一种利用微生物发酵生产10-脱乙酰巴卡亭III的方法

摘要

本发明涉及一种利用微生物发酵生产10-脱乙酰巴卡亭III的方法，采用Tolumonas？osonensis为发酵菌种，经一级种子培养、二级发酵培养，在得到的菌体发酵液中投入底物巴卡亭III，进行C10-脱乙酰基反应转化，生成10-DAB，菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCCNo.7562。本发明以巴卡亭III作为底物采用微生物一步C10-脱乙酰基反应生物合成10-DAB，具有操作简单、反应专一性好、成本低、反应条件温和、产物易于分离纯化等优点，克服了现有方法步骤繁琐、收率低、副产物多、分离纯化困难、环境不友好等缺点。

说明书

技术领域

本发明属于微生物制药及医药工程领域，具体涉及到一种利用Tolumonas osonensis生产10-脱乙酰巴卡亭III的方法，该方法以TolumonasosonensisCGMCC No.7562为菌种，以巴卡亭III为底物，采用微生物C10-脱乙酰基反应转化生产10- 脱乙酰巴卡亭III的方法。

背景技术

10-脱乙酰巴卡亭III(10-DAB)是紫杉烷类抗肿瘤药物的典型代表--多烯紫杉 醇的前体物质。它广泛分布于红豆杉植物的树叶、根、皮、枝干中，在不同种植物 的含量差异较大，但总体含量偏低，一般在0.00513％-0.175％左右。其传统制备方 法是从植物中进行提取，但此过程工艺步骤冗长、需要经过多次层析、梯度洗脱、 多次重结晶后才能获得精制品，不仅造成了10-DAB的大量损失，降低了收率，而 且过程中还大量使用乙腈和石油醚等有机溶剂，对环境造成不良影响。

微生物转化是指某一微生物将一种物质(底物)转化成为另一种物质(产物)的过 程，其本质是利用生物体所产生的酶对外源化合物进行酶催化反应，它具有反应选 择性强(位置选择性、立体选择性)、反应条件温和、副产物少和不造成环境污染等 优点。Tolumonasosonensis是2011年Matthew等人发现的属于甲苯单胞菌属的一个 新种，目前利用该菌株转化巴卡亭III生产10-脱乙酰巴卡亭III的研究还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种工艺简单、副产物少、经济 实用、反应条件温和且对环境友好的生产10-DAB的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种利用微生物发酵生产10-脱乙酰巴卡亭III的方法，采用Tolumonasosonensis 为发酵菌种，经一级种子培养、二级发酵培养，在得到的菌体发酵液中投入底物巴 卡亭III，进行C10-脱乙酰基反应转化，生成10-DAB，所述的Tolumonasosonensis 由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCCNo.7562。

而且，所述的在制成的菌体发酵液投入巴卡亭III进行C10-脱乙酰基反应的方式 是：用有机溶剂将巴卡亭III助溶，配制成的溶液加入到菌体发酵液中，巴卡亭III投 入的终浓度为0.04-1g/L，有机溶剂加入的体积比例为2-25％。

而且，所述的有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷、乙 酸乙酯的其中一种。

而且，所述的C10-脱乙酰基反应的转化条件是：28-37℃、150-300r/min转化 培养60-144h。

而且，所述的Tolumonasosonensis的一级种子培养的方式是：将Tolumonas osonensisCGMCCNo.7562在斜面上培养，22℃-30℃下恒温培养2-5d后，取一满 环至种子培养基中，22℃-30℃、120-280r/min振荡培养18-30h，得到适于接种的 种子培养液。

而且，所述的Tolumonasosonensis的二级发酵培养的方式是：将种子培养液以 5％-15％的接种量接入发酵培养基，22℃-30℃、120-280r/min振荡培养20-32h进 行二级发酵培养，得到菌体发酵液。

