石油脱硫脱氮菌株及其脱硫脱氮的基因与应用

摘要

本发明涉及对石油具有脱硫脱氮作用的菌株及其脱硫脱氮基因与应用，名称为W-1，已保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号CGMCC？11780。该菌种是从油田地层水样中分离得到的；本发明鉴定的菌种属于土壤芽孢杆菌属，耐高温，具有很好的热稳定性能，可以在发酵等需要热稳定酶条件的工业生产中应用；其能在油藏环境中生长良好，通过对W-1进行全基因组测序发现许多和脱除石油中含硫含氮有机物中硫元素和氮元素相关基因，实验证明，该菌具有脱硫脱氮的能力，可显著提高燃油的生物脱硫（氮）效率并有效解决使用后的环境污染问题，具备工业应用菌株的优良特性，菌株具有广阔的工业应用潜力。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物菌株及环境微生物领域，具体涉及一株石油脱硫脱氮热葡糖苷 地芽孢杆菌W-1及其降解基因与应用。

背景技术

21世纪是环保世纪，作为化学工业主力军的能源工业在环保和工艺方面都面临许 多挑战和机遇，并由此诞生了生物化工和环保领域交叉的一门新兴学科。随着全球工业化 进程的迅猛发展，对能源的需求量剧增，目前，世界能源结构中石油所占比例最大，为 37.4%。石油产品中存在硫、氮化合物，应用含有硫、氮化合物本产品，会对环境造成污染，对 设备产生腐蚀。因此，脱硫、脱氮技术是石化工业及环境保护的重要研究课题。

石油及其产品深度脱硫是我国乃至全世界石油化工领域在新世纪面临的重要课 题。石油中的硫主要以硫醇、硫醚、噻吩、苯并噻吩（BT）及他们的烷基取代物和衍生物等有 机硫化物的形式存在，这些化合物在燃烧时产生大量的硫氰化物，带来多种危害。其中最为 严重的是燃烧所产生的SO₂和SO₃极易与大气中的水蒸气化合形成酸雨，造成严重的污染，破 坏生态平衡，危害人体健康（MonticelloDJ.desulfurizationoffossilfuels.Ann RevMicrobiol.1985，39:371~389）。近年来，随着生物技术脱硫越来越为人民所关注。生物 催化脱硫（BDS）是一种在常温常压下利用需氧、厌氧菌除去石油含硫杂环化合物中结合硫 的一种新技术，其利用微生物特有的酶以生化裂解的方式将化石燃料中硫除去，是在常温 常压和不需要氢气的条件下进行，能专一性切断碳硫键而使化石燃料中的硫以硫酸盐的形 式释放出来，其目的是利用自然界存在的微生物脱除硫而不破坏有机燃料价值的烃类。其 特点是工艺成本低，能耗省，流程简单，反应条件温和，环境清洁，符合生态环境友好的发展 趋势。BDS技术从出现至今已发展了几十年，目前为止仍处于开发研究阶段。生物催化 脱硫技术为石油中有机硫组分的去除，开辟了一条新的途径。

石油中氮含量一般比硫含量低，质量分数通常在0.05%~0.5%范围内，仅有少数原 油的氮含量分数超过0.6%。我国原油中氮含量偏高，且大多数原油的渣油中浓集了约90%的 氮，因此加工我国原油时，对原油中的氮含量应倍加关注。原油中有机氮化物的存在对炼油 工艺、石油产品和环境都有很大危害。虽然原油中氮化物的数量和种类没有硫化物多，但它 的影响要大于硫化物。在油品生产中，极微量的有机氮化物就可引起催化裂化、加氢精制等 工艺过程中贵重催化剂中毒，缩短催化剂的使用寿命，从而增加了生产成本，减少产量。据 统计，减少原油中氮含量的90%，能提高20%的汽油产量，还能减少设备腐蚀，降低费用。另 外，氮化物会影响油品的颜色和安定性，特别是在储存过程中，氮化物的存在会导致油色变 深及产生胶质和沉淀;氮化物的燃烧会生成腐蚀性很强的酸性气体，以氮氧化物NO_X的形式 排入大气，造成严重的空气污染，并形成酸雨。因此，脱除石油中的氮显得尤为重要，而传统 生物脱氮技术存在各种各样的不可忽视的缺点：成本高、操作难度大、脱除底物种类有限、 脱除效果不显著，并且已有的相关脱氮微生物的研究报道几乎全为常温微生物。

