一种肉苁蓉鳞茎提取物的制备方法及延缓皮肤衰老作用

摘要

本发明公开了一种包含寡糖混合物的肉苁蓉鳞茎提取物的制备方法，该方法包括：a)沸水提取；b)浓缩，然后脱蛋白，然后碱中和；c)透析，浓缩，离心去沉淀，上清液用有机溶剂沉淀；d)收集沉淀，干燥后得到干燥的肉苁蓉鳞茎水提多糖；e)步骤d)所得肉苁蓉鳞茎水提多糖在强酸、70-200℃温度条件下降解；f)去除酸性成分，离心后取上清液，得到包含寡糖混合物的肉苁蓉鳞茎提取物。本发明还涉及本发明方法制备得到的肉苁蓉鳞茎提取物及其纯化富集寡糖后的产物在具有延缓皮肤衰老作用的化妆品中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及天然药物化学领域和化妆品领域，更具体地说，涉及一种 从中草药肉苁蓉的鳞茎提取得到的主要成分之一多糖经降解后获得的寡糖 混合物。此外，本发明还涉及所述方法提取得到的肉苁蓉鳞茎提取物的延 缓皮肤衰老作用。具体涉及该肉苁蓉鳞茎提取物在制备具有延缓皮肤衰 老作用的化妆品中的应用。

背景技术

化妆品已成为人们日常生活中的必需品，它对美化面容和肌肤，促进 身心健康具有极大的作用。近年来随着社会经济的发展和科学技术的进步， 人们对化妆品的需求亦随之提高，对化妆品的作用从观念上发生了很大的 变化，更加注重化妆品的功效性。而在众多的功效中，延缓衰老成为亘古 不变的主题。

衰老是指随着时间的推移所有个体都将发生的功能性和器质性衰退的 渐进过程。影响衰老的因素有很多，各种社会因素、经济、疾病、营养、 遗传、环境及精神状态等都起着一定的作用。归纳起来不外乎两类，一种 是内因所致，先天所决定的，即人丛胚胎到死亡是由体内基因或生物钟决 定的(生理性衰退)；另一种是外因所致，即由上述提到的外在环境有害 因素所致，引起细胞壁和细胞脱氧核糖核酸的损伤、人体蛋白质大分子等 遭到破坏等(病理性衰退)。

衰老的机制非常复杂，比较有代表性的衰老学说主要包括：细胞突变 学说，DNA损伤学说，线粒体损伤学说，端粒学说，自由基学说，非酶糖 基化学说，免疫功能改变学说，神经内分泌衰老学说。

细胞突变学说认为细胞分裂次数与寿命成正比，衰老是由于细胞受损 而产生突变，从而使细胞本身及其分裂之后的细胞异常，生理功能下降， 分裂次数降低。年老肌肤的表皮层厚度明显变薄，其中的主要组成细胞角 质细胞的分裂速度减慢、新陈代谢水平也明显降低，肌肤失去活力，也因 此变得暗沉、细纹曾多、水分流失快。故而，增加表皮细胞的新陈代谢和 增殖能力，成为延缓衰老的重要手段之一。

线粒体是细胞氧化代谢的部位，其活性可以直接反映细胞新陈代谢的 能力。我们通过XTT法来检测角质细胞的线粒体活性，从而反映细胞的新 陈代谢水平。XTT是一种四唑氮衍生物，能被活细胞中线粒体脱氢酶降解 而产生棕黄色水溶性的甲臜，在450nm处有吸光度，其读数对应的甲臜生 成量与细胞的线粒体活性呈正相关。在实验室的体外细胞平台中，细胞增 殖带来的线粒体数量增多，也能引起XTT结果升高。即，本发明涉及的 XTT实验结果，反映的是细胞新陈代谢水平和增殖能力的综合结果。

就组成真皮层的主要细胞成纤维细胞而言，随着衰老的发生，成纤维 细胞分裂次数减少，合成胶原蛋白及弹性蛋白的能力下降。最终导致皮肤 逐渐变薄，皱纹增多，弹性下降。因此促进细胞增殖以及增强成纤维细胞 合成胶原蛋白的能力也是延缓衰老的重要手段之一。

羟脯氨酸是胶原蛋白中的一种主要成分，它与胶原蛋白的稳定性密切 相关。与此同时，我们很少在其他蛋白质中发现羟脯氨酸，因此，很多研 究常用羟脯氨酸的含量来反映胶原蛋白的量。本发明涉及的测量羟脯氨酸 表达量的方法，原理是基于胶原在碱性条件下被切割降解，由此得来的游 离的羟脯氨酸被氧化，在反应液中能产生在550nm处有吸光度的发色基团， 从而由吸光度的读数来反映胶原含量。