一种利用微生物发酵生产10-脱乙酰巴卡亭III的方法，采用Tolumonasosonensis 为发酵菌种，经一级种子培养、二级发酵培养，得到的菌体，将菌体破碎，在破碎 菌体菌悬液中投入底物巴卡亭III，进行C10-脱乙酰基反应转化，生成10-DAB，所 述的Tolumonasosonensis由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号 为CGMCCNo.7562。

而且，所述破碎方法为化学破碎法、物理破碎法或干燥破碎。

而且，所述破碎方法为甲苯破碎、丙酮破碎、异丙醇破碎、超声破碎、反复冻 融破碎、冷热交替破碎或干燥破碎。

本发明的有益效果是：

本发明提供的10-DAB的制备方法，以Tolumonasosonensis为菌种，巴卡亭III 作为底物采用微生物一步C10-脱乙酰基反应制备10-DAB。本方法具有操作简单、 反应专一性好、成本低、反应条件温和、产物易于分离纯化等优点，克服了现有方 法步骤繁琐、收率低、副产物多、分离纯化困难、环境不友好等缺点。

本发明涉及的微生物转化方法代替了传统的从杉科植物中直接提取制备 10-DAB的方法，具有操作简单、反应专一性好、成本低、反应条件温和、产物易 于分离纯化等优点。对用微生物转化方法制备天然药物具有非常重要的意义。

附图说明

图1为本发明中巴卡亭III转化生成10-DAB的反应方程式；

图2为本发明菌株TolumonasosonensisCGMCCNo.7562转化巴卡亭III生成 10-DAB的TLC结果。1：菌体对照，2：转化液样品，3：巴卡亭III标准品(0.3mg/mL)， 4：10-DAB标准品(0.1mg/mL)；

图3为本发明菌株TolumonasosonensisCGMCCNo.7562转化巴卡亭III生成 10-DAB的HPLC结果。图3-1：巴卡亭III(0.3mg/mL)和10-DAB(0.1mg/mL) 的混合标准品；图3-2：转化液样品；

图4为本发明菌株TolumonasosonensisCGMCCNo.7562转化巴卡亭III反应的 转化产物的LC-MS图，图4-1：TOFMS负离子扫描模式，图4-2：TOFMS正离 子扫描模式。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述 性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明所涉及的菌株TolumonasOsonensisP2-A-1(以下简称T.Osonensis P2-A-1)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCCNo.7562，所涉及公开文献包括CN103509735A。

以下实施例中所用到的培养基与缓冲液为：

所用培养基：

①胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)(L^-1)：胰蛋白胨17.0g、大豆蛋白胨3.0g、 NaCl5.0g、K₂HPO₄2.5g、葡萄糖2.5g、pH＝7.3，115℃灭菌20min。

②LB(Luria-Bertani)液体培养基(L^-1)：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10 g，调节pH＝7.2。121℃灭菌20min。

所用缓冲液：

50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2)：配制50mmol/L磷酸氢二钾溶液300mL，用 50mmol/L磷酸二氢钾溶液将pH调至7.2。

具体论述如下：

一、菌株T.OsonensisP2-A-1转化巴卡亭III实验主要步骤如下：

⑴一级种子培养

将T.OsonensisP2-A-1作为生产菌株从TSB斜面培养基上接一满环到50mLLB 液体培养基的250mL三角瓶中，22℃200r/min振荡培养1d，得到适于接种的种 子培养液。

⑵二级发酵培养

将种子培养液以5％的接种量接种到装有50mLLB液体培养基的250mL三角 瓶中，22℃200r/min振荡培养1d

⑶转化实验

向二级发酵培养液中加入1.5mg/mL的巴卡亭III甲醇溶液2mL，37℃200r/min 继续振荡培养3d。实验中，以不投加底物溶液的培养液作为空白对照。

转化结束后加入50mL氯仿，37℃200r/min振荡萃取1h，然后经5000r/min 离心5min，得到氯仿萃取液。用等体积的氯仿萃取三次，合并萃取液，旋蒸以挥 干有机溶剂。蒸干后的样品用1mL甲醇复溶，用0.22μm滤膜进行过滤，滤液即为 待测样品溶液，用高液相色谱法计算转化率和产物生成率。