本发明的菌株属于嗜热菌株，具有同时对石油脱硫脱氮的作用，可以应用到石化 产业、环境保护业和其他相关工业生产中。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种热葡糖苷地芽孢杆菌W-1(Geobacillus thermoglucosidasius)及其鉴定和应用，其鉴定的菌种属于土壤芽孢杆菌属，耐高温，具有 很好的热稳定性能，可以在发酵等需要热稳定酶条件的工业生产中应用；能有效脱除石油 中含硫（氮）化合物中硫（氮），以及该菌株在含硫（氮）的原油及其馏分脱硫脱氮中的应用。

本发明的第二个目的是提供该菌株的鉴定特征和16SrRNA序列。

本发明的第三个目的是提供该菌株脱除含硫含氮化合物中硫元素、氮元素的方 法。

本发明应用于石油生物深度脱硫脱氮过程。

本发明的技术方案概述如下:

本发明所提供的热葡糖苷地芽孢杆菌，其特征在于：该菌株为Geobacillus thermoglucosidasius，2015年12月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心（ChinaGeneralMicrobiologicalCultuerCollectionCentre）进行保藏，保藏地 址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，登记入 册编号为CGMCCNO.11780。

（1）该菌株已从大港油田地层水样中分离纯化得到，经全基因测序，16SrDNA注释 属于Geobacillusthermoglucosidasius。该菌是革兰氏阳性菌，生物学特性为接触酶阳 性，体形态为有芽孢长杆菌，菌落呈圆形，乳白色，稍隆起，外形光滑，边缘整齐，湿润，不透 明；能水解明胶、淀粉和酪蛋白；能还原硝酸盐和亚硝酸盐；不能利用柠檬酸盐；高于3%的 NaCl其生长受到抑制。通过对该菌基因组的测序，发现该菌含有很多与石油脱硫脱氮相关 的基因。该菌的最适生长条件为：温度60-65℃，pH=7.0~7.5，菌落形态如图1。

（2）用ABI50CHB/E鉴定试剂条对该菌株利用不同碳源进行产酸试验，结果显示 该菌株能利用核糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、甘露醇、N-乙酰葡萄糖胺、 纤维二糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、士仑糖，不能利用甘油、D-阿拉伯糖、山梨醇、乳糖等发酵 产酸。

（3）通过对Geobacillusthermoglucosidasius进行全基因测序发现， Geobacillusthermoglucosidasius具有许多与脱除含硫含氮化合物中硫元素的相关基因 （参见表1）、氮元素的相关基因（参见表2），这些基因对于石化产业及环境保护方面的去硫 去氮有重要意义。