I型胶原占到皮肤中所有胶原的80％，是与肌肤衰老密切相关的蛋白， 而I型前胶原作为胶原I的合成前体，其含量多少也能反映出皮肤合成胶原 蛋白的能力。通过抗原抗体的特异性结合，可以用荧光基团标记出表皮细 胞表达的I型前胶原，荧光强度即对应了该蛋白的表达量，从而可以一定 程度上反映出胶原I的表达量。

我国中医药资源丰富，为我们寻找优越的延缓皮肤衰老的添加剂提供 了基础。肉苁蓉(HerbaCistanche)CistanchedeserticolaY.C.Ma(c.dor)为 列当科(Orobanchaeceae)肉苁蓉属(Cistanche)多年生高等寄生植物，其味甘 咸微辛酸、微温，在《神农百草经》中列为上品，具有补肾益精、润肠通 便和延缓衰老等功效，被誉为“沙漠人参”。别名大芸、寸芸、苁蓉、纵 蓉、肉松蓉、精笋、地精、查干告亚(蒙语)。长期的药学实践和大量近 代药理学研究表明，它具有提高机体的免疫功能，促进DNA合成，增强体 力，提高智能，还有抗衰老等方面的作用。肉苁蓉多糖作为肉苁蓉药材的 主要功效成分之一，也有许多报道称其有抗衰老、抗氧化等方面的作用。

例如，中国专利申请CN201110039116.2公开了一种肉苁蓉提取物提取 方法及其应用。具体说，该申请公开了属于药用植物应用研究技术领域的 一种肉苁蓉提取物提取方法及其应用。该提取物来源于列当科肉苁蓉属的 荒漠肉苁蓉或管花肉苁蓉。将肉苁蓉的干燥肉质茎磨成粉末，通过回流提 取、过滤、药渣再回流提取、冰冻干燥仪干燥得到棕色粉末，即为肉苁蓉 提取物。本发明的肉苁蓉提取物可激活免疫系统，增加免疫器官脾脏的重 量，治疗肠癌，减少肠道增生的发生，保护正常的肠道表皮细胞，减少肠 道幽门杆菌感染。

例如，中国专利申请CN201210064589.2公开了一种含管花肉苁蓉提取 物的美白抗衰老化妆品及其制备方法。具体说，该申请提供了一种管花肉 苁蓉提取物的制备方法及美白抗衰老化妆品，所述管花肉苁蓉提取物的制 备方法包括粉碎、粗提取、将粗提取物进行离心收集、并经过静置后洗脱、 烘干，得管花肉苁蓉提取物。该制备方法简单并无污染，所述提取物的松 果菊苷的含量≥25％，毛蕊花糖苷的含量≥55％，总苷含量≥80％；将此方 法制得的管花肉苁蓉提取物经过抗氧化性活性等的测试后，证明管花肉苁 蓉提取物具有抗氧化，美白、抗衰老的作用。将其添加到化妆品制得美白 抗衰老化妆品，并对化妆品进行细胞毒性及安全性等测试，验证了化妆品 的安全无刺激、且具有很好的美白效果。

但是，现有技术均未公开由肉苁蓉提取得到的多糖降解形成寡糖混合 物的方法。也就是说，迄今为止还没有对肉苁蓉鳞茎提取得到的多糖进行 降解，形成寡糖混合物的研究报道，更没有关于这种寡糖混合物具有延缓 衰老功效的报道。本发明首次研究得出此寡糖混合物能通过提高角质细胞 活力(增值能力与新陈代谢能力的综合，通过XTT反映)，以及增加成纤 维细胞表达胶原蛋白(通过羟脯氨酸与I型前胶原含量反映)来达成延缓 皮肤衰老的功效，其延缓皮肤衰老能力强于原多糖。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有延缓皮肤衰老作用的肉苁蓉鳞茎提取物。 本发明的肉苁蓉鳞茎提取物按提供的方法制成，其成分主要为寡糖混合物，包 含寡糖混合物的肉苁蓉鳞茎提取物可直接用于延缓皮肤衰老。

