公开/公告号CN105505945A
专利类型发明专利
公开/公告日2016-04-20
原文格式PDF
申请/专利权人 中国科学院海洋研究所;
申请/专利号CN201610060233.X
申请日2016-01-27
分类号C12N15/16;C12N15/113;A01K67/033;
代理机构沈阳科苑专利商标代理有限公司;
代理人马驰
地址 266071 山东省青岛市南海路7号
入库时间 2023-12-18 15:37:44
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2019-04-02
授权
授权
2016-05-18
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N15/16 申请日:20160127
实质审查的生效
2016-04-20
公开
公开
技术领域
本发明涉及脊尾白虾蜕皮,具体地说是一种脊尾白虾蜕皮激素基因及其在蜕 皮调控中的应用。
背景技术
虾类(甲壳动物)的蜕皮与其生长发育、变态和繁殖关系密切。虾类(甲壳 动物)的蜕皮过程包括新甲壳的逐渐形成,旧甲壳的蜕去,个体吸水增大以及新 甲壳的硬化等。依据不同蜕皮阶段的特征变化把蜕皮过程分为蜕皮前期、蜕皮期、 蜕皮后期和蜕皮间期。虾类的蜕皮过程受到内分泌激素的精准调控,Y-器官分泌 的固醇类激素ecdysteroids及其衍生物20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone,20E) 诱发并调控着蜕皮过程的进行(Gilbert,L.I.,Rewitz,K.F.,2009.Thefunctionandevolutionof theHalloweengenes:thepathwaytothearthropodmoltinghormone,in:G.Smagghe(Ed.),Ecdysone: StructuresandFunction.SpringerNetherlands.)。眼柄X-器官/窦腺复合体内分泌的蛋白类激 素蜕皮抑制激素(molt-inhibitinghormone,MIH)和甲壳动物高血糖激素(crustacean hyperglycemichormone,CHH)共同调控着Y器官内固醇类激素的分泌合成能力, 进而对蜕皮过程起到调节作用(Chung,J.S.,Webster,S.G.,2003.Moultcycle-relatedchangesin biologicalactivityofmoult-inhibitinghormone(MIH)andcrustaceanhyperglycaemichormone(CHH) inthecrab,Carcinusmaenas.EurJBiochem270,3280-3288.)。
蜕皮激素(eclosionhormone,EH)是一类蛋白类激素,在昆虫中的研究发现 EH的表达受到20E的调控,并在蜕皮前期诱发其蜕皮程序,在昆虫蜕皮过程中 发挥重要作用(Clark,A.C.,delCampo,M.L.,Ewer,J.,2004.Neuroendocrinecontroloflarval ecdysisbehaviorinDrosophila:complexregulationbypartiallyredundantneuropeptides.JNeurosci24, 4283-4292.)。本发明在脊尾白虾中获得一条蜕皮激素基因EcEH,利用体外转录方 法获得了基于该基因的双链RNA(dsRNA),通过对脊尾白虾蜕皮前期的个体注 射该dsRNA,可以有效控制脊尾白虾的蜕皮进程。
发明内容
本发明描述了一种脊尾白虾蜕皮激素基因及其在蜕皮调控中的应用。
本发明的技术方案如下:
利用转录组分析方法获得了脊尾白虾蜕皮激素基因EcEH,具有SEQIDNo.1 所示的核苷酸序列,其序列特征为:
SEQIDNo.1:
