法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2019-08-16
授权
授权
2019-08-13
专利申请权的转移 IPC(主分类):C07K14/46 登记生效日:20190725 变更前: 变更后: 申请日:20140606
专利申请权、专利权的转移
2016-06-01
实质审查的生效 IPC(主分类):C07K14/46 申请日:20140606
实质审查的生效
2016-05-04
公开
公开
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体地说,本发明涉及鳐血管生成抑制因子1功能区变体。
背景技术
鳐血管生成抑制因子1功能区以下简称鳐功能区,鳐血管生成抑制因子1是从南海海域一种鳐组织中分离出来的蛋白质(分子量42KD)。研究结果显示:鳐血管生成抑制因子1显著抑制鸡胚绒毛尿囊膜本身的及人鼻咽癌细胞诱导的鸡胚绒毛尿囊膜血管生成;无论是腹腔注射还是灌胃都显著抑制裸小鼠Lewis肺癌的生长和转移,减少肿瘤组织微血管密度,下调促血管生成因子VEGF的表达;对裸小鼠黑色素瘤B16细胞的转移也有强抑制作用;下调促转移因子CD44v6和ErBb2的表达;与5-氟尿嘧啶(5-FU)联合应用时效果更显著。鳐血管生成抑制因子1的作用靶点与美国基因技术研究所开发出的抗癌新药Avastin不同。Avastin是基因工程产品,是VEGF的抗体,其作用靶点是VEGF;鳐血管生成抑制因子1是天然产物,它不仅作用于VEGF,还作用于bFGF和PDGF。
在现有技术中,为了提高蛋白的活性,针对蛋白的特异位点进行特异性的突变和取代,从而寻找活性更高的变体是常规的做法。为了进一步提高该蛋白的生物活性,申请人通过大量的实验,针对鳐血管生成抑制因子1功能区氨基酸序列中特定的位点进行了点突变,从而获得了比鳐血管生成抑制因子1功能区本身具有更高抑制活性的变体。
发明内容
本发明涉及亲本蛋白的分离的变体,其在至少一个对应于SEQIDNO:1的功能区的位置9R、17F、42H、57S、62R、71K、80N、89P、100G、101R、129A、134E、151Q、163P、189K或217R的位置包含修饰。具体而言,本发明的变体具有改善的抑制活性。
优选地,应用于本发明的方法、呈现改善的抑制活性的蛋白变体为以下任一修饰:9R/G、17F/S、42H/D、57S/L、62R/V、71K/R、80N/W、89P/V、100G/E、101R/C、129A/G、134E/S、151Q/N、163P/K、189K/R或217R/T。
本发明还涉及产生本发明的蛋白变体的方法,包括(a)培养宿主细胞;和(b)回收所述蛋白变体。
在本发明的产生方法中,使用本领域熟知的方法在适合于产生所述多肽的营养培养基中培养细胞。例如,可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养,和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养,所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如,在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中,该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌,其能够从细胞裂解物(lysate)回收。
所得多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如,多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收,所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
本发明的多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化,所述方法包括但不限于层析(例如,离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如,制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如,硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见,例如,ProteinPurification,J.-C.Janson和LarsRyden编,VCHPublishers,NewYork,1989)。
本发明的多肽用于制备相应的药物,去用于抑制癌症。
具体实施方式
实施例1
1.鳐血管生成抑制因子1功能区的获得
鳐功能区由下列氨基酸残基按下列顺序组成:
TLD1YKQLRDKETPSGFTLDDV1QTGVDNPGHPF1MTVGCVAGDEESYEVFKALFDPV1QDRHGGYKPTDKHKTDLNHENLKGGDDLDPNYVLSSRVRTGRS1KG1ALPPHCSRGERRLVEKLCLEGLATLTGEFQGKYYPLTTMSDAEQQQL1DDHFLFDKPVSPLLLASGMARDWPDARG1WHNNDKTFLVWVNEEDHLRV1SMQKGGNMKEVFRRFCVGLKK
2、鳐血管生成抑制因子1功能区变体的构建
突变点的引入
(1)、根据相应的突变位点设计相应的诱变引物,采用PCR定点突变法在鳐血管生成抑制因子1功能区所对应的基因上把野生型对应的氨基酸位点进行突变;
(2)、上述PCR产物经胶回收纯化后,用限制性内切酶进行酶切,与经过相同酶切的质粒pmD-18T载体片段连接后,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞;