表1W-1基因组中与脱硫相关的基因

所述与脱除硫相关的基因参见表1

表2W-1基因组中与脱氮相关的基因

所述与脱除氮相关的基因参见表1

核苷酸序列SEQIDNo.2：

orf00188

ATGGAATTATTATGGTTTATCCCTTCCCATGGTGATGGGCGGTATCTTGGAACGACCAAAGGAGGACGCGCTC CGGAATACAGCTATTTCCGGCAAATCGCCCAAGCGGCTGACCGGCTTGGCTATAAAGGGGTATTGATTCCGACAGGA AAATCGTGCGAAGATCCGTGGCTGCTTGCGTCAGCATTAGCGGCAGAAACCGAACAATTGCGTTTTCTCGTTGCCGT GCGACCGGGGTTAATGTCTCCTACGCTAGCAGCACGCATGGCTTCCACATTGGACCGCATTTCGGAAGGCCGGTTGC TTATCAATGTCGTAGCTGGCGGCGATCCTGTTGAGCTTGCGGGCGATGGGCTATTTTTAAGCCATGACGAACGTTAT GAAGCGACGGATGAATTTTTAACCGTTTGGAAACGGCTGTTAAGCGGCGAAGAAGTCACTTTAAAAGGGAAACATAT CCATGTGAATGAGGCAAAGCTTCTGTTTCCGCCAACTCAAAAACCGTATCCGCCGATTTATTTTGGCGGGTCGTCAC CGGCAGGCCAACTTGTGGCAGCAAAACATGCGGATGTTTACTTAACATGGGGGGAACCGCCAGCGCAGGCGGAAGAA AAAATTTCCCGGGTGAGAAAATTGGCTGAACAGCAAGGACGTGCGATTGAATTCGGCATTCGACTTCATATCATTGT GCGCGAAACAGAAAAGGAAGCGTGGAATGCTGCGGAACAGCTCATTCGTTATGTCGATGAAAAAACCATTCAGGAAG CACAACGAGTTTTTGCTCGGTATGATTCTGTTGGGCAGCAGCGGATGAGGCAGTTGCATAATGGAAGCAGAGAATCT CTTGAAATTAGTCCAAATTTATGGGCGGGAGTTGGTCTTGTCAGAGGTGGTGCAGGAACCGCTTTAGTCGGAGATCC AGAAACAGTAGCTGAGCGGCTATTAGAGTATCATCAATTAGGCATCCGCTACTTTATTTTATCCGGTTACCCGCATT TAGAAGAAGCATACCGGGTAGCTGAACTGCTATTCCCGCTTTTGCCGTTAAACCATAAAAAACAAACAAAACAGTTT ATACAAGGGGAAGTTATCGGAAATGAATTTTTTCCTTCATTTATTAAAGTGTGA

orf00957SEQIDNo.3

TTGGTCATTTCGAAGATTCCGCAAAAAACCGGCTGGTCTTTTGAAGACAATGTTAGATATGCCCAAATTGCTG AAGAAGCCGGATTTGAATATGCGTTGCTGCAGACCAGGTTTGTTGCAAGCTATGGTGCGGAAAATCAACTGGAGGCT ATCACGTTGGCGGCAGCTTTAGCGGCGGTAACCAAAAAGCTAAAGCTGATTTCGGCTGTTCTTCCTGGCTTGTGGCA TCCGGGGACGGTAGCCAAAATGATCTCTACCATTGACCAAATCAGCCATGGACGTGCGGCGGTTAACATAGTGAGCG GGTGGTTTAAAGGAGAATTCCACGCGTACGGCGAGCCTTGGCTGGATCACGATGAAAGATACCGGAGATCCGAAGAG TTCATCCGTGTGCTGCGCAGCATGTGGACAGAGGAAGAGACCCATTTTCGCGGCGATTTTTACCGAATTAACGGTGC TCCTCTAAAACCGAAGCCATATAACGTTCCGGAGATTTTCCAAGGAGGCAATTCCCGTGCCGCCCGGCAGATGGCTT CCAGAGTGTCCGACTGGTATTTCATGAACGGAAATACGATCGACGGTCTCAAAGCGCAAATCGATGAAGTGTCATCG CTGGCTAAAGCAAACAACCGCAAGGTGAATTTCGGCGTCAACGCGTTTGTGATCGTACGGGACACGGAAGAGGAAGC GAAGCAGGTGCTTCGCGACATCATTGCATACGCGGATGCCGAAGCCGTGGAAGGCTTCCGCAGCCAAGTGCGCTTTG CCGGCAAAGCCTCCCCAGAAAAAGAAGGCATGTGGGCTCATTCAGATTTTAACGATTTAGTCCAATACAACGACGGT TTCAAAACCGGATTGATCGGTACGGCGGAACAGGTAGCGGACCGCATTATCGAACTCAAAAAAATCGGCGTCGATCT CATCCTGACCGGGTTCCTCCATTATGACGAAGACATCCGATTATTCGGCGAAAAAGTGATTCCGTTGGTTCGCGAAA AGGAAGCAGCGTTAAACGTGGATGCCGTATAA