CCCCTTTCAACATCGGCGCACCGCTCCTCAACTCTAAAGGTCAACATTTGCGGTCCATTTCTAT CTAAGCTCTACCCATATTGAAAACAGAATGTTTGTTTCCAGAAAGGCTGTATCTTCATCCCTGCTGG TCTTAAGCATTTTGCTCGCACTGTTTCTGGTCAGGGCGCATGCGCTTTCCATTGACGTCACGAGGA AGGTCGGAATCTGCATTGACAACTGCGGTCACTGCAAGGAAATGTACCACGATTACTTCAAAGGG GGCCTCTGCGCCGAATTCTGCCAGAAGCTCCGAGGACGCCTCATCATCGACTGCGGCGACCCCCA TACGCTTCTGCCCTTCTTCCTTGAGAGGCTCGAGTGATCGTTGAAGAATGAATCACGTTATTTTCAA AGTGGGAAAAACATATCAGAAGATGGCATAACCAAATGTTGACCAGGCCCTAAGTT
所述的脊尾白虾蜕皮激素基因EcEH的应用,利用基于该基因核苷酸序列进 行体外合成的双链RNA注射蜕皮前期的脊尾白虾,达到控制脊尾白虾蜕皮过程 的目的。
所述的脊尾白虾蜕皮激素基因EcEH双链RNA的获取,提取脊尾白虾总 RNA,反转录获得cDNA,基于EcEH基因核苷酸序列设计PCR引物EcEH-dsF (TAATACGACTCACTATAGGGCACCGCTCCTCAACTCTAAA)和EcEH-dsR (TAATACGACTCACTATAGGGGGGCCTGGTCAACATTTGGT),用脊尾白虾 cDNA做模版进行扩增获得PCR产物,利用回收的PCR产物做模版进行体外转 录获得EcEH的双链RNA(dsEcEH)。
本发明有如下优点
1、本发明确定了一种脊尾白虾蜕皮激素基因及其在蜕皮调控中的作用。
2、通过本发明可获得有效的调控脊尾白虾蜕皮过程的双链RNA。
附图说明
图1脊尾白虾蜕皮激素基因EcEH的双链RNA电泳检测;
图2注射双链RNA后对脊尾白虾蜕皮过程的影响;
图3注射双链RNA后对脊尾白虾蜕皮率的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
一种脊尾白虾蜕皮激素基因EcEH,其序列及来源序列信息如下:
SEQIDNo.1的信息
(a)序列特征
*长度:450碱基对
*类型:核苷酸
*链型:双链
*拓扑结构:线性
(b)分子类型:核酸
序列描述:SEQIDNo.1
CCCCTTTCAACATCGGCGCACCGCTCCTCAACTCTAAAGGTCAACATTTGCGGTCCATTTCTAT CTAAGCTCTACCCATATTGAAAACAGAATGTTTGTTTCCAGAAAGGCTGTATCTTCATCCCTGCTGG TCTTAAGCATTTTGCTCGCACTGTTTCTGGTCAGGGCGCATGCGCTTTCCATTGACGTCACGAGGA AGGTCGGAATCTGCATTGACAACTGCGGTCACTGCAAGGAAATGTACCACGATTACTTCAAAGGG GGCCTCTGCGCCGAATTCTGCCAGAAGCTCCGAGGACGCCTCATCATCGACTGCGGCGACCCCCA TACGCTTCTGCCCTTCTTCCTTGAGAGGCTCGAGTGATCGTTGAAGAATGAATCACGTTATTTTCAA AGTGGGAAAAACATATCAGAAGATGGCATAACCAAATGTTGACCAGGCCCTAAGTT
所述脊尾白虾总RNA提取、蜕皮激素基因EcEH的获得、cDNA反转录、双 链RNA的合成和作用分析:
1、脊尾白虾总RNA提取
利用Unizol试剂(上海博星公司)提取脊尾白虾的总RNA。步骤如下:
1)将脊尾白虾头胸部组织在液氮中研碎后加入匀浆器中,100mg组织中加 入1mLUnizol,匀浆5-10s,使组织彻底裂解;
2)把匀浆液转移到1.5mL离心管中,4℃,10000rpm离心10min,除去不 溶性细胞碎片等;
3)将上清转移到新的1.5mL离心管中,室温放置5min,充分裂解核蛋白复 合体,变性蛋白;
4)每1mLUnizol加入0.2mL氯仿,剧烈振荡15s,室温静置2-3min,4℃, 12000rpm离心15min;
5)小心转移上层水相至新的1.5mL离心管中,加入等体积的异丙醇,缓慢 颠倒混匀溶液后,室温放置15min,4℃,12000rpm离心15min;
6)弃上清,将离心管倒置,流尽液体后,加入1mL75%乙醇,将沉淀悬起 进行洗涤,之后4℃,7500rpm离心10min;
7)弃上清,将离心管倒置于吸水纸上,自然干燥RNA沉淀,加入适量的无 RNase水溶解RNA,-80℃存放。
