一种欧亚瑞香种子诱导及快速繁殖的方法

摘要

一种欧亚瑞香种子诱导及快速繁殖的方法，包括如下步骤：(1)以欧亚瑞香优质种子为外植体进行消毒；(2)将消毒后的外植体置于MS基本培养基中培养诱导出芽；(3)将无菌芽置于MS基本培养基中，经继代增殖培养后长成丛生芽；(4)将丛生芽剪切成单芽置于壮苗生根培养基中培养得到完整的带根苗。采用本发明能促进欧亚瑞香种苗的繁殖速度，种子原生苗不易发生退化，保证种苗质量。为进一步开展该物种的研究提供优质种源，具有广泛的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物种子诱导及快速繁殖的方法，特别是一种欧亚瑞香种子诱导及快速繁殖的方法。

背景技术

瑞香科植物分布于世界各地，产于欧洲、亚洲西部。有67属约1200种，其中瑞香属(Daphnegenus)有95种，我国有52种，全国均有分布。自20世纪70年代初，人们从瑞香属植物中分离出具有抗肿瘤活性的欧亚瑞香素(mezerein)和瑞香毒素(daphnotoxin)后，该属植物便成为一个研究热点。欧亚瑞香(DaphnemezereumL.)株型优美、四季常青，在冬天和早春开花且香味浓郁，深受园艺爱好者的青睐，被视为很珍贵的植物；欧洲用瑞香树皮制的膏药做辛辣剂、刺激剂、康复药；法国用果实做黑胡椒的代用品。欧亚瑞香种子繁殖或扦插繁殖存活率不高且生长缓慢，较难满足市场需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种欧亚瑞香种子诱导及快速繁殖的方法，能够促进欧亚瑞香种苗的繁殖速度，种子原生苗不易发生退化，保证种苗质量，为进一步开展该物种的研究提供优质种源。

本发明通过以下技术方案达到上述目的：一种欧亚瑞香种子诱导及快速繁殖的方法，包括以下步骤：

(1)外植体的消毒：将2～5滴洗洁精滴入装50ml自来水的烧杯中，取无病虫害欧亚瑞香种子置于烧杯中浸泡5min，用纱布擦洗种子表面污垢，线状自来水冲洗5min～10min，在超净工作台内用75v/v％的乙醇灭菌30S，无菌水冲洗1次，再用0.1v/v％HgCl₂消毒12min，无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分，获得外植体，其中无菌水为经高高温压灭菌的蒸馏水；

(2)无菌芽的诱导：将步骤(1)得到的外植体接种于MS启动培养基中，在培养温度为23±2℃，光照强度20～30μmol/m²·s，光照时间为12h/d的条件下培养20～30d开始萌发，得到无菌芽，所述启动培养基是以MS为基本培养基，还加入0.5～2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0～1.0mg/L的萘乙酸NAA，0.05～1.5mg/L的赤霉素GA3，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；

(3)无菌芽的增殖：将步骤(2)中得到的无菌芽剪切成1～2cm长接种于MS增殖培养基中，在培养温度为23±2℃，光照强度20～30μmol/m²·s，光照时间为12h/d的条件下培养15～20d便长出更多的芽丛，所述增殖培养基为MS基本培养基，添加0.1～2.5mg/L的噻重氮苯基脲TDZ、0.5～2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.05～1.0mg/L的吲哚乙酸IBA，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；

(4)无菌苗的壮苗生根：将步骤(3)中得到的芽丛剪切为单芽置于1/2MS生根培养基中，在培养温度23±2℃，光照强度20～30μmol/m²·s，光照时间为12h/d的条件下进行生根培养，培养10～25d开始生根。所述生根培养基是以1/2MS为基本培养基，还加入0～1.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.3～1.5mg/L的萘乙酸NAA、0～1.5g/L的活性炭，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。

本发明的突出优点在于：

(1)采用生物技术方法实现了欧亚瑞香种子诱导和快速繁殖。该方法能促使种子较早萌发并提高了诱导率，缩短组培苗生长周期，降低组织培养成本，提高组培苗的质量。

(2)采用本发明所述的方法培养20d能够诱导出芽，芽诱导率达最高达89.1％，培养30d，增殖系数为4.9，生根率为84.8％。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进一步说明。

