分混合、稀释或 施用或向需要此治疗的对象混合、稀释或施用组分的容器。

可以以任何合适的形式提供试剂盒的组合物，例如，以液体溶液或干 燥粉末的形式。当所提供的组合物为干粉末时，可通过添加合适溶剂对组 合物进行重构，所述溶剂也可以提供。在使用液体形式的组合物的实施方 案中，所述液体形式可以是浓缩的或即用的。

通过以下实施例进一步说明了本发明，但所述实施例无论如何不应被 视为对本发明的进一步限制。贯穿本申请引用的所用文献(包括参考文献、 授权专利、公开的专利申请和共同待审专利申请)的全部内容通过引用清 楚地并入本文。

实施例

实施例1：ABCB5+真皮干细胞在体外和体内的多能分化可塑性

我们之前已表明ABCB5鉴定了人真皮中的间充质干细胞群，其中 ABCB5赋予膜超极化，并且作为膜电位调节物决定了皮肤祖细胞进行分 化的倾向。另外的研究已经揭示，ABCB5赋予药物抗性，并标记人黑素 瘤中具有特定分化可塑性的癌干细胞(CSC)亚群，其中ABCB5也与临 床疾病的进展有关。

我们已经表明，ABCB5+皮肤细胞存在于网状真皮中，并且不同于邻 近的成熟成纤维细胞、CD31+内皮细胞和CD34+隆突细胞(bulgecell)。 ABCB5由人皮肤试样中所有细胞的2.5％至5％表达。ABCB5+细胞共表 达间充质干细胞标志物CD29(占细胞的99.48±0.5％)、CD44(99.09 ±0.9％)、CD49e(92.61±4.0％)、CD90(100％)和CD166(58.29 ±19.7％)，以及干细胞标志物CD133(6.29±5.1％)，但对分化标志物 (如内皮谱系标志物CD31、造血谱系标志物CD45和静止成纤维细胞标 志物CD34)均呈阴性。重要的是，只有对已报道的MSC标志物(CD29、 CD44、CD49e，CD90和CD166)染色呈阳性的独特细胞亚群对ABCB5 染色呈阳性，而发现大部分表达这些抗原的细胞对ABCB5呈阴性，证明 ABCB5+细胞代表一种独特的新的间充质干细胞亚群。

为了研究ABCB5是否代表了对多能间充质干细胞来说比现有MSC 抗原更具特异性的标志物，我们评价了在体外和体内ABCB5+真皮干细胞 相对比ABCB5-细胞的多能分化可塑性。

我们检查了通过阳性选择从来自健康人志愿者的解离皮肤细胞悬浮 液分离之ABCB5+细胞的分化潜力，并将其与ABCB5-真皮成纤维细胞的 分化潜力相比较(图1)。将ABCB5+或ABCB5-细胞培养在诱导神经发 生、血管发生、肌发生的、骨发生或脂肪生成谱系的培养基中，并且通过 测量谱系特异性标志物(即血影蛋白-肌发生、CD31-血管发生、TUJ1- 神经发生、油红-脂肪生成及茜素红-骨发生)的RNA和蛋白质表达的诱 导以及谱系特征形态变化来评价它们的分化可塑性(图1)。仅ABCB5+ 真皮细胞能够产生全部三种胚胎谱系(即外胚层(神经发生)、中胚层(肌 发生)和内胚层(血管发生)谱系)，而ABCB5-真皮细胞则不能(图1)。