(3)、鉴定重组质粒:用酶切、PCR方法对重组质粒进行鉴定,并测序检验,由此得到突变后的核苷酸序列。这些核苷酸序列说对应的氨基酸序列分别在SEQIDNO:1的基础上,在9R/G、17F/S、42H/D、57S/L、62R/V、71K/R、80N/W、89P/V、100G/E、101R/C、129A/G、134E/S、151Q/N、163P/K、189K/R或217R/T位置进行了相应的突变。
(4)、pPIC6α-鳐血管生成抑制因子1功能区变体的表达
将上述步骤构建获得的鳐血管生成抑制因子1功能区变体基因的两端引入酶切位点,在上游加入信号肽序列,构建得到pPIC6α-鳐血管生成抑制因子1功能区变体载体,鉴定后,将质粒转染毕赤酵母细胞,并进行真核表达,采用Blasticidin作为筛选标记。诱导其分泌表达目的蛋白,发现甲醇浓度为0.5%、连续诱导4天得到的蛋白表达量较高。经SDS-PAGE电泳分离得到的蛋白条带在Westernblot检测中能与兔抗hCG的抗血清发生反应。实验结果表明我们构建的重组质粒pPIC6α-鳐血管生成抑制因子1功能区变体在巴斯德毕赤酵母中平均的表达量为表达量约为140mg/L。
3、鳐血管生成抑制因子1功能区变体抑制肿瘤的生长和转移
BALB/c裸鼠随机分为对照组、阳性(环磷酰胺)对照组和实验组,每组8只,雌雄各半。每鼠背部皮下接种0.2mlLewis肺癌细胞悬液(4×106细胞)Lewis肺癌细胞。肿瘤接种后第7天,实验组腹腔注射不同剂量鳐功能区溶液,每天1次,共14次;对照组腹腔注射等量溶剂;阳性对照组腹腔注射环磷酰胺,每周1次,共2次。第21天牺牲小鼠,剥离肿瘤称重(用10%中性福尔马林固定用于免疫组化实验),解剖、观察并记录肝转移节结数。按下式计算肿瘤生长抑制率和肿瘤转移抑制率:
具体结果如下:
4、鼻咽癌细胞(CNE-2Z)诱导的鸡胚绒毛尿囊膜血管生成试验
选择清洁、蛋壳均质、气室均匀的种鸡蛋,在19200型智能孵化箱中孵化1周,无菌条件下在胚头端开一直径1cm小孔,形成假气室。接种CNE-2Z细胞(1.9×106/胚),用透明胶带封口。置培养箱中培养4天后,将中央打一小孔的滤纸置于气室内的尿囊膜上,分别加鳐功能区蛋白及其变体蛋白药液100μl于滤纸上,对照组则加等量溶剂,每天1次,共给药4次。然后去掉透明胶带,用丙酮和无水乙醇分别固定12分钟。剪下放有滤纸的尿囊膜置载玻片上,弃取滤纸,显微镜下随机选取5个视野计数可见血管的分支点数并照相。按下式计算血管生成诱导率和血管生成抑制率:
从3和4的实验结果可以看出,9R/G、17F/S、42H/D、57S/L、62R/V、71K/R、80N/W、89P/V、100G/E、101R/C、129A/G、134E/S、151Q/N、163P/K、189K/R或217R/T的变体均相对于原始的鳐功能区蛋白在癌细胞抑制率和血管抑制率上都有了明显的提高,因此取得了很好的效果。
毒理学实验
急性毒性试验
采用健康昆明种小鼠,体重19~22克,雌雄各半。给药(po)前禁食4h,采用24h内多次给药法,其间酌情供给饲料,不禁水。给药量为鳐功能区原始序列以及变体序列的有效剂量的100倍(1p,20mg/kg;po,40mg/kg),给药后观察7天。观察期间逐日记录动物的毒性反应情况和死亡动物的分布。因为未发现小鼠死亡,测不出LD50,遂改做“最大耐受量试验”,一次性用鳐功能区及其变体的有效剂量的300倍(1p,60mg/kg;po,120mg/kg)0.5ml和0.8ml分别给20只小鼠腹腔注射或灌胃,观察14天,结果仍未发现小鼠毒性反应或死亡。
稳定性
采用冷冻干燥技术制成鳐功能区及其变体样品,在-20℃冰箱中保存12个月,其生物活性(抑制血管生成、抑制体外培养瘤细胞和小鼠移植性肿瘤生长)无明显降低。
鳐功能区及其变体可与可药用的载体混合或溶解,制得治疗各种肿瘤的药物,包括各种剂型,该药物可用于白血病,亦可用于各种实体肿瘤,如食道癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、直肠癌、宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、鼻咽癌、口腔癌、唇癌、皮肤癌、膀胱癌、绒毛膜上皮癌、腮腺瘤、淋巴瘤、肌瘤、黑色素瘤和各种颅内肿瘤等的治疗,及其在需要这种治疗的人中的应用。所制成的各种口服药物组合物中,鳐功能区及其变体的含量为每日每Kg体重大约0.001-100mg,优选约0.01-50mg,更优约为0.05-30mg,最佳约0.1-10mg。每日分2-4次使用,10-30天为一疗程,一般用药3-6个疗程,每个疗程间隔10-30天。所制成的注射用药物组合物,可供肌肉注射或静脉点滴,其中鳐功能区及其变体的含量为每日每Kg体重大约0.001-50mg,优选约0.01-25mg,更优约为0.05-15mg,最佳约0.1-3mg。每日分1-3次使用,10-30天为一疗程,一般用药3-6个疗程,每个疗程间隔10-30天。然而,精确的剂量应由医生确定,主要取决于病人的年龄、体重、病情、反应等。
序列表
〈110〉张勇
〈120〉鳐血管抑制因子1功能区变体JG121及其应用
〈160〉1
〈210〉1
〈211〉225
〈212〉PRT
〈213〉鳐
〈400〉1
TLDIYKQLRDKETPSGFTLDDVIQTGVDNPGHPFIMTVGCVAGDEESYEVFKALFDPVIQ60
DRHGGYKPTDKHKTDLNHENLKGGDDLDPNYVLSSRVRTGRSIKGIALPPHCSRGERRLV120
EKLCLEGLATLTGEFQGKYYPLTTMSDAEQQQLIDDHFLFDKPVSPLLLASGMARDWPDA180
RGIWHNNDKTFLVWVNEEDHLRVISMQKGGNMKEVFRRFCVGLKK225
机译: 包含血管生成抑制因子的药物二肽及其应用方法
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机译: 链霉抗生物素突变体具有第二功能区