一种小麦抗赤霉病基因Tafhb1及其应用

摘要

本发明公开了一种小麦抗赤霉病基因Tafhb1及其应用。一种小麦抗赤霉病基因Tafhb1，cDNA序列如SEQ？ID？NO.1所示。本发明所述的小麦抗赤霉病基因Tafhb1编码的蛋白TaFHB1，氨基酸序列如SEQ？ID？NO.2所示。该蛋白包含274个氨基酸,等电点为10.85。本发明提供了一种新的小麦抗赤霉病基因Tafhb1。通过杂交和多代回交将本发明提供的小麦抗赤霉病基因Tafhb1转入小麦中,可以提高小麦的赤霉病抗性。由于该基因是粮食作物小麦本身存在的内源基因，因此该基因的存在不会影响植物的食品安全性，可在作物育种中应用。

说明书

技术领域

本发明属于分子育种领域，涉及一种小麦抗赤霉病基因Tafhb1及其应用。

背景技术

由禾谷镰刀菌(FusariumgraminearumSchwabe)引起的赤霉病(穗腐病)是小麦、 玉米、水稻、大麦等主要粮食作物的共有病害，在世界范围内都有发生。这种病害能够在小 麦成熟期的几周内摧毁一个高产小麦品种,使其产量降低，品质下降(Windels,2000)。被该 病原菌感染的小麦籽粒因含有大量的对动物和人体有害的单端孢霉烯和真菌毒素，动物服 用后会引起拒食、腹泻、呕吐、消化大出血和接触性皮炎等急性不良反应(Bennettand Klich2003)，从而不再适合于食用(Atanassozvetal.1994；McMullenetal.1997； Miedaneretetal.2010)。包括中国、欧盟和美国在内的很多国家或地区对单端孢霉烯和 真菌毒素在谷类食物中的含量进行了限制(Verstraete2008)。随着气候的变化和轮作制 度的推广，小麦赤霉病的发病范围在迅速蔓延，对小麦赤霉病的研究在过去的几年间已经 引起了广泛关注(Duveilleretal.2008)。相对于使用杀虫剂而言，培育抗赤霉病小麦品 种是控制小麦赤霉病最有效、最环保的策略(McMullenetal.1997；Pirgozlievet al.2003)。

大量研究表明，小麦赤霉病是一个数量性状(Buerstmayretal.2009)。目前，已 有7个抗赤霉病QTL/基因被成功定位并命名，但是尚未有克隆到抗赤霉病QTL的报道。我们 在我国特有的抗赤霉病种质望水白中定位了1个抗赤霉病主效QTL，位于Xbarc147.1 Xgwm493之间(Linetal.2004)，该位置被命名为Fhb1(Liuetal.2006)。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种小麦抗赤霉病基因Tafhb1。

本发明的另一目的是提供该小麦抗赤霉病基因Tafhb1编码的蛋白TaFHB1。

本发明的又一目的是提供该小麦抗赤霉病基因Tafhb1的应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种小麦抗赤霉病基因Tafhb1,cDNA如SEQIDNO.1所示。

本发明所述的小麦抗赤霉病基因编码的蛋白TaFHB1，氨基酸序列如SEQIDNO.2 所示。该蛋白包含274个氨基酸,等电点为10.85。

编码本发明所述的蛋白TaFHB1的基因。其核苷酸序列包括但不限于SEQIDNO.1 所示序列，还可以是经过密码子优化的编码蛋白TaFHB1的其他核苷酸序列。

本发明所述的小麦抗赤霉病基因Tafhb1在小麦品种改良中的应用。

本发明所述的基因Tafhb1在提高小麦抗赤霉病中的应用。

本发明所述的基因Tafhb1优选在提高水稻、玉米、大麦、黑麦、大豆等植物抗赤霉 菌中的应用。

有益效果：

本发明提供了一种新的小麦抗赤霉病基因Tafhb1及其编码的蛋白TaFHB1。通过杂 交和多代回交将本发明提供的小麦抗赤霉病基因Tafhb1转入小麦中,可以提高小麦的赤霉 病抗性。由于该基因是粮食作物小麦本身存在的内源基因，因此该基因的存在不会影响植 物的食品安全性，可在作物育种中应用。

附图说明

图1Xbarc147.1和Xgwm493之间的饱和遗传图谱

图2转基因小麦的PCR检测。

其中A为阳性对照携带有Tafhb1的小麦种质望水白；B为转基因实验受体材料 PH691，C为携带有Tafhb1的PH691近等基因系

图3转基因小麦的赤霉病抗性鉴定

其中A为转基因实验受体材料PH691，B为携带有Tafhb1的PH691近等基因系

具体实施方式

根据下述实施例,可以更好地理解本发明。然而,本领域的技术人员容易理解,实 施例所描述的仅用于说明本发明,而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发 明。