为了进一步剖析人ABCB5+真皮MSC的分化可塑性并确定它们在体 内不依赖于小环境的多能分化能力，我们检测了急性肌肉损伤模型中人 ABCB5+与ABCB5-皮肤衍生细胞的体内肌再生潜力。将ABCB5+和 ABCB5-皮肤细胞注射入严重免疫受损的NOD/SCID/IL2Rγ-/-(NSG)小 鼠之心脏毒素损伤的胫骨前(TA)肌中。获得用人特异性β2-微球蛋白、 Δ肌聚糖(sarcoglycan)和血影蛋白进行代表性免疫荧光染色之注射了人 ABCB5+和ABCB5-细胞的鼠肌肉。用DAPI可视化细胞核。移植后2周 收获被注射的肌肉和未被注射的对照肌肉，并检查人特异性β2微球蛋白 (β2M)(其鉴定所有人源细胞)和人特异性血影蛋白(SPTBN1)及Δ 肌聚糖(SGCD)(由分化的人而不是鼠肌细胞特异性表达)的表达。虽 然免疫染色揭示了在注射了ABCB5+和ABCB5-细胞的肌肉中都存在 β2M+人细胞，表明成功的移植和植入，只有注射了ABCB5+细胞的TA 肌肉含有SPTBNI+和SGCD+分化的肌细胞。被注射的肌肉和未被注射的 对照肌肉的实时PCR分析证明在注射了ABCB5+和ABCB5-细胞的肌肉 中均存在人特异性β2M转录本的表达，但在未被注射的对照中不存在， 并且证明人特异性SPTBN1和SGCD转录本的表达只在注射了ABCB5+ 细胞的肌肉中存在。因此，ABCB5对多能人真皮间充质干细胞表现为一 种高度特异性的标志物，并具有比现有的MSC抗原充分增强的辨别性标 志物功能。这些发现突出了作为以干细胞为基础之组织再生的新细胞来源 的ABCB5+真皮MSC的能力。

实施例2：Abcb5敲除小鼠的干细胞缺陷表型

为了进一步剖析ABCB5在发育和干细胞功能中的作用，我们创造了 fisrt条件性(firstconditional)Abcb5敲除(KO)小鼠。直到最近，对 智人(Homosapoens)ABCB5蛋白功能进行了大量的研究。人ABCB5 基因编码812个氨基酸(AA)的蛋白质，具有5个侧翼为胞外和胞内ATP 结合结构域的跨膜螺旋¹。我们以前的研究揭示，我们的单克隆抗ABCB5 抗体克隆之一，3D2-1D12(其靶向含有人ABCB5蛋白的493-508位氨基 酸残基的胞外环)，抑制ABCB5介导的罗丹明123染料流出、膜极化和 多柔比星转运^1，25，证明了该分子胞外环区的关键功能重要性。我们以前 还克隆了相应的ABCB5小鼠标同源物，鼠Abcb5²³。为了破坏小鼠中的 Abcb5功能，靶向鼠分子的同源部分。使用UCSCBlat搜索引擎，我们 鉴定了编码与ABCB5蛋白结构域同源的3C2-1D12ABCB5mAb结合表 位的小鼠基因组区由外显子23编码。基于这一发现，设计了条件性KO 构建体，其中将两个loxP位点插入到鼠外显子23的侧翼(图2)。

为了确定功能完全丧失的结果，使用EIIa-Cre转基因(其于合子期 在小鼠胚胎中表达Cre重组酶^48，49)删除ABCB5基因的外显子23。loxP 位点之间基因组区的缺失通过基因组DNA的PCR来确认。将杂合的 Abcb5null/WT小鼠进行杂交以产生纯合的Abcb5null/null突变体，而 Abcb5null/null突变体中Acbc5表达和功能的丧失通过流式细胞术分析和 罗丹明123流出测定¹确定(图3)。

相对静止(quiescence)是多种哺乳动物干细胞群的区别特征之一⁵⁰。 使用所谓的“脉冲(pulse)和追踪(chase)”DNA标记实验方法首先将皮肤 干细胞鉴定为缓慢循环细胞，所述实验方法由Bickenbach⁵¹、Morris⁵²和 Cotsarelis⁵⁰开发。这些方法取决于在细胞周期的复制期(S-期)期间将标 记的胸苷类似物、尿苷并入细胞核DNA。首先，在DNA标记期间或“脉 冲”阶段，将细胞或动物暴露于放射性或化学标记的尿苷(例如溴脱氧尿 苷，BrdU)，然后将所述其在每次细胞分裂期间并入细胞核DNA。然受， 标记的尿苷(如BrdU)暴露在“追踪”阶段撤出，在后续约48-72小时 的进程中，随着频繁的分裂细胞，标记丧失。然而缓慢循环细胞能够在长 时间内保留DNA标记；例如，小鼠毛囊膨的隆突区干细胞可以在至少4 周保留放射性标记的尿苷⁵⁰，并因此被称为“标记滞留细胞(label-retaining cell)”。