转化产物分析

①薄层层析分析(TLC)

展开剂采用丙酮：石油醚＝2：3(v/v)，显色剂采用硫酸：乙醇＝1：9(v/v)， 105℃下烘烤显色1-3min，观察斑点的颜色并计算比移值。

②高效液相色谱分析(HPLC)

色谱条件为：PhenomenexC18(5μm，250mm×4.6mm)；流动相：甲醇：乙 腈：水(10：33：57，v/v/v)；检测波长：227nm；流速：0.8mL/min；柱温：30℃； 进样量：10μL。

③高效液相色谱质谱联用分析(LC-MS)

利用制备型硅胶板对转化产物进行分离，展开剂为丙酮：石油醚＝2：3(v/v)，显色 剂为硫酸：乙醇＝1：9(v/v)，105℃下烘烤显色1-3min后，在254nm紫外灯下观察 层析板，用铅笔在转化产物斑点所在位置处划出范围，用刀片小心刮下并收集此范围内的硅胶 于2.0mLEppendorf管中，用1mL甲醇将产物从硅胶中反复洗脱下来，进行LC-MS分析。

色谱条件为：WatersC18色谱柱(100mm×2.1mm)；流动相：5-95％乙腈 (0.1％FA-乙腈)，0-10min；流速：0.4mL/min；柱温：40℃，进样量10μL。质谱 条件：电离源：电喷雾电离(ESI)；检测模式：多反应监测；毛细管电压：3kV；脱 溶剂气温度：400℃；脱溶剂气流量：800L/h；锥孔气流量：30L/h；离子源温度： 350℃；碰撞气流速0.12mL/min。

⑷按此方法进行实验，结果发现在TLC板上菌株T.OsonensisP2-A-1的转化液 样品中出现了三个明显的斑点，其中，按照距离点样位置由近到远的顺序观察到的 斑点A和B的比移值R_f分别和10-DAB和巴卡亭III标准品的R_f值相同，分别为0.12 和0.25。转化液样品的HPLC图在10-DAB保留时间附近出现了明显的分离峰，可 初步判断转化液样品中含有10-DAB。而转化产物的TOFMS负离子谱图中又观察 到分子量为544.2256的分离峰，正好比底物巴卡亭III少一个乙酰基，并与分子式 为C₂₉H₃₆O₁₀的10-DAB分子量一致。

综合TLC、HPLC、LC-MS分析的结果可知，转化得到的产物确实为10-DAB， 说明菌株T.OsonensisP2-A-1能将巴卡亭III转化生成10-DAB。

二、菌株T.OsonensisP2-A-1经不同破碎方式处理后转化巴卡亭III的能力

分别采用化学法、物理法、干燥法等方式对菌体细胞进行破碎，再进行底物转 化实验，采用HPLC方法，以底物转化率和10-DAB的生成率为指标，比较不同菌 体破碎方式对转化反应效率的影响。

⑴将菌株T.OsonensisP2-A-1接种到装有50mLLB液体培养基的250mL三角 瓶中，22℃200r/min培养2d。培养液离心(7000r/min，4℃，10min)，倒去上清 液，收集沉淀湿菌泥，并测定菌泥质量，待用。

⑵转化细胞的制备

①完整细胞

收集湿菌泥6g，用50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2)制成菌体悬浮液5mL，用 于后续实验。

②不同方式破碎后的细胞

I.化学法

⑴甲苯处理破碎法

收集湿菌泥6g，按照每2g湿菌泥中加入0.04gNaHCO₃和8mL甲苯的比例， 37℃，200r/min振荡2.5h，离心(5000r/min，4℃，10min)，倒去甲苯，收集下层 沉淀，用50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2)制成菌体悬浮液5mL，用于后续实验。