orf00949SEQIDNo.4

ATGAGATATGGATTTTGGCTGCCGATTTTCGGAGGCTGGCTGCGCAACGTTGAAGATGAAAACATGCCGGCGA CGTTTGAATATGCGAAAACGGTGGCGCAAAAAGCGGAACAGTGGGGATATAGCACAACATTAGTCGCAGAGCTGTAT TTAAATGATATAAAAGGGCCGGAGAGCGATTCGTTGGAAGCATGGTCAACAGCGGCGGCATTAGCGGCGGTGACAGA AAAATTGGAAATTATGACGGCAGTCCGCCCTGGTTTCCATAATCCGGCTGTTACGGCAAAAATGGCGGCCAATATTG ACCACATTAGCAACGGCCGCTTTACGCTGAATATCGTATCAGCATGGTGGGAAGAAGAAGCGCGTCAATATGGCGGT ATTTTTACCGAGCATGATAAGCGCTATGATCGCACCGAAGAATTCGTCCAAGTGTTAAAAGGGATGTGGACAAACGA TGTGTTTCATTTCCAAGGGAAATTTTATGAAGTCAAAGGAGCCCATTTAGCGCCAAAGCCGGTGCAAAAGCCGCATC CGATTTTATACGCCGGCGGCGAGAGCGAACGAGGAAAACAAGCGATTGTCGAGCATTGCGATGCGTATGTGATGCAC GGCGGAACAGTCGAAGAAATCGCCCGCAAAGTTGCCGACATGAAACAGCGCCGCCGGCAGGCAGGAAAAGAGCCGTT TCGCTCGTTTGGCATGGCGGCGTTTGTCATTTGCCGCGACAGCGAGGAGGCAGCGCAGGCGGAACTACAGCGTATTA CCGACGTCAAATTATCAAGCGGCTATGCAGGATATCATGATTTTGTCAGCAAATCCCAGCTTGAATTGCAATTAAAA TTGCAAGACTATTCTGTATCCAACCGTGGACTGCGGCCAAACTTCGTCGGCACGCCGGAGCAAATTGCCGATCGTAT TTTGGCATATGAAAATGCAGGCGTTGATTTATTGTTATTACAATTTTCTCCGCAATTAGAGGAAATGGAGCGGTTTG CCAAACAAGTAATGCCGCTTGTCGAGGAGCGCCGGAACAAGCTCGCGGCAAAAGGGGGAAAGCAAGATGAGCAAAAT TTACATTATTCACGAAAATAG

orf01208SEQIDNo.5

ATGATTTGGCAAACAAGGGTAACGGAACTGCTCGGAATTACATATCCGATTATTCAAGGAGGGCTCGCTTACT TGGCGTACGCTGATTTAGCGGCGGCAGTTTCTAACGCCGGAGGATTGGGACAAATTACAGCCATGTCTCTAGAAACC CCCGGGCAATTGCGCGAAGAAATTCGAAAAGTAAAAGAAAAAACGGATCGTCCATTTGGAGTAAACTTTGCGATCGG GCAGCATGGCCGCTCTTTTCAGCATATGCTGGAGGCGGCATTGGAAGAAGGGGTACCGGTTGTCTCTGTCACAGGCG GAAATCCTGCTCCGTTTTTCGAACAATTAAAAGGGGTCAACGTGAAAAAACTCGTGCTTGTCGCCGCCGTTCGCCAA GCTGTAAAAGCGGAAGAACTTGGCGCGGACGCCGTCATGGTCGTCGGGCAGGAAGGGGGCGGCCATTTAGGAAAACA TGATACTGGGACGTTTGTTCTTATCCCAAAAGTAGTGGACTCCGTTTCCATTCCTGTGATTGCTTCTGGAGGAATTG GCGACGGGCGCGGGTTGATGGCGGCGTTAGCGCTGGGAGCGGAAGGAGTTGAAATGGGAACGAGATTTATTGCTACA AAAGAGTGCGTCCACGCCCATCCGATTTATAAAGAGATGCTTGTGAACGGTTCTGAACATGATACCGTCGTGATTAA ACGAAGTTTAGGAGCGCCTGGCCGCGCCATCGCCAATGAATGGACGAAAAAAATTTTAGAAATAGAAGAGCAAGGTG GAACGTATGAACAACTAAAAGAATATATCAGCGGAGAAGCGAACCGCCGCTTTATTTATGAAGGAAGAACAAATGAA GGATTTGCATGGGCGGGGCAAGTGATGGGGCTGATTAAAGACGTACCAACGGTAGCGGAATTGTTTTCGCGAATGAT TAGCGAAGCGGAACAAATTCGGGATCGATGGGCAAACTAA

