一株来自白花丹参植物内生真菌及其应用

摘要

本发明公开了一株来自白花丹参植物内生真菌及其应用，本发明筛选的菌株为白黄小脆柄菇(Psathyrella？candolleana)BDF15，已于2015年11月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC？No.11415。本发明筛选的菌株制备的复合酶的方法具有酶系完整、酶活性高、操作简单、成本低廉等优点，为制备复合酶提供了新途径，避免了现有技术中其它各种制备方法的局限性，具有很强的可操作性，适合于工业化大规模生产。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株来自白花丹参植物内生真菌及其应用。

背景技术

木质纤维素是地球上最为丰富的可再生生物质资源。我国木质纤维素类资源非常丰富， 秸秆、稻草、甘蔗渣、动物粪便等农业废弃物中含有大量的纤维素和木质素，但是这些资源 并没有被合理利用，而是被焚烧或者被随意丢弃。随着环境污染、能源亏缺、人口膨胀等问 题日趋严重，可作为一种潜在的可再生资源被加以利用，因此，国内外学者对木质纤维素降 解微生物进行了大量研究，但这些微生物处理后纤维素的降解率仍然不高，主要原因是木质 素的侧链与半纤维素以共价键结合，形成一个十分致密的网络结构，阻碍了微生物对纤维素 的降解。因此，要提高木质纤维素利用率，最好的方法是先降解木质素，其中漆酶是快速检 测木质素分解程度的重要指标，而后再对纤维素、半纤维素进行彻底降解。因此，本专利的 目的是寻找能高效降解木质素和纤维素的微生物菌株，用于提高秸秆等木质纤维素的利用率。

植物内生真菌(Plantendophyticfungi)是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活 于健康植物各种组织和器官内部或细胞间隙的真菌。内生真菌在长期与植物共生的过程中， 与木质纤维紧密接触，具有较高的纤维素酶、漆酶、果胶酶、木聚糖酶以及多酚氧化酶活性， 对木质素和纤维素有很好的降解能力，为筛选木质纤维素降解菌提供了一个良好的菌种来源。 目前采用单一菌株发酵生产选木质纤维素复合降解酶报道的较少，且现有菌种所产的复合酶 酶活较低，组成酶系也较单一，不能满足需要生产的需要。至今尚未见从白花丹参内生真菌 中筛选复合酶高产菌株的报道。

发明内容

本发明的目的就是为了解决上述问题，提供一株来自白花丹参植物内生真菌及其应用， 该菌株在产酶培养基中，产生丰富的木质纤维素复合降解酶。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一株来自白花丹参植物内生真菌，其为白黄小脆柄菇(Psathyrellacandolleana)BDF15， 已于2015年11月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC， 地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCCNo.11415。

一种菌剂，其活性成分为上述的白黄小脆柄菇(Psathyrellacandolleana)BDF15。

优选：上述菌剂为下述(1)-(4)任一菌剂：

(1)用于制备木质素纤维素复合降解酶的菌剂；

(2)用于降解木质素和纤维素的菌剂；

(3)用于提高农业废弃物利用率的菌剂；

(4)用于提取中草药或其废弃物有效成分的菌剂。

所述白黄小脆柄菇(Psathyrellacandolleana)BDF15在制备下述(1)-(4)任一菌剂中 的应用：

(1)用于制备木质素纤维素复合降解酶的菌剂；

(2)用于降解木质素和纤维素的菌剂；

(3)用于提高农业废弃物利用率的菌剂；

(4)用于提取中草药或其废弃物有效成分的菌剂。

优选：所述农业废弃物为秸秆、稻草、甘蔗渣或动物粪便。

优选：所述中草药为丹参。

上述白黄小脆柄菇(Psathyrellacandolleana)BDF15或以白黄小脆柄菇(Psathyrella candolleana)BDF15为活性成分的菌剂在制备木质素纤维素复合降解酶中的应用。

上述白黄小脆柄菇(Psathyrellacandolleana)BDF15或以白黄小脆柄菇(Psathyrella candolleana)BDF15为活性成分的菌剂制备在木质素纤维素复合降解酶时所用的发酵培养基 为：各成分的浓度比为：葡萄糖：麸皮：牛肉膏：KH₂PO₄：MgSO₄·7H₂O：硫酸铜＝20：20： 5：3：1.5：0.2。