实施例1：FHB1候选基因的获得

根据Xbarc147.1和Xgwm493之间的小麦基因组序列(https:// urgi.versailles.inra.fr)，设计了61对在抗赤霉病材料望水白和感赤霉病材料南大2419 之间有多态的引物，它们在染色体上的排布如图1所示。对含有530个株系的F7重组自交系 群体(父本：望水白；母本：南大2419)进行赤霉病抗性鉴定，病原菌为本地强致病力菌株F4、 F15、F17及F34的等比例分生孢子混合液。取20μl(约1000个孢子)注入到麦穗中上部刚开的 小花中,接种后立即将穗子套上塑料袋，保持湿度，以保证赤霉菌发病。接种后15天调查每 个穗子的病小穗数。根据不同株系的病小穗数将Tafhb1定位于标记Xmag8937和Xmag9404之 间。利用Xmag8937和Xmag9404筛选望水白的BAC文库，获得一个存在这两对标记的扩增序列 的BAC克隆，将该BAC克隆送到华大基因公司测序，获得了Xmag8937和Xmag9404之间24.6kb 的序列。

序列分析显示在这一区域存在5个开放阅读框(ORF)。比较其同源性可知ORF1编码 逆转录转座子蛋白，ORF2编码一个多聚蛋白，ORF3和ORF5都编码假定蛋白，ORF4编码帖合酶 7蛋白。为了在这5个基因中确定Tafhb1的候选基因，我们对感病材料PH691和抗病材料苏麦 3号染色体上Xmag8937到Xmag9404之间的区域进行测序，结果显示抗病材料望水白和苏麦3 号在这一区域内的序列相同，望水白和PH691存在4个多态性位点，SNP1不会改变ORF1编码 的蛋白，SNP2不会改变ORF2编码的蛋白，插入缺失位点1位于ORF3和ORF4之间的基因间隔 区，对基因功能没影响，插入缺失位点2位于ORF5内，可导致编码氨基酸的改变，由此推测 ORF5即为Tafhb1的候选基因。

实施例2：Tafhb1的cDNA序列的获得

以抗病种质望水白的穗部cDNA作为模板，用英俊公司的Trizol试剂盒提取小麦穗 部的总RNA，采用Promega公司的反转录试剂盒进行反转录，合成单链cDNA。基于实施例1获 得的ORF5序列设计引物对P1，正向引物F：5'-ATGTGTATATTTGGACAACCATGTAGACAAGC-3'(SEQ IDNO.3)；反向引物R:5'-TTACACGAGTTGCTTCCCGTCACTGGGTTCAGC-3'(SEQIDNO.4)，进行 PCR扩增，扩增体系为25μL,包括5ng模板,F和R引物各5pmol,dATP,dTTP,dCTP和dGTP各 5nmol,37.3nmolMgCl₂,0.5单位的DNA聚合酶,1xPCR缓冲液。扩增的程序是:94℃变性3分 钟；30个循环,94℃变性20秒,58℃退火30秒,72℃延伸1分钟；最后72℃延伸5分钟。通过PCR 扩增,获得了包含开放读码框的822bp的cDNA核苷酸序列,将该核苷酸与T-载体在16℃连接 30min,连接体系为10μL，包括T-载体1μL，PCR产物4μL，连接酶1μL，连接酶缓冲液1μL，ddH₂O 3μL。连接产物通过42℃热击40秒，转化到大肠杆菌细胞中，送至华大基因公司测序，所得序 列如SEQIDNO:1所示，该基因命名为Tafhb1。该基因编码的蛋白共274个氨基酸，分子量为 32.73144千道尔顿，等电点为10.85，如SEQIDNO:2所示。

实施例3：转Tafhb1基因的小麦近等基因系赤霉病抗性得到提高

用抗赤霉病种质望水白和普通小麦材料PH691进行杂交，种植获得的F1代种子和 轮回亲本小麦材料PH691，将F1植株与PH691回交，种植获得的BC1F1代种子和轮回亲本小麦 材料PH691，在苗期的时候取两个小麦材料的叶片，采用SDS方法(Ma&Sorrells,1995)提取 DNA，用引物P1进行PCR扩增，取扩增出822bp目标带的BC1F1单株再次与PH691回交，获得 BC2F1种子，种植后，在苗期取小麦叶片，提取DNA，用引物对P1进行PCR扩增，取扩增出822bp 目标带的BC2F1单株与PH691回交，获得BC3F1种子，种植后，在苗期取小麦叶片，提取DNA，用 引物P1进行PCR扩增，取扩增出822bp目标带的BC3F1单株与PH691回交，获得BC4F1种子，种 植，在花期将穗部套袋自交一次，提取DNA，在全基因组范围内随机选择200对在望水白和 PH691之间有多态的SSR引物(http://wheat.pw.usda.gov/GG3/)，选取与最初的转育受体 PH691扩增带型完全一致的转Tafhb1基因的PH691近等基因系，即表明该转基因后的材料与 受体材料遗传背景一致，两个材料间仅Tafhb1区段存在差异。在花期对Tafhb1近等基因系 和转育受体PH691进行抗赤霉病鉴定，病原菌为本地强致病力菌株F4、F15、F17及F34的等比 例分生孢子混合液。取20μl(约1000个孢子)注入到麦穗中上部刚开的小花中,接种后立即 将穗子套上塑料袋，保持湿度，以保证赤霉菌发病。接种后15天调查每个穗子的病小穗数， 发现转Tafhb1基因的小麦近等基因系病小穗数明显少于对照小麦材料PH691(图3，表1)。

表1转基因材料和转育受体材料病小穗数