实施例1

本发明所述的欧亚瑞香种子诱导及快速繁殖的方法一个实例，包括如下步骤：

(1)外植体的消毒：将2～5滴洗洁精滴入装50ml自来水的烧杯中，取无病虫害欧亚瑞香种子置于烧杯中浸泡5min，用纱布擦洗种子表面污垢，线状自来水冲洗5min～10min，在超净工作台内用75v/v％的乙醇灭菌30S，无菌水冲洗1次，再用0.1v/v％HgCl₂消毒12min，无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分，获得外植体，其中无菌水为经高高温压灭菌的蒸馏水。

(2)无菌芽的诱导：将步骤(1)得到的外植体接种于MS启动培养基中，在培养温度23±2℃，光照强度20～30μmol/m²·s，光照时间为12h/d的条件下进行培养，培养30d开始萌发，得到无菌芽。所述启动培养基是以MS为基本培养基，还加入0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、1.0mg/L的萘乙酸NAA，0.05mg/L的赤霉素GA3，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养30d，芽诱导率为69.6％。

(3)无菌芽的增殖：将步骤(2)中得到的无菌芽剪切成1～2cm长接种于MS增殖培养基中，在培养温度23±2℃，光照强度20～30μmol/m²·s，光照时间为12h/d的条件下培养，培养15～20d便长出更多的芽丛。所述增殖培养基为MS基本培养基，添加0.1mg/L的噻重氮苯基脲TDZ、1.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.05mg/L的吲哚乙酸IBA，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养30d，增殖系数为3.2。

(4)无菌苗的壮苗生根：将步骤(3)中得到的芽丛剪切为单芽置于1/2MS生根培养基中，在培养温度23±2℃，光照强度20～30μmol/m²·s，光照时间为12h/d的条件下进行生根培养，培养25d开始生根。所述生根培养基是以1/2MS为基本培养基，还加入1.0mg/L的萘乙酸NAA、0.5g/L的活性炭，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养30d，生根率为73.9％。

实施例2

本发明所述的欧亚瑞香种子诱导及快速繁殖的方法另一个实例，包括如下步骤：

(1)外植体的消毒：将2～5滴洗洁精滴入装50ml自来水的烧杯中，取无病虫害欧亚瑞香种子置于烧杯中浸泡5min，用纱布擦洗种子表面污垢，线状自来水冲洗5min～10min，在超净工作台内用75v/v％的乙醇灭菌30S，无菌水冲洗1次，再用0.1v/v％HgCl₂消毒12min，无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分，获得外植体，其中无菌水为经高高温压灭菌的蒸馏水。

(2)无菌芽的诱导：将步骤(1)得到的外植体接种于MS启动培养基中，在培养温度23±2℃，光照强度20～30μmol/m²·s，光照时间为12h/d的条件下进行培养，培养20d开始萌发，得到无菌芽。所述启动培养基是以MS为基本培养基，还加入1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.5mg/L的萘乙酸NAA，0.2mg/L的赤霉素GA3，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养30d，芽诱导率为89.1％。

(3)无菌芽的增殖：将步骤(2)中得到的无菌芽剪切成1～2cm长接种于MS增殖培养基中，在培养温度23±2℃，光照强度20～30μmol/m²·s，光照时间为12h/d的条件下培养，培养15～20d便长出更多的芽丛。所述增殖培养基为MS基本培养基，添加1.5mg/L的噻重氮苯基脲TDZ、1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.5mg/L的吲哚乙酸IBA，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养30d，增殖系数为4.8。

(4)无菌苗的壮苗生根：将步骤(3)中得到的芽丛剪切为单芽置于1/2MS生根培养基中，在培养温度23±2℃，光照强度20～30μmol/m²·s，光照时间为12h/d的条件下进行生根培养，培养16d开始生根。所述生根培养基是以1/2MS为基本培养基，还加入1.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.3mg/L的萘乙酸NAA、5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养30d，生根率为69.6％。