优选：培养温度为28士1℃。

优选：摇瓶培养5～6天。

本发明所述的白黄小脆柄菇(Psathyrellacandolleana)BDF15的固体培养为马铃薯综合 培养基：马铃薯200g，麦麸50g，葡萄糖20g，MgSO₄1.0g，蛋白陈5.0g，琼脂20g，水 加至1000mL，自然pH。培养条件：28士1℃培养3～4天，菌落直径32～36mm，7-9天长 满整个培养皿；菌丝白色，毡状，不易挑取；菌落干燥，不透明，与培养基结合紧密。

本发明所述的白黄小脆柄菇(Psathyrellacandolleana)BDF15，其产酶筛选培养基(即 产纤维素酶培养基)组成为：羧甲基纤维素钠(CMC-Na)20g，蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 5g，KH₂PO₄1.0g，MgSO₄.7H₂O0.2g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，自然pH。产漆酶培养 基：PDA-愈创木酚(0.04％)培养基。

本发明所述的白黄小脆柄菇(Psathyrellacandolleana)BDF15的产酶发酵培养基组成为： 葡萄糖20g，麸皮20g，牛肉膏5.0g，KH₂PO₄3.0g，MgSO₄·7H₂O1.5g，硫酸铜0.2g， 加水至1000mL；摇瓶培养5～6天，培养温度28士1℃；发酵培养特征：培养第1天，未 见明显生长现象，培养第2天，有菌丝球出现，4天后培养液中白色菌球数量增多，直径变 大；培养第5-6天，菌丝球数量达到最大量，到了7～9天，菌丝球集结，发酵液颜色变黄。

菌株BDF15在产酶培养基中，28士1℃振荡培养5～6d后，产生丰富的木质纤维素复合 降解酶，该复合酶包括纤维素降解酶(FPA，CMCase，C1酶，β-葡萄糖苷酶)、木质素降解 酶漆酶以及果胶酶、木聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶等辅助酶。酶活力分别为：FPA53.26U/mL， CMCase73.35U/mL，C1酶52.22U/mL，β-葡萄糖苷酶68.28U/mL，漆酶452.84U/mL，果 胶酶13.43U/mL、木聚糖酶27.21U/mL、蛋白酶45.52U/mL、淀粉酶12.54U/mL，发酵液 经8层纱布过滤后，5000r·min^-1离心5min，取上清液即为复合酶粗制剂。

本发明的有益效果：

实验证明，本发明是从白花丹参根样品中经过层层筛选，最终筛选出了白黄小脆柄菇 (Psathyrellacandolleana)BDF15，该菌株能够产生木质素纤维素复合降解酶，提高了木质 素的降解效率，降低了成本。

本发明筛选的菌株制备的复合酶的方法具有酶系完整、酶活性高、操作简单、成本低廉 等优点，为制备复合酶提供了新途径，避免了现有技术中其它各种制备方法的局限性，具有 很强的可操作性，适合于工业化大规模生产。

保藏说明

菌种名称：白黄小脆柄菇

拉丁名：(Psathyrellacandolleana)

菌株编号：BDF15

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2015年11月4日

保藏中心登记入册编号：CGMCCNo.11415

附图说明

图1为白黄小脆柄菇(Psathyrellacandolleana)BDF15在马铃薯综合培养基上的生长特征；

图2为白黄小脆柄菇(Psathyrellacandolleana)BDF15在PDA-愈创木酚平板上的产漆酶 情况，其中，A.BDF15培养3d时产生的漆酶氧化圈(正面)；B.BDF15培养3d时产生的漆 酶氧化圈(背面)；C.BDF15培养5d时产生的漆酶氧化圈(正面)；D.BDF15培养5d时产 生的漆酶氧化圈(背面)；

