一种酸性磷酸酶活性的测定方法

摘要

本发明公开了一种测定酸性磷酸酶活性的方法，所述方法以L-抗坏血酸-2-磷酸作为酸性磷酸酶的催化底物，该底物在酸性磷酸酶的催化下水解为L-抗坏血酸，由于L-抗坏血酸可以将二价铜还原成一价铜，使得作为显色探针的二价铜复合物转化为深色的一价铜复合物，样品中酸性磷酸酶活性越高，检测液颜色变化越明显，从而实现对酸性磷酸酶活性的半定量比色分析或用紫外-可见分光光度计进行定量检测。通过本发明的方法，能检测到0.48？mU·mL

说明书

技术领域

本发明属于生物分析技术领域，具体涉及一种酸性磷酸酶活性的测定方法，尤其 涉及一种基于比色分析快速测定酸性磷酸酶活性的方法。

背景技术

酸性磷酸酶(acidphosphatase,EC3.1.3.2,ACP)主要存在于巨噬细胞，定位于溶酶体 内，能催化磷酸单酯的水解反应，产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖等。正常人血清 中的ACP主要来源于前列腺、骨、肝、肾、脾、胰等组织，不论男女老幼，其含量大 致相同。而前列腺疾病患者以及出现变形性骨髓炎、成骨不全、软骨病、骨肉瘤、多 发性骨髓瘤、原发性骨肿瘤、甲状腺功能亢进、白血病、乳腺癌、心肌梗死、肝炎、 肝硬化、胆囊炎、溶血性疾病和急性尿潴留等疾病时，血清中ACP的水平都会明显升 高。例如，临床研究表明，在前列腺癌患者体内，ACP水平明显升高，其升高程度与 前列腺癌的病情基本呈平行关系：当病情好转时，ACP水平逐步降低；再次升高时， 常提示癌症有复发、转移及预后不良。由此可见，如何简单、有效、快速地测定ACP 的活性，尤其是成分复杂的临床组织和血清样品中ACP的活性，对前列腺癌的辅助诊 断，尤其对晚期前列腺癌的诊断、疗效观察及预后监测具有重要的临床价值和广泛的 应用前景。

目前，测定ACP活性的方法主要包括以下几种：(1)对硝基苯磷酸二钠法：在酸 性条件下，对硝基苯磷酸二钠在ACP的催化作用下生成黄色的水溶性产物对硝基苯 酚，该产物在405nm处有光吸收，通过测定其吸光度值，并与标准曲线进行比较， 即可对ACP活性进行定量分析；(2)Gomori硝酸铅法：在酸性条件下，以β-甘油磷酸 钠为底物，由ACP催化水解释放出磷酸，磷酸与硝酸铅结合形成无色的磷酸铅沉淀， 经硫化胺处理形成棕黑色的硫化铅沉淀；(3)磷酸苯二钠法：在酸性条件下，ACP水 解磷酸苯二钠产生游离酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化 钾氧化形成红色醌类化合物，其颜色深浅与ACP活性成正比。由此可见，在临床检测 中，测定ACP活性的方法主要是基于溶液颜色的深浅变化(即溶液对光的选择性吸收) 来对物质含量进行定量测定的比色分析法，这是由于比色分析法具有设备简单、分析 速度快、准确度高、重现性好和适合大批量样品等优良特性。然而，上述几种方法都 具有灵敏度低，抗干扰能力差，检测过程繁琐等缺点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种酸性磷酸酶活性的测定方法，特别是一种基于比色分 析测定酸性磷酸酶活性的方法。本发明的方法灵敏度高，选择性好，抗干扰能力强， 重复性好，操作简单，检测时间短，成本低廉，可用于血清样品中酸性磷酸酶活性的 定量测定，为临床样品中酸性磷酸酶活性的检测提供了一种快速、简便、低廉、灵敏 且性能稳定的比色分析方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术解决方案：

一种酸性磷酸酶活性的测定方法，包括以下步骤：将含有L-抗坏血酸-2-磷酸、二 价铜离子、水溶性菲绕啉衍生物的缓冲液与待测酸性磷酸酶溶液孵育后，根据检测液 的颜色变化对样品中酸性磷酸酶活性进行半定量比色检测或用紫外-可见分光光度计 进行定量检测。