8)总RNA的定量检测:取1μL总RNA,加入99μLDEPC水,将其稀释 100倍,利用紫外分光光度计测定RNA的OD值;
9)总RNA完整性检测:取1μL总RNA,加入4μLDEPC水及0.5μLloading buffer,1.2%琼脂糖凝胶电泳,100V,约30min,检测RNA的电泳条带。
2、EcEH基因的获得
1)提取的总RNA用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA,富集的mRNA加入 fragmentationbuffer打断成短片段;
2)以mRNA为模板,用六碱基随机引物(randomhexamers)合成一链cDNA, 然后加入缓冲液、dNTPs和DNApolymeraseI和RNaseH合成二链cDNA,再用 AMPureXPbeads纯化双链cDNA;
3)纯化的双链cDNA进行末端修复、加A尾并连接测序接头,再用AMPure XPbeads进行片段大小选择,最后进行PCR扩增,并用AMPureXPbeads纯化 PCR产物,得到最终的文库。
4)库检合格后,把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling 后进行IlluminaHiSeq/MiSeq测序;
5)测序得到的原始序列去除接头序列和低质量序列(质量值Qphred<=5的 碱基数占整个reads的50%以上的测序序列);
6)采用Trinity(GrabherrMG,HaasBJ,YassourM,etal.,2011.Full-lengthtranscriptome assemblyfromRNA-Seqdatawithoutareferencegenome.NatureBiotechnology29,644-652.)对处 理后的序列进行拼接组装,获得组装序列;
7)获得的拼接序列通过与NCBI官方的蛋白序列数据库进行比对注释,获得 基因序列的功能注释信息;
8)根据脊尾白虾转录组序列的功能注释信息,获得一条注释为蜕皮激素的核 苷酸序列EcEH。
3、cDNA反转录
应用六聚体随机引物反转录合成第一链cDNA。每50μL反应体系加入mRNA 1μg,反应体系如下:
轻轻混匀,离心,37℃孵育1.5h,95℃变性5min,冰上冷却3min,将合 成的cDNA模板-20℃保存用于双链RNA体外合成实验。
4、双链RNA的合成
1)根据脊尾白虾蜕皮激素EcEH的核苷酸序列(SEQIDNo.1)设计扩增引物 EcEH-dsF(TAATACGACTCACTATAGGGCACCGCTCCTCAACTCTAAA)和 EcEH-dsR(TAATACGACTCACTATAGGGGGGCCTGGTCAACATTTGGT);
2)以合成的cDNA为模版,用引物EcEH-dsF和EcEH-dsR按以下体系进行 PCR扩增:
PCR程序如下:
3)按照胶回收试剂盒(货号:DP209;生产厂家:天根生化科技(北京)有 限公司)的步骤回收PCR产物;
4)以回收的PCR产物为模版,按照体外转录试剂盒(货号:K0441;生产 厂家:ThermoFisherScientific)的步骤体外合成EcEH基因的双链RNA;
5)合成的双链RNA经琼脂糖检测后(图1)存于-20℃,用于后续实验。
5、注射双链RNA对脊尾白虾蜕皮的作用分析
1)对处于蜕皮前早期的5尾脊尾白虾(体长:3.9±0.5cm)按每尾1μg双链 RNA的剂量进行注射,同时用处于蜕皮前早期的5尾脊尾白虾做对照。注射两天 后用显微镜观察脊尾白虾的尾扇,发现注射双链RNA后的脊尾白虾蜕皮进程仍 处于蜕皮前早期,而未注射双链RNA的对照组脊尾白虾已发育至蜕皮前中期(图 2),结果显示EcEH的双链RNA明显抑制了脊尾白虾的蜕皮进程。
2)对处于蜕皮前早期的60尾脊尾白虾(体长:3.9±0.5cm)按每尾1μg双 链RNA的剂量进行注射,同时用处于蜕皮前早期的60尾脊尾白虾做对照。注射 后1-6天,统计每天脊尾白虾蜕皮率。结果显示,至注射后第6天,双链RNA注 射组的蜕皮率为4.9%,而未注射双链RNA的对照组脊尾白虾蜕皮率达到20.7% (图3)。
机译: 替代突变受体及其在基于蜕皮激素受体的诱导型基因表达系统中的应用
机译: 新型替代突变受体及其在基于蜕皮激素受体的诱导基因表达系统中的应用
机译: 嵌合类维生素A X受体及其在基于蜕皮激素受体的新型诱导基因表达系统中的应用