为了确定ABCB5是否鉴定哺乳动物皮肤中的静止标记滞留细胞群 (与已证明的干细胞表型一致)，以及是否干细胞静止的维持需要完整的 ABCB5功能，我们在Abcb5WT和Abcb5KO小鼠中进行了体内BrdU 标记实验。Brdu是一种非放射性尿苷衍生物，其可以使用荧光标记的抗 BrdU抗体检测。对小鼠进行9天“脉冲”的每日全身(i.v.)BrdU施用(为 了标记缓慢分裂的细胞而设计)，随后在BrdU处理停止后4周的无BrdU “追踪”阶段。然后使用抗BrdU抗体染色和流式细胞术比较Abcb5WT 和Abcb5KO小鼠中分离的全厚度皮肤细胞悬浮液中BrdU滞留细胞的 百分比。用7-氨基-放线菌素D(7-AAD)染料(其与总DNA结合)对细 胞进行共染色，以用于细胞计数和关于它们细胞周期位置的表征(图4)。 流式细胞术分析揭示，4周的“追踪”之后，发现Abcb5WT小鼠中所有 BrdU阳性(即标记滞留细胞)都处于G0期(图4B，设门R1)，并且 Abcb5KO小鼠中的该群减少74％(图4C，设门R1)。此外，与来源于 Abcb5WT小鼠的全厚度皮肤细胞悬浮液相比，来源于Abcb5KO小鼠的 全厚度皮肤细胞悬浮液显示了超过67％的处于S/G2/M期的增殖BrdU阴 性细胞(图4B和4C，设门R2)这表明正常ABCB5功能的缺失诱导正 常静止ABCB5+细胞的细胞增殖。

与此观察相一致，参与细胞周期调控的84个细胞基因的实时PCR分 析(SABiosciences，目录号PAMM-020)揭示了Acbc5KO小鼠中参与 若干典型细胞周期途径的22个分子的显著下调，所述途径包括p53信号 转导、G1/S检查点调控、细胞周期蛋白和细胞周期调控及钙信号转导途 径(图5)，所述钙信号转导途径包括p53家族的成员(p53和p63)和 cKip家族的成员(p21和p27)，其控制G0/G1细胞周期检查点和细胞 静止。

这些结果表明，ABCB5调控细胞周期进程且是维持干细胞静止期所 需的。ABCB5功能的缺失导致了对G0/G1细胞周期进程之典型负调节蛋 白的阻抑，并导致细胞增殖提高。撤出细胞周期进程是正常分化的先决条 件，不能这样做可解释下述Abcb5KO小鼠中正常伤口愈合的受损。数据 进一步支持作为功能相关标志物用于从哺乳动物皮肤分离干细胞的 ABCB5的合适性。

实施例3：Abcb5敲除小鼠中受损的伤口愈合

伤口愈合是一个复杂的现象，此过程经过四个连续阶段：止血，炎症， 增殖和用疤痕形成的重塑⁵³。我们利用Abcb5WT和Abcb5KO小鼠研究 正常伤口愈合是否需要完整的ABCB5功能。通过除去1cm²的皮肤和脂 膜来产生全厚度皮肤伤口，随后在伤口愈合的早期增殖阶段观察小鼠7 天。在手术过程后立即以及在收获组织时(第7天)对伤口进行拍照。由 不了解小鼠遗传状态的2个独立观察者对比于相应初始照片，对在实验结 束时捕获的数码照片进行定量分析。

本文使用ImageJ软件包(NIH，Bethesda，MD)，基于通过先前描 述⁵⁴的平面分析获得的测量结果，将伤口闭合计算为原始伤口的百分比。 考虑到不等方差，使用未配对的t-检验和Welch校正对数据进行比较。与 Acbc5WT小鼠(n＝19)相比，Acbc5KO小鼠(n＝15)证明了显著延迟 的伤口闭合(87.33±3.4％相对于63.64±7.6％，平均值±SEM，P＝0.01) (图6)。此外，使用AperioImageScope软件(Vista，CA)在这两组中 对扫描的第7天的H&E染色伤口截面进行炎性基质厚度测量，证明与 Abcb5WT伤口相比，Acbc5KO伤口显著增加的炎性基质厚度(590.0± 38.8μm相对于820.2±65.6μm，平均值±SEM，P＝0.003)(图6)。