因此，本发明的一个目的是提供一种包含寡糖混合物的肉苁蓉鳞茎提取 物的制备方法及其可能的分纯方法，它能通过以下方法制备得到：

a)沸水提取；

b)浓缩，然后脱蛋白，然后碱中和；

c)透析，浓缩，离心去沉淀，上清液用有机溶剂沉淀；

d)收集沉淀，干燥后得到干燥的肉苁蓉鳞茎水提多糖；

e)步骤d)所得肉苁蓉鳞茎水提多糖在强酸、70-200℃温度条件下降解， 得到包含寡糖混合物的肉苁蓉鳞茎提取物；

f)去除酸性成分，离心后取上清液，得到包含寡糖混合物的肉苁蓉鳞 茎提取物。

在本发明的一个实施方式中，所述方法还包括在步骤a)之前进行脱脂 的步骤。

在本发明的一个实施方式中，所述方法还包括在步骤f)之后采用活性 炭硅藻土层析柱进行分离纯化的步骤。

在本发明的一个实施方式中，所述步骤e)中使用的强酸选自：三氟乙 酸、盐酸、高锰酸、硫酸、硝酸、高氯酸、硒酸、氢溴酸、氢碘酸、氯酸。

在本发明的一个实施方式中，所述步骤a)包括取肉苁蓉鳞茎中草药，原药 材用沸水提取，硫酸-苯酚法检测提取液的糖含量，直至糖反应不明显。在本 发明的一个实施方式中，所述步骤b)包括合并提取液，浓缩，用流动水透析， 透析内液浓缩后加入30％(w/v)的三氟乙酸水溶液脱蛋白，然后碱中和至pH 值7.0-8.0。在本发明的一个实施方式中，所述步骤c)包括用流动水透析，透析 内液浓缩后，加入2-5倍体积的95％有机溶剂进行沉淀。在一个优选的实施方 式中，所述步骤c)中使用的有机溶剂是乙醇。在本发明的一个实施方式中，所 述步骤d)包括收集沉淀，用无水乙醇和丙酮洗涤，干燥后得到干燥的肉苁蓉鳞 茎水提多糖。在本发明的一个实施方式中，所述步骤e)包括在0.1～4M的强酸 溶液中，70～200℃的温度下加热降解反应1～4小时，获得包含寡糖混合物的肉 苁蓉鳞茎提取物。在一个优选的实施方式中，所述步骤e)中的强酸为三氟乙酸 或盐酸。在本发明的一个实施方式中，所述步骤f)包括用透析或蒸馏手段去除 酸性成分，离心后取上清液，通过活性炭硅藻土混合柱(w/w＝1:1)进行分离， 用0-100％乙醇洗脱。装柱方法：以适量水混合椰壳活性炭(承德兴华活性炭 有限责任公司)和硅藻土(国药)，成泥浆状后均匀轻缓地倒入玻璃柱中，静 置沉降后用去离子水平衡至柱体积不变，便可用于样品分离。在本发明的一个 实施方式中，采用苯酚-硫酸法绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集合并洗脱液， 蒸馏去乙醇后用蒸馏水溶解获得浅黄色澄清溶液。

在本发明一个优选的实施方式中，所述步骤b)中的脱蛋白的操作采用 30％(w/v)的三氟乙酸水溶液。

在本发明一个优选的实施方式中，所述步骤c)中使用的有机溶剂选自： 乙醇，丙酮，氯仿。

在本发明一个优选的实施方式中，所述步骤e)中使用的强酸选自：三 氟乙酸、盐酸。

在本发明一个优选的实施方式中，所述步骤f)中使用的活性炭硅藻土 层析柱是通过将活性炭与硅藻土按照1：1的重量比在水中混合形成泥浆状， 然后将所得泥浆状混合物均匀倒入层析柱制备得到。

在本发明一个优选的实施方式中，所述步骤f)中采用0-100％的乙醇洗 脱。

在本发明的另一方面，提供了通过本发明方法制备得到的包含寡糖混 合物的肉苁蓉鳞茎提取物。

在本发明的另一方面，提供了通过本发明方法制备得到的包含寡糖混 合物的肉苁蓉鳞茎提取物可以使用的除去多糖的提纯方法。

在本发明的另一方面，提供了按照本发明方法制备得到的肉苁蓉鳞茎 提取物在具有延缓皮肤衰老作用的化妆品中的应用。

在本发明的另一方面，提供了一种具有延缓皮肤衰老作用的化妆品， 所述化妆品包含按照本发明方法制备得到的肉苁蓉鳞茎提取物以及化妆品 领域可接受的赋形剂。在本发明一个优选的实施方式中，所述化妆品还包 含另一种具有延缓皮肤衰老作用的添加剂。在一个实施方式中，所述化妆 品选自：洁面乳、化妆水、乳液、膏霜、啫喱、面膜。在一个优选的实施 方式中，所述肉苁蓉鳞茎提取物的使用量为0.0001％-80％(w/w)。优选的浓 度范围为0.001％-10％(w/w)。更优选的浓度范围为0.005％-5％(w/w)。最 优选的是肉苁蓉鳞茎提取物在0.1％-1％(w/w)的浓度范围。