所述缓冲液为50mMpH5.7的甘氨酸-盐酸缓冲液。

所述检测液中，L-抗坏血酸-2-磷酸的浓度为50nM～100mM，优选为10mM。

所述检测液中，二价铜离子的浓度为5nM～10mM，优选为0.2mM。

所述水溶性菲绕啉衍生物包括红菲绕啉二磺酸盐、浴酮灵二磺酸盐等。

所述检测液中，水溶性菲绕啉衍生物的浓度为0.01～20mM，优选为0.4mM。

所述孵育温度为20～37℃，优选为25℃。

所述孵育时间为0.5～150min，优选为15min。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

①本发明的方法对酸性磷酸酶活性的检出限为0.48mU·mL^-1，具有灵敏度高，选 择性好，抗干扰能力强，重复性好，操作简单，检测时间短和成本低廉等优点；

②本发明所需仪器设备普及化程度高，所需试剂均为商业化产品，对操作人员 无特殊技术要求，并可实现半定量比色分析；

③本发明的方法可用于临床样品中酸性磷酸酶活性的快速、高灵敏检测，而且 可以大大降低检测费用和检测成本。

附图说明

图1是本发明酸性磷酸酶活性的测定方法的原理图。

图2是本发明方法比色分析酸性磷酸酶活性的可行性分析及照片。其中，A为所 有试剂都加，B为不加酸性磷酸酶，C为不加L-抗坏血酸-2-磷酸，D为不加浴酮灵二 磺酸盐-二价铜离子。

图3是本发明中紫外-可见吸收光谱随酸性磷酸酶活性的变化曲线及照片(A)和标 准工作曲线(B)。

图4是本发明方法比色分析酸性磷酸酶活性的选择性分析及照片。其中，A为酸 性磷酸酶，B为牛血清白蛋白，C为血红蛋白，D为辣根过氧化物酶，E为链酶抗生 素蛋白，F为凝血酶，G为胰蛋白酶，H为对照。

图5是本发明方法比色分析酸性磷酸酶活性在血清样品中的分析特性及照片。其 中，A为在甘氨酸-盐酸缓冲液中，B为在10％正常人血清样品中，C为在5％正常人 血清样品中。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，本领域技术人员将会理解， 以下实施例仅为本发明的优选实施例，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定 本发明的范围。

图1示出了本发明一种酸性磷酸酶活性的测定方法的原理，该检测原理具体如下 (以浴酮灵二磺酸盐为例)：

酸性磷酸酶催化水解L-抗坏血酸-2-磷酸生成L-抗坏血酸，L-抗坏血酸将二价铜 离子还原成一价铜离子，使得二价铜-浴酮灵二磺酸盐复合物转化为一价铜-浴酮灵二 磺酸盐复合物，从而导致溶液颜色和吸光度的变化。由于二价铜-浴酮灵二磺酸盐复合 物溶液为淡黄色，一价铜-浴酮灵二磺酸盐复合物溶液为棕黄色，通过观察溶液颜色变 化，即可对样品中酸性磷酸酶活性进行半定量比色分析。此外，由于一价铜-浴酮灵二 磺酸盐复合物在484nm处产生一个新的吸收峰，其强度与一价铜-浴酮灵二磺酸盐复 合物的浓度成正比，因此可通过紫外-可见分光光度计对样品中酸性磷酸酶活性进行定 量检测。本发明的方法对酸性磷酸酶活性的检测范围是0～100mU·mL^-1，检出限为0.48 mU·mL^-1。本发明的方法灵敏度高，选择性好，抗干扰能力强，重复性好，操作简单， 检测时间短(～15min)，成本低廉，可用于血清样品中酸性磷酸酶活性的定量测定，为 临床样品中酸性磷酸酶活性的检测提供了一种快速、简便、低廉、灵敏且性能稳定的 比色分析方法。