orf01378SEQIDNo.6

ATGAATGATGTCTGCCGCTTGTTGCATATTCGTTATCCGATCATTCAAGGGGGAATGGGCAATATTAGTAACG CGCAGCTGGCCAGTGCCGTATCCGAAGCGGGAGGACTTGGAACAATTGGTGTTGGTACAATGCCGCCCGATGAAGTG GAGGAAATCATCATTGAAACAAAACGAAGAACAAGTCAGCCATTTGCCGTTAATATTCCTATTCAGGTAACCCCGTA TGTAGACGAAATGATATCGTTAGTCTTAAAACATCGCGTTCCTGTCGTTTCGTTATCAGCGGGGAATCCGGCACCGC TTATTCCACGTCTTGCGGAACAAGGAGTGAAAATAATTGTCGTGACCGCTTCAGTGAAACAAGCGAAAAAAGCGGAA GCAGCAGGAGCGAATATTATTGTTGCTGAAGGGTATGAAGCTGCGGGAATTAATTCGACGTTAGAGTTGACGACGAT GACGCTGATTCCGCAAATCACCAGCGCTGTCCGTGTTCCCGTCGTAGCTGCCGGCGGAATTGGAGACGGGCGGGGAT TGCTTGCCGCGTTTGCACTTGGGGCGCAAGGAGTTCAATTAGGTACGCGCCTCATTGCCACAAAAGATGCGCCGTTT CATGAGACGTACAAACAGTTAATCACCAATGCTAGTGAAAACGAAACAGTGATTGTCGGTCGATCAGTTGGAAGAGT GCGGAGAATTATGCGCACTCCGTATGCAGAGAAATTGCTGCAATATGAAAAGGAAGGAGCGCCGCTTGAAATGTTCA ATGAATATACCTCTGAAGATCGTCATCGCCGCGGAGCGCTTCAAGGGGATTTTCATGAAGGATTTGTCAATGCGGGG CAAATTGCCGGACTCATCGAAGACATGCCGACGGTAGCGGAGCTGTTTCGGCAAATGATGGAAGAAGCGAAACGGCA GCTGCATAAACTACATACACTTTTCCATTCATAA

orf02109SEQIDNo.7

ATGCATAATTCACATGGATTATGGAAACATCCTGAAAGCAAAAGACAAAGAGGATATAAAGATATTGATTATT GGATTAAGATGGCAAAACTTTTGGAACGTGGCAAGTTTGATGCCGTTTTTTTCGCGGACGTACTGGGAGTATATGAT ACATATCGCCAAAGCAAAGCTCCTTCGATACGTGATGGTCTTCAGTTCCCGGTTAATGATGCAGCATTGATTATTCC TATTATGGCGAGTGTTACGAAACATTTATCTTTTGCTTTAACAGTTAGTACTACTTATGAACATCCTTTTAGTACTG CAAGACGTTTTTCCACCCTTGACCATTTGACAAAGGGGCGAATTGCCTGGAATGTCGTCACTTCTTATTTACCAAAT GCCGCACGGAACTTCGGGCTTCAAGAAATGATCAAACATGATCAGCGTTACGATATAGCAGACGAATTTCTGGAAGT CGCATATAAACTTTGGGAAGGCAGCTGGGAAGATGATGCATTCATGGAAGATAAACAGAACGGTATATTAATTAATC CAGACAAAGTACATGAAATCAATCATGTCGGAAAATTTTTCTCCGTCGAAGGCCCGCATCTTTGCGAACCATCCCCG CAACGTACACCAGTAATCTATCAAGCAGGCACTTCAGAAAGAGGCAGGGAATTTGCAGCTAAGCATGCTGAGTGTGT TTTCGTTGGAGGGCCTACGCCAGAACGAATTAAATACTATACAAATGACATAAAAAGACGCGCTGAAAAGTATGGAC GTAATCCGGATAATATAAAAGTATTTGCTTTTTTAACGGTTATTGTTGGAAAGACAACGGAAGAAGCAGAACAAAAA TTTGCAGAATTAAATCATTTATGGAGCCCAGACGCTTCCAAAGCTCAATTTAGCGGAGCAAGCGGCTATGATCTGGC AGAATATGAAAACAAAGATTTAAATGCCCCTTTTGAATTTAAAAATACAGAGCACGGTCATTATAAAGCGGCTTCTC TTACGAAAGATGCCTCTAAAAGGCTTTCGATAGGCGAAGCGCTTAGAAAGCTTGAACAATTAGACCGAGAGTCTATC ATTGTCGGAAATCCAGAAGAAGTGGCAGATGCCATTCAATATCGATTTGAAGCGTCAGGTGTGGATGGATTTAATCT TAATCATCTGGTTACCCCTTCTAGCCTAGAGGATTTTATTGAATTGGTTATTCCGATACTCCAAAAAAGAGGTTTGT ACAAGACGGAATACAAACAAGGAACGTTACGAGAAAAGCTATTTAATCATGGCAGTAGTTTATTACCAGAAGATCAT CCGGGCAGTGCTTATCGCAGTAAATCATTTATTGTGTAA