⑵丙酮处理破碎法

收集湿菌泥6g，加入200mL预冷至4℃的丙酮，混匀，置于4℃冰箱中30min， 离心(5000r/min，4℃，10min)，弃去上清液，干燥去除残余丙酮，收集下层沉淀， 用50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2)制成菌体悬浮液5mL，用于后续实验。

⑶异丙醇处理破碎法

收集湿菌泥6g，用异丙醇浸泡湿菌泥(异丙醇：湿菌泥＝9：1(v/w))120min， 倒去异丙醇，收集下层沉淀，用50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2)制成菌体悬浮液5 mL，用于后续实验。

II.物理法

⑴超声波破碎法

收集湿菌泥12g，用50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2)制成菌体悬浮液10mL， 将所制悬浮液分为两组，每组5mL。将超声波细胞粉碎机变幅杆伸入悬浮液的液面 下1cm，功率为90W、频率为20kHz。分别采取两组工作条件。A组：工作15s， 休息30s，10个循环；B组：工作60s，休息60s，8个循环。将上述菌体破碎液 离心(5000r/min，4℃，10min)，收集上清液，用于后续实验。

⑵反复冻融破碎法

收集湿菌泥6g，用50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2)制成菌体悬浮液5mL，置 于-20℃冰箱内冻结，然后在室温下缓慢地融化，如此反复6次，得到的菌体裂解 液用于后续实验。

⑶冷热交替破碎法

收集湿菌泥6g，用50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2)制成菌体悬浮液5mL，放 入90℃水浴中维持30min，马上取出置于冰浴，静置15min，使之迅速冷却^[28]， 得到的菌体裂解液用于后续实验。

III.干燥破碎法

收集湿菌泥6g，置于30℃左右热空气流中吹干。用50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.2)将菌泥悬浮制成悬浮液5mL，用于后续实验。

(3)转化实验

向试管中加入上述经各种方法破碎后的菌悬液4.5mL和1.5mg/mL的巴卡亭III 甲醇溶液0.5mL(此时巴卡亭III的终浓度为0.15mg/mL)，旋涡混合器1800r/min 振荡5min混匀。将试管置于37℃摇床，200r/min进行转化反应，反应72h。通过 加入2.5mL氯仿终止反应，并继续振荡(37℃，200r/min)3h进行萃取，最后将 氯仿有机相移至小玻璃瓶中，室温下挥干溶剂，并向小玻璃瓶中加入2.5mL甲醇溶 解样品，超声波振荡混匀后用0.45μm滤膜过滤，滤液即为待测样品溶液。实验中， 以相同质量的完整细胞的转化液作为对照。利用HPLC测定样品中巴卡亭III和 10-DAB的含量。

(4)转化结果

⑴按此方法进行实验，结果发现完整细胞转化时，底物巴卡亭III的转化率为 45％，10-DAB生成率为2.1％。

⑵采用甲苯破碎、异丙醇破碎、反复冻融破碎、丙酮破碎、冷热交替破碎方法 处理后的菌体进行转化时，底物巴卡亭III的转化率均较完整细胞(45.0％)时有所提 高，分别为77.0％、74.4％、56.7％、53.3％、52.4％，其中菌体经甲苯破碎处理后对 底物对的转化率提高显著。

⑶采用甲苯破碎、丙酮破碎、反复冻融破碎、超声破碎B组、干燥破碎、超声 破碎A组处理后的菌体进行转化时，产物10-DAB的生成率均比完整细胞有所提高， 分别为12.0％、4.0％、3.9％、3.8％、3.2％、3.1％，其中，菌体经甲苯破碎处理后进 行转化，产物生成率提高显著。由此可推断出，甲苯破碎处理后，菌体表现出最高 的转化效率。

10-DAB广泛分布于红豆杉植物的树叶、根、皮、枝干中。其制备方法主要是 从杉科植物中提取，但该方法存在收率较低、环境不友好性等缺点。

本发明提供的菌株能够直接发酵生产10-DAB，用微生物转化技术将巴卡亭III 转化生成10-DAB的过程则具有专一性高，副产物生成少，反应条件温和、环境友 好等优点。