图3为白黄小脆柄菇(Psathyrellacandolleana)BDF15在液体产酶培养中的生长状况。

具体实施方式

下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

马铃薯综合培养基：马铃薯200g，麦麸50g，葡萄糖20g，MgSO₄1.0g，蛋白陈5.0g， 琼脂20g，水加至1000mL，自然pH。

PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，自来水1000mL，自然pH。

产纤维素酶筛选培养基组成为：羧甲基纤维素钠(CMC-Na)20g，蛋白胨10g，酵母粉5g， NaCl5g，KH₂PO₄1.0g，MgSO₄.7H₂O0.2g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，自然pH。

产漆酶培养基：PDA-愈创木酚(0.04％)培养基，具体成分包括:马铃薯200g，葡萄糖 20g，琼脂15～20g，愈创木酚0.4g，自来水1000mL。

产酶发酵培养基组成为：葡萄糖20g，麸皮20g，牛肉膏5.0g，KH₂PO₄3.0g，MgSO₄·7H₂O 1.5g，硫酸铜0.2g，加水至1000mL。

一、白黄小脆柄菇(Psathyrellacandolleana)BDF15分离

从山东省泰安市泰山(海拔800m)采集健康无病症的白花丹参(SalviamiltiorrhizaBunge. f.albaC.Y.WuetH.W.Li)，去腐叶，用清水洗去泥沙及其它杂质，冲洗干净，置于滤纸上 自然风干。将白花丹参的根切成约0.5cm的小段，置于干净的培养皿中。在超净工作台中， 用75％乙醇处理2min，无菌水冲洗5次，0.1％升汞处理5min，再用无菌水冲洗5次，最后再 用75％酒精漂洗30S，无菌水冲洗5次，用灭菌滤纸吸干多余水分。用无菌的刀片将材料外皮 剥去后，切成0.2cm×0.2cm的小片，置于添加青霉素的PDA培养基中，25℃恒温培养14天。 同时将上述经表面灭菌的材料不做任何处理直接种植于PDA培养基中，同条件培养，作为对 照观察，目的检查表面消毒是否彻底。培养3～7d后及时采用尖端菌丝挑取法，挑取材料切口 处长出的菌丝，转接到新鲜PDA培养基上进一步培养，纯化3～4次以保证所得菌落为纯培养， 将此菌株命名为BDF15。斜面保存备用。

二、白黄小脆柄菇(Psathyrellacandolleana)BDF15鉴定

将上述菌株BDF15进行如下生理生化、菌形态的鉴定：

(1)菌落形态特征：菌株BDF15的菌落形态如图1所示，其菌丝白色，毡状，较厚； 不易挑取；菌落干燥，不透明，与培养基结合紧密，为不产孢真菌。

(2)分子鉴定：

采用改良SDS法提取的DNA条带清晰、整齐，无弥散和拖尾现象，无杂质污染；利用 ITS通用引物ITS1和ITS4，进行ITS扩增分析，得到长度为1054bp的单一DNA条带，其 ITSrDNA序列如SEQIDNo.1所示。

综合上述特征，依据《真菌鉴定手册》，本发明菌株BDF15为白黄小脆柄菇(Psathyrella candolleana)，归属于伞菌目、鬼伞科、脆柄菇属。该菌株于2015年11月4日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo11415。

三、白黄小脆柄菇(Psathyrellacandolleana)BDF15的固体平板培养

将菌株BDF15在马铃薯综合培养基和马铃薯葡萄糖培养基(PDA培养基)中，28士1℃ 培养，其菌丝生长状况不尽相同。如图1所示，在马铃薯综合培养基上内生真菌菌丝生长菌 丝亮白，丝绒状，粗壮致密，长势旺，28士1℃培养3～4天，菌落直径32-36mm，7～9天 长满整个培养皿；PDA培养基上菌丝较白，长势一般。

四、白黄小脆柄菇(Psathyrellacandolleana)BDF15在固体产酶培养基上产酶情况

用无菌打孔器将平板菌种制成直径5mm的菌饼，取菌饼1片接种到产纤维素酶筛选培养 基，28℃培养5～7天，每天定时观察菌落生长和菌落周围颜色的变化情况，到第6天，纤维素 酶活性达到最高。将菌株转接PDA-愈创木酚平板，28℃条件下继续培养5～7天，每天测量菌 丝圈、紫色氧化圈直径，记录氧化圈颜色深浅，到第5天，其生长量和产酶量达到最大，BDF15 的菌丝直径和漆酶氧化带直径分别为4.1和3.3cm(图2)。