orf02929SEQIDNo.8

GTGAGGAAAATGCTGAATACCATTTCTGTTCCAATTATTCAAGCGCCGATGGCTGGAGGTGTTTCAACTCCAG CGCTGGCTGCGGCTGTATCGAATGCAGGAGGGCTTGGTTTTTTGGCAGGTGGTTATAAAACGGCGGAAGAAATGCGC AAAGAAATTGCCGCAGTCCGGGAGATGACCGATAAGCCGTTTGGCGTTAACGTTTTTGTCCCGAGCGAAGAAGACGT GGACGAGAAAGAGCTGCTTCGTTATCGACAAGTGTTGGAGAAAGAAGCGGAACGATTCGGCGCGCAGCTTGGGGAGG CAAAATGGGATGATGATGATTGGGAAGCAAAGCTCGCTGTTTTGTATGAAGAAAAAGTTCCTGTAGTAAGTTTTACG TTTGGTTGCCCTTCACCTGATATTATCGCAAAATTGAAAGACAACGGTTCGTTTGTCATCGTGACTGTGACATCAAC GGAAGAAGCGTTGATCGCCAAACAGGCAGGGGCGAACGCATTGTGTGTGCAAGGGTCAGAGGCGGGTGGACATCGAG CGTCATTTCGCAATAACGCCGCTTCCCATGAAAATGACAGCTTGCTTGTTTTATTGCAACAAATTCGTGAAGCGGCC AATATTCCGCTGGTTGCCGCCGGAGGAATCATGAGCGGGCGCGATATCGCCGCGGTGCTTGCAGCGGGGGCGTGCGC TGCTCAATTAGGTACGGCGTTCTTGCGCTGCCCGGAAAGCGGTGCAAATCCGCTGCATAAAAACGCATTAGTCGATC CGCAATTTTCAGCCACTGCAGTTACCCGCGCCTTTACAGGGCGCCCTGCCCGCGGATTGGTGAACCGCTTCCTGATC GAATATGATAAGCTGGCCCCTGCGGCATATCCGCACATTCACCATATGACAAAGCAGCTTCGCAAAGCAGCTGCTCA AGCAAACGATCCGCAGGCGATGTCTTTATGGGCCGGGCAAGGATATCGCTTGGCGAAAGATATGCCGGCTGGAGAGA TTGTACAGTTGTTAATGAAGGAATTGAGAGAGATGGTGAATAAATAG