新血管形成是伤口再生早期阶段的标志之一，并且对被认为有助于疤 痕疙瘩疤痕形成之低氧诱导的肌成纤维细胞过度增殖的控制非常重要(综 述于⁵⁵)。以前的研究表明，虽然伤口血管发生主要是通过来自预先存在 血管的新血管出芽(sprout)实现，但一些新形成的血管可能源自骨髓祖 细胞⁵⁶。其他驻留干细胞群对伤口血管发生的贡献还不清楚。根据我们之 前对人黑素瘤血管发生中ABCB5+细胞之关键作用的观察²⁸，我们假设完 整的ABCB5功能对受伤皮肤中有效的血管发生也可能是必不可少的。为 了在从本方案之最后的重复产生的另外的初步研究中检验这一假设，在伤 口床中血管化相对于无血管化面(层)的厚度的情况下，在受伤后第7 天通过比较Abcb5KO和Abcb5WT小鼠中内皮标志物CD31的表达对 按上述描述产生的鼠皮肤伤口中的血管形成进行分析。在这两组中使用 AperioImageScope软件(Vista，CA)对扫描的第7天的CD31染色伤口截 面进行血管CD31阳性层厚度和无血管CD31阴性层厚度测量，证明与 ABcbc5WT伤口相比，Acbc5KO伤口显著降低的血管层厚度(469.2± 40.30μm相对于278.5±51.45μm，平均值±SEM，P＝0.0069)和显著增 加的无血管层厚度(324.5±28.55μm相对于626.2±41.18μm，平均值± SEM，P＜0.0001)(图7)。

野生型动物中的增殖性CD31阳性血管可变地形成具有良好形成的 腔的长分支通道，与其相比，ABCB5KO动物的类似区域在灶区相对缺 少CD31阳性结构，或是由混合了单个或小簇CD31阳性细胞的偶然性小 血管谱构成。这些后者CD31阳性细胞似乎反映了缺乏分化成能够形成血 管发生出芽之细管的能力，所述血管出芽是形成高效且多产愈合响应所需 之成熟血管的树枝分支网络所必需的(图8)。

与此观察一致，参与血管发生的84个基因的实时PCR分析 (SABiosciences，目录号PAMM-024Z)揭示了Acbc5KO伤口中促血管 发生细胞因子(即Csf3、CxCl2、Il1b、Ifng、Lep和Mdk)的显著下调， 以及已知的抗血管发生分子磷酯酰丝氨酸受体Bai1的上调(图9)，从 而为Acbc5KO伤口中观察到的高度抑制和异常血管发生模式提供了初 步的解释。

这些结果证明Acbc5KO小鼠中受损的伤口愈合的特征在于延迟的 伤口闭合、提高的炎性基质厚度和异常的血管发生，并进一步支持了 ABCB5，以及因此ABCB5+间充质干细胞在正常皮肤伤口愈合中的关键 功能性作用。