五、白黄小脆柄菇(Psathyrellacandolleana)BDF15液体发酵及粗酶液制备

将直径为5.0mm的菌饼2块，接入100mL产酶发酵培养基(250mL三角瓶)，120r/min， 28℃振荡培养5～6d后(图3)，发酵液经8层纱布滤过后于5000r/min离心5min，取上清液， 即为复合酶粗酶液。复合酶中漆酶活性最高，为452.84U/mL；其次是纤维素降解酶，其中FPA 53.26U/mL，CMCase73.35U/mL，C1酶52.22U/mL，β-葡萄糖苷酶68.28U/mL；其他辅助酶 中，果胶酶13.43U/mL、木聚糖酶27.21U/mL、蛋白酶45.52U/mL、淀粉酶12.54U/mL。

5.1漆酶活性测定：利用ABTS法测定酶活。反应总体积3mL中，含0.1mL酶液，1.9mL 0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH＝4.5)，加入1.0mL0.5mmol/LABTS以启动反应，30℃ 水浴保温4min，后沸水浴灭酶1min，测420nm吸光值。1个酶活力单位(U)是指在上述条 件下，反应体系中每分钟催化1umolABTS氧化所需酶量。(420nm处ABTS的摩尔吸光系 数ε420＝3.6*10⁴cm^-1·L·mol^-1)

5.2滤纸酶活力(FPA)的测定:取0.5mL酶液和1.5mL0.05mol/L的柠檬酸缓冲液(pH4.5), 加入滤纸条50mg(新华定量滤纸,约1cm×6cm),50℃水浴1h。在上述条件下，每小时由底物 生成1μmol葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。反应后采用DNS法测定酶解产生 的还原糖量。

5.3CMCase酶活力的测定:取1.5mL1％CMC2Na柠檬酸缓冲液(pH5.0),加入酶液0.5mL, 50℃水浴30min。在上述条件下,每小时由底物生成1μmol葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活 力单位(U)。反应后采用DNS法测定酶解产生的还原糖量。

5.4β-葡萄糖苷酶活力的测定:取0.5mL酶液和1.5mL水杨酸苷柠檬酸缓冲液(pH4.5), 50℃水浴1h。在上述条件下,每小时由底物生成1μmol葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单 位(U)。反应后采用DNS法测定酶解产生的还原糖量。

5.5果胶酶活力的测定:取0.25％果胶溶液0.5mL，蒸馏水1mL，酶液0.5mL，摇匀。50℃ 水浴1h。加入1.5mLDNS，煮沸5min，定容至20mL，在540nm下测吸光值。在上述条件下， 每小时催化生成1μmol半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活单位(U)。

5.6木聚糖酶活力的测定:取pH6.5PBS缓冲液2.2mL和1％的木聚糖溶液0.6mL，再加入 0.2mL经适当稀释后的酶液，50℃水浴10min，加入2mLDNS终止反应，沸水浴10min，定容至 20mL，540nm处测吸光值。在上述条件下,每分钟水解生成1μmol还原糖(以木糖/葡萄糖计)所 需的酶量为一个酶活力单位(U)。

5.7蛋白酶活力的测定:取1％酪蛋白0.5mL和酶液1mL,40℃水浴10min。加入0.4mol/L三氯 乙酸3mL终止反应。3000r/min离心3min。吸取上清1mL。加入5mL0.4mol/LNa₂CO₃和0.5mL 福林-酚试剂，40℃水浴20min，在650nm下测吸光值。在上述条件下,每小时由底物产生1μmol 酪氨酸所需的酶量为一个酶活单位(U)。

5.8淀粉酶活力的测定:取2mL酶液及pH5.5的柠檬酸缓冲溶液2mL，1％淀粉溶液2mL， 摇匀，在40℃水浴5min，加入0.4mol/LNaOH4mL终止反映，吸取反应2mL，加入2mLDNS， 沸水浴5min,定容至20mL，540nm下测吸光值。在上述条件下以每分钟催化生成1μmol葡萄糖 所需的酶量为一个酶活单位(U)。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限 制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付 出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。