本发明采用活体细胞处理法处理高硫柴油、劣质油浆；采用微库伦法测定经该菌处理 前后石油中的硫和氮的含量。结果表明：

（1）W-1菌株脱除石油中硫和氮有显著效果。

（2）未经W-1菌株处理的高硫柴油中所含硫含量为2.15%，氮含量为0.57%，经W-1菌 株处理后硫、氮含量分别为0.53%、0.25%。

（3）未经W-1菌株处理的劣质油浆中所含硫含量为1.82%，氮含量为0.79%，经W-1菌 株处理后硫、氮含量分别为0.72%、0.32%。

附图说明：

图1为W-1的菌落形态图。

具体实施方式：

下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人 员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明 的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定；其中所用试剂均有市售；

本发明所用到的菌株来源：

实施例1：

（一）热葡糖苷地芽孢杆菌W-1的提取方法

现场采集大港油田水样，采用水样加入1%石油在60℃180r/min条件下进行富集培养。 一周后，在固体LB培养基（蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L、琼脂粉15g/L，NaOH调pH 至7.0，121℃、20min高压灭菌，待温度降到55℃时（手可触摸），倒入培养皿中，获得固体LB 培养基）中稀释涂布平板，待菌落长好后，选择生长良好，菌苔较大且形态特征各异的菌落， 于富集培养基固体平板上划线分离、纯化。连续多次划线纯化后，得到多株纯菌，纯菌经过 接种至液体培养基中验证其脱硫脱氮能力，得到一株对原油具有脱硫脱氮能力的菌株热葡 糖苷地芽孢杆菌W-1（Geobacillusthermoglucosidasius）。

（二）微生物名称和保藏情况

热葡糖苷地芽孢杆菌W-1（Geobacillusthermoglucosidasius），已经在中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心（ChinaGeneralMicrobiologicalCultuer CollectionCentre）进行保藏，其保藏号为CGMCC11780。

（三）菌种的特征与鉴定。

1、W-1菌株的形态和生理生化特征

在LB培养基上培养24h后的菌落直径1mm-25mm，乳白色，菌落呈圆形，稍隆起，外 形光滑，湿润，不透明；在显微镜下观察，细胞长杆状，大小为0.3μm-0.5μm×20μm-30μm。 革兰氏阳性，周生鞭毛，能运动，芽孢端生，圆形或椭圆形膨大。W-1细胞接触酶阳性，能水解 明胶、淀粉和酪蛋白；能还原硝酸盐和亚硝酸盐；不能利用柠檬酸盐；高于3%的NaCl其生长 受到抑制；最适生长温度为60-65℃，低于42℃和高于75℃。2、W-1产酸试验

在60℃条件下，用ABI50CHB/E碳水化合物鉴定试剂条及其培养基，按产品说明书对 W-1利用不同碳源进行了产酸实验。

结果显示该菌株纤维能利用核糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、甘 露醇、N-乙酰葡萄糖胺、纤维二糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、士仑糖，不能利用甘油、D-阿拉伯 糖、山梨醇、乳糖等发酵产酸。根据法国梅里埃公司配套软件鉴定此菌株为Geobacillus thermoglucosidasius（99.9%，极好的鉴定结果）。

表3W-1对ABI50CHB/E糖培养基试验结果

注：+表示阳性，—表示阴性，W表示微弱

3、抽取全基因组测序的数据，对16SrDNA及一系列持家基因的注释分析，确定细菌分 类。

16SrDNA的核苷酸序列如序列表所示SEQIDNo.1

ACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACCGGGCGGGAGCTTGCTTCCGCTTGGTTAGC GGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCGTAAGACCGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGA TAACACCGAAGACCGCATGGTCTTCGGTTGAAAGGCGGCTTCGGCTGCCACTTACGGATGGGCCCGCGGCGCATTAG CTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTG AGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCGACGCC GCGTGAGCGAAGAAGGTCTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAAGAAGTGCCGTTCGAACAGGGCGGCAC GGTGACGGTACCTAACGAGAAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGGGCGAGCGTTGT CCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTCCCTTAAGTC, TGATGTGAAAGCCCACGGCTTAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGGACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGCGGAA TTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGA CGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAG TGTTAGAGGGGTTATTCCCTTTAGTGCTGTAGCTAACGCGTTAAGCACTCCGCCTGGGGTACGGCCGCAAGGCTGAA ACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACC AGGTCTTGACATCCCCTGACAACCCTGGAGACAGGGCGTTCCTCCCTTGCGGGAGGACAGGGTGACAGGTGGTGCAT GGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCCTAGTTGCCAGCA TTCAGTTGGGCACTCTAGGGGGACTGCCGGCTAAAAGTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCT TATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGG CGGTACAAAGGGCTGCGAACCCGCGAGGGGGAGCGAATCCCAAAAAGCCGCTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAAC TCGCCTGCATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACAC ACCGCCCGTCACACCACGAGAGCTTGCAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCCGCAAGGGAGCCAGCCGCCGAAGGT GGGGCAAGTGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCTGGATCA

通过对W-1的16SrDNA在GenBank/MBL/DDBJ中进行序列比对分析，发现与 GeobacillusthermoglucosidasiusBGSCW95A1(=ATCC43742)的相似性最高，达 到99.22%。

（四）W-1菌株相关脱硫脱氮相关基因的应用

将W-1菌株进行全基因测序，从全基因组中寻找与脱硫脱氮相关的基因，发现许多与脱 硫脱氮相关基因。

表1W-1基因组中与脱硫相关的基因

表2W-1基因组中与脱氮相关的基因

（五）脱硫、脱氮效果

（1）W-1菌种的活化：将保藏在甘油保藏管中W-1菌株按1:1000（v/v）接种至经高压灭菌 的50mL培养液中，60℃、150rpm涡旋搅拌，密闭（通氧）培养18小时。其中的培养液的组成及 重量百分比为：蛋白胨1.6%；酵母膏1%；氯化钠0.5%；水余量。

（2）W-1菌种的扩大培养：将（1）所得活化的菌种按1:1000（v/v）接种至经高压灭菌 的50L培养液中，60℃、150rpm涡旋搅拌，密闭（通氧）培养18小时。其中的培养液为：无机盐 培养基+终浓度为1%蔗糖溶液。所述无机盐培养基的原料组成及重量百分比为:NH₄Cl 0.1%；Na₂HPO₄·12H₂O0.106%；NaH₂PO₄·2H₂O0.023%；KCl0.04%；MgCl·6H₂O0.0092%； FeSO₄·7H₂O0.000278%；MnCl₂·4H₂O0.000198%；CoSO₄·7H₂O0.000281%；CaCl₂·2H₂O 0.000147%；CuCl₂·2H₂O0.000017%；ZnSO₄·7H₂O0.000029%；水余量。

（3）W-1菌种处理不同种类油品：

1）处理高硫柴油：将（2）所得扩大培养后的50L菌液与20L高硫柴油混合，60℃、150rpm 涡旋搅拌，密闭反应24小时；反应完成后去除菌液，纯净水60℃、150rpm涡旋搅拌清洗至无 明显杂质，收集处理后的柴油即为低硫低氮柴油，具体见表4。

2）处理劣质油浆：将（2）所得扩大培养后的50L菌液与25L劣质油浆混合，60℃、 150rpm涡旋搅拌，密闭反应24小时；反应完成后去除菌液，纯净水60℃、150rpm涡旋搅拌清 洗至无明显杂质，收集处理后的油浆即为低硫低氮油浆。具体见表4。

（4）本发明在两种油品体系中总硫/总氮含量的测定：用WK-2D型微库伦仪分别检 测未经W-1菌种处理的两种不同油品和经W-1菌种处理过的（3）所得油层中总硫量、总氮量。 条件：裂解炉温度（稳定段700℃、燃烧段800℃、气化段600℃），偏压＞180mV，放大倍数200， 积分电阻2000Ω，转化率应在75%~115%之间。

处理结果如下表：

表4：W-1菌株对不同油品脱硫脱氮情况表

结论：

（1）W-1菌株对高硫柴油中的硫的脱除率为75.35%，对劣质油浆中的硫的脱除率为 60.34%。

（2）W-1菌株对高硫柴油中的氮的脱除率为56.14%，对劣质油浆中的氮的脱除率为 59.49%。

（3）W-1菌株对不同油品具有脱硫脱氮作用，且效果显著。

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<110>天津微锐生物科技有限公司

<120>石油脱硫脱氮菌株及其脱硫脱氮的基因与应用

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