实施例4：人ABCB5+真皮MSC对NSG小鼠中再生伤口愈合的作 用

我们使用以下4个处理组研究了人ABCB5+真皮MSC对经 处理的NSG小鼠中伤口愈合的作用：(1)未处理；(2)只有 (3)注射有1×10⁶ABCB5+真皮MSC的和 (4)注射有1×10⁶ABCB5-阳性真皮细胞的(图10B)。如图6 所述，通过除去1cm²的皮肤和脂膜在所有动物中产生全厚度皮肤伤口。 立即用1cm²的移植物移植组2、3和4中的每个伤口，随后 内注射1×10⁶ABCB5+细胞(组3)或1×10⁶ABCB5-细胞(组 4)。实验组2中不注射细胞。组1充当未处理的实验对照。该过程后第 14天，收获由周围皮肤和下方肌肉组织组成的伤口组织。 在所有组中使用AperioImageScope软件(Vista，CA)对扫描的第14天 H&E染色的伤口截面进行炎性基质厚度测量。定量分析表明，经 和ABCB5+人真皮MSC处理的小鼠与经和 ABCB5-真皮细胞处理的小鼠(608.0±46.7μm相对于855.4±69.8μm，平 均值±SEM，P＝0.009)、单独处理的小鼠(874.7±43.3μm， P＝0.0001)或者未处理的小鼠(1014±49.4μm，P＜0.0001)相比表现出显著 下降的炎性基质厚度。未观察到单独处理的小鼠与经 和ABCB5-真皮细胞处理的小鼠之间存在差异。与未处理的 伤口相比，单独处理略微降低了炎性基质厚度(图10A)。 为了确保注射的人细胞群的生存力，要进一步检测移植物之人特异性β2 微球蛋白(β2M)(所有人源细胞的标识物)的表达。免疫染色揭示了注 射入有移植物的细胞中β2M+人细胞簇以及单个β2M+人细 胞的存在(图10C)。注射有ABCB5+或ABCB5-人真皮细胞的 移植物的实时PCR分析也证明了人特异性GAPDH和β2M 转录本的表达，与预期一样，在没有注射ABCB5+或ABCB5-人真皮细胞 只经处理的移植物中没有可检测的这两种转录本(图10D)。 因此，尽管在向可移植性基质中注射后成功地植入并保留 了活的ABCB5+真皮MSC或活的ABCB5-真皮细胞，但是在受伤的NSG 小鼠中只有ABCB5+真皮MSC的移植进一步降低了炎性基质厚度，而 ABCB5-人真皮细胞则不能，从而为这种新MSC群进一步增强再生伤口 愈合的特异性治疗应用提供了初步的原理验证。

实施例5：人源化小鼠模型

虽然小鼠模型被广泛用于人疾病的研究，但是人和非人物种之间在伤 口治疗过程中存在很大的差异³¹。为此，使用了一种替代模型，其中将全 厚度人皮肤移植物移植到免疫缺陷小鼠³²。在这个模型中，皮肤移植物在 组织学上非常类似于人的皮肤并在至少3个月内维持它们的人表型。将在 整形手术期间移除的废弃正常成体皮肤样品用作植入向8周大的免疫缺 陷NSG小鼠移植的人皮肤(图11A、B)。人皮肤异种移植物的伤口导 致正常人伤口愈合模式，如图11C所示。

另外，在获自无移植物伤口(图12，上图)或获自移植有骨架移植物的人患者伤口(图12，下图)的组织活检物中检查了 骨架移植对人患者中再生伤口愈合的作用。比较分析揭示了 作为疤痕形成之结果的愈合响应的免疫组织化学谱(无图 12，上图)或作为骨架诱导再生之结果的愈合响应的免疫组织化学谱，其 特征在于具有骨架的伤口中表达肌动蛋白的肌成纤维细胞的重新对准和 明显增强的ABCB5+真皮细胞表达(图12，下图)。

这些结果表明，与通过疤痕形成的伤口愈合相反，植入并因此优先调 动ABCB5+真皮MSC的骨架诱导再生性伤口愈合。因此， 人ABCB5+真皮MSC显著且选择地进一步增强介导的再生 性伤口愈合(图10)，并在翻译上最相关的人皮肤伤口愈合实验中证明 人ABCB5+真皮骨架共移植的治疗功效。

真皮间充质干细胞对于提供平衡因此以有序方式发生正常愈合响应 是必需的，导致逐渐的伤口闭合和生理性疤痕形成。我们预测Abcb5KO 小鼠中受损的真皮干细胞功能会导致异常伤口愈合响应，其可以是不充分 愈合或过度愈合。缺陷性愈合可表现为在褥疮溃疡中观察到的皮下组织丧 失，或静脉溃疡中观察到的上皮再形成失败，或糖尿病性溃疡中观察到的 坏死-感染组合。在组织学上，缺陷性伤口愈合的特征可在于过度的嗜中 性粒细胞浸润和提高的MMP-9胶原酶分泌(其会导致胶原蛋白破坏)3。 相反，肥大性疤痕的特征在于，由于放大的炎性反应以及由此的生长因子 (包括TGF-β58)过度产生而导致的提高的胶原蛋白沉积⁵⁸。

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本文引用的全部参考文献通过应用完全并入本文。由此描述了本发明 至少一个实施方案的若干方面，应理解本领域技术人员容易想到多种更 改、修改和改进。这样的更改、修改和改进应视为本公开内容的一部分， 并且应包括在本发明的精神和范围内。相应地，上述描述和附图仅是举例。