附图说明

图1是本发明肉苁蓉鳞茎提取物的提取工艺流程图。

图2为角质细胞处理后细胞活性(综合细胞新陈代谢能力与增殖能力 之和)的结果。图中纵坐标为450nm处样品的吸光度(OD值)平均值除 以对照组OD平均值所得的百分比，此数值体现的是以对照组为基准，各 种处理条件下96孔板内所有角质细胞线粒体活性的总和，由XTT法测得。 横坐标显示的是不同的实验条件，从左到右使用的依次是，普通培养基， 含0.1mg/ml、1mg/ml肉苁蓉鳞茎提取多糖的培养基，以及含0.1mg/ml、 1mg/ml肉苁蓉鳞茎制备混合寡糖的培养基。星号代表的是该条件下的实验 值与对照组有显著性差异。

图3为细胞培养基中羟脯氨酸含量检测结果。图中纵坐标为550nm处 样品的吸光度(OD值)平均值除以对照组OD平均值所得的百分比，此数 值体现的是以对照组为基准，各种处理条件下成纤维细胞培养基中羟脯氨 酸的含量。横坐标显示的是不同的实验条件，从左到右使用的依次是，普 通培养基，含0.3mg/ml肉苁蓉鳞茎提取多糖的培养基，含0.05mg/ml肉苁 蓉鳞茎制备寡糖的培养基以及含0.01mg/ml肉苁蓉鳞茎制备寡糖的培养基。 星号代表的是该条件下的实验值与对照组有显著性差异。

图4为细胞分泌I型前胶原免疫荧光图片。图为共聚焦显微镜拍摄的I 型前胶原荧光照片。蓝色荧光代表的是成纤维细胞核，绿色荧光则是I型 前胶原。绿色荧光的强弱即对应细胞分泌I型前胶原数量的多少。培养条 件从左到右使用的依次是，普通培养基，含0.3mg/ml肉苁蓉鳞茎提取多糖 的培养基，以及含0.05mg/ml肉苁蓉鳞茎制备寡糖的培养基。

具体实施方式

下面结合具体的实施例进一步阐述本发明。但是，应该明白，这些实 施例仅用于说明本发明而不构成对本发明范围的限制。下列实施例中未注 明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条 件。除非另有说明，所有的百分比和份数按重量计。

本发明实施例中使用的仪器设备如下：

SHB-III循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸易有限公司。

85-2型恒温磁力搅拌器：上海思乐仪器有限公司。

DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司。

N-1100D-WD真空旋转蒸发仪：日本EYELA公司。

UV260可见分光光度计：日本Shimadzu。

GL-21M低温高速离心机：上海离心机研究所有限公司。

Labconco大型冷冻干燥机：美国Labconco公司。

Edwards小型冷冻干燥机：英国Edwards公司。

全波长双板多功能仪(酶标仪)：美国BMGLabtech公司Novostar

细胞培养箱：美国ThermoserialII

以下实施例1-5例举本发明涉及的肉苁蓉鳞茎提取物制备方法及可能 的纯化方法，所述肉苁蓉产自甘肃或新疆。

实施例1

取肉苁蓉鳞茎2kg，乙醇浸泡脱脂，室温自然干燥，干燥后的肉苁蓉 鳞茎原药材用30L沸水提取，直至水提液中糖含量值较低，低温浓缩至5L， 加入6L30％(w/v)三氯乙酸溶液，脱蛋白之后用碱中和至pH为7.0，对 流动水透析三天，内液浓缩，离心去沉淀，上清液加入3倍乙醇沉淀，静 置，离心保留沉淀，分别用无水乙醇，丙酮洗涤，真空干燥后得到干燥肉 苁蓉鳞茎水提多糖200g，为棕褐色粉末。

水提粗多糖10g以适量水溶解，离心除去不溶物。在终浓度为0.2M三 氟乙酸溶液中，以及70℃加热4小时获得混合寡糖。蒸馏除去三氟乙酸， 离心后取上清液。获得深棕色水溶液，包含寡糖的肉苁蓉鳞茎提取物，固 含量77mg/ml。

50g椰壳活性炭混合50g硅藻土于500ml去离子水中，搅拌均匀后缓 慢倒入直径6cm高80cm的玻璃柱中，装柱后用蠕动泵压纯水平衡2天至 柱体积不变，吸出上层清水，加入降解除酸后的混合寡糖溶液。以纯水洗 脱，苯酚-硫酸法绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集合并洗脱液，蒸馏去乙 醇后用蒸馏水溶解获得浅黄色澄清溶液，固体含量15mg/ml。

实施例2

取肉苁蓉鳞茎2kg，丙酮浸泡脱脂，通风橱内室温自然干燥，干燥后 的肉苁蓉鳞茎原药材用40L沸水提取，直至水提液中糖含量值较低，低温 浓缩至6L，加入7L30％(w/v)三氯乙酸溶液，脱蛋白之后用碱中和至pH 为7.3，对流动水透析三天，内液浓缩，离心去沉