实施例3

本发明所述的欧亚瑞香种子诱导及快速繁殖的方法再一个实例，包括如下步骤：

(1)外植体的消毒：将2～5滴洗洁精滴入装50ml自来水的烧杯中，取无病虫害欧亚瑞香种子置于烧杯中浸泡5min，用纱布擦洗种子表面污垢，线状自来水冲洗5min～10min，在超净工作台内用75v/v％的乙醇灭菌30S，无菌水冲洗1次，再用0.1v/v％HgCl₂消毒12min，无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分，获得外植体，其中无菌水为经高高温压灭菌的蒸馏水。

(2)无菌芽的诱导：将步骤(1)得到的外植体接种于MS启动培养基中，在培养温度23±2℃，光照强度20～30μmol/m²·s，光照时间为12h/d的条件下进行培养，培养25d开始萌发，得到无菌芽。所述启动培养基是以MS为基本培养基，还加入1.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.3mg/L的萘乙酸NAA，1.0mg/L的赤霉素GA3，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养30d，芽诱导率为82.6％。

(3)无菌芽的增殖：将步骤(2)中得到的无菌芽剪切成1～2cm长接种于MS增殖培养基中，在培养温度23±2℃，光照强度20～30μmol/m²·s，光照时间为12h/d的条件下培养15～20d便长出更多的芽丛。所述增殖培养基为MS基本培养基，添加1.0mg/L的噻重氮苯基脲TDZ、2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.1mg/L的吲哚乙酸IBA，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养30d，增殖系数为4.5。

(4)无菌苗的壮苗生根：将步骤(3)中得到的芽丛剪切为单芽置于1/2MS生根培养基中，在培养温度23±2℃，光照强度20～30μmol/m²·s，光照时间为12h/d的条件下进行生根培养18d开始生根。所述生根培养基是以1/2MS为基本培养基，还加入0.8g/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、1.5mg/L的萘乙酸NAA、1.0g/L的活性炭5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养30d，生根率为80.4％。

实施例4

本发明所述的欧亚瑞香种子诱导及快速繁殖的方法又一个实例，包括如下步骤：

(1)外植体的消毒：将2～5滴洗洁精滴入装50ml自来水的烧杯中，取无病虫害欧亚瑞香种子置于烧杯中浸泡5min，用纱布擦洗种子表面污垢，线状自来水冲洗5min～10min，在超净工作台内用75v/v％的乙醇灭菌30S，无菌水冲洗1次，再用0.1v/v％HgCl₂消毒12min，无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分，获得外植体，其中无菌水为经高高温压灭菌的蒸馏水。

(2)无菌芽的诱导：将步骤(1)得到的外植体接种于MS启动培养基中，在培养温度23±2℃，光照强度20～30μmol/m²·s，光照时间为12h/d的条件下进行培养，培养23d开始萌发，得到无菌芽。所述启动培养基是以MS为基本培养基，还加入2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.1mg/L的萘乙酸NAA，1.5mg/L的赤霉素GA3，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养30d，芽诱导率为76.1％。

(3)无菌芽的增殖：将步骤(2)中得到的无菌芽剪切成1～2cm长接种于MS增殖培养基中，在培养温度23±2℃，光照强度20～30μmol/m²·s，光照时间为12h/d的条件下培养15～20d便长出更多的芽丛。所述增殖培养基为MS基本培养基，添加2.5mg/L的噻重氮苯基脲TDZ、0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、1.0mg/L的吲哚乙酸IBA，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养30d，增殖系数为4.3。

(4)无菌苗的壮苗生根：将步骤(3)中得到的芽丛剪切为单芽置于1/2MS生根培养基中，在培养温度23±2℃，光照强度20～30μmol/m²·s，光照时间为12h/d的条件下进行生根培养，培养10d开始生根。所述生根培养基是以1/2MS为基本培养基，还加入0.3mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.5mg/L的萘乙酸NAA、1.5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养30d，生根率为84.8％。