实施例1：本发明方法比色分析酸性磷酸酶活性的可行性分析。

将20μL酸性磷酸酶溶液(100mU·mL^-1)与20μLL-抗坏血酸-2-磷酸(0.3M)，10μL 硫酸铜-浴酮灵二磺酸钠复合物(硫酸铜：12mM，浴酮灵二磺酸钠：24mM)和550μL 甘氨酸-盐酸缓冲液(50mM，pH5.7)均匀混合，所得到的混合液在25℃下孵育15min， 然后测量溶液在800～300nm范围内的紫外-可见吸收光谱并用数码相机记录溶液的颜 色变化，如图2所示。其中，A为所有试剂都加，B为不加酸性磷酸酶，C为不加L- 抗坏血酸-2-磷酸，D为不加硫酸铜-浴酮灵二磺酸钠复合物，所不加的试剂用等量50 mMpH5.7的甘氨酸-盐酸缓冲液替代。从图2可以看出，15min后，对照组溶液的吸 收光谱和颜色均没有发生显著变化，而实验组溶液在484nm处则有很强的吸收，并 且溶液颜色发生了显著的变化。由此可见，本发明比色分析酸性磷酸酶活性的方法具 有相当好的可行性。

实施例2：检测液的紫外-可见吸收光谱及颜色变化与酸性磷酸酶活性之间的关系。

将20μL的0，10，20，30，40，50，60，70，80，90和100mU·mL^-1的酸性磷 酸酶溶液分别与含有20μLL-抗坏血酸-2-磷酸(0.3M)，10μL硫酸铜-浴酮灵二磺酸钠 复合物(硫酸铜：12mM，浴酮灵二磺酸钠：24mM)和550μL甘氨酸-盐酸缓冲液(50 mM，pH5.7)的溶液均匀混合，所得到的混合液在25℃下孵育15min，然后测量溶液 在800～300nm范围内的紫外-可见吸收光谱并用数码相机记录溶液的颜色变化，如图 3所示。从图3(A)可以看出，随着样品中酸性磷酸酶活性的增加，检测液在484nm处 的吸收值相应增大。从图3(B)可以看出，以检测液在484nm处的吸收值对样品中酸 性磷酸酶活性作图，可以得到很好的定量关系，其检测范围为0～100mU·mL^-1(R²＝0.9997)，检测下限为0.48mU·mL^-1。

实施例3：本发明方法比色分析酸性磷酸酶活性的选择性分析。

将20μL1mg·mL^-1的酸性磷酸酶(A)，牛血清白蛋白(B)，血红蛋白(C)，辣根过氧 化物酶(D)，链酶抗生素蛋白(E)，凝血酶(F)，胰蛋白酶(G)或50mMpH5.7的甘氨酸- 盐酸缓冲液(H)分别与含有20μLL-抗坏血酸-2-磷酸(0.3M)，10μL硫酸铜-浴酮灵二磺 酸钠复合物(硫酸铜：12mM，浴酮灵二磺酸钠：24mM)和550μL甘氨酸-盐酸缓冲液 (50mM，pH5.7)的溶液均匀混合，所得到的混合液在25℃下孵育15min，然后测量 溶液在484nm处的吸收值并用数码相机记录溶液的颜色变化，如图4所示。从图中 可以看出，除酸性磷酸酶外，其他干扰蛋白均不会引起检测液在484nm处的吸收值 或颜色发生明显改变。由此可见，本发明比色分析酸性磷酸酶活性的方法具有很好的 选择性。

实施例4：本发明比色分析酸性磷酸酶活性的方法在血清样品中的分析特性。

将20μL酸性磷酸酶溶液(100mU·mL^-1)与20μLL-抗坏血酸-2-磷酸(0.3M)，10μL 硫酸铜-浴酮灵二磺酸钠复合物(硫酸铜：12mM，浴酮灵二磺酸钠：24mM)和550μL 甘氨酸-盐酸缓冲液(50mM，pH5.7)均匀混合，所得到的混合液在25℃下孵育15min， 然后测量溶液在484nm处的吸收值并用数码相机记录溶液的颜色变化，如图5所示。 其中，A为在50mMpH5.7的甘氨酸-盐酸缓冲液中，B为在10％正常人血清样品中， C为在5％正常人血清样品中。从图5可以看出，本发明方法对相同活性的酸性磷酸 酶在血清样品中与在缓冲液中在484nm处的吸收值以及溶液颜色变化均没有显著差 别。由此可见，本发明比色分析酸性磷酸酶活性的方法可用于血清样品中酸性磷酸酶 活性的定量测定，具有极高的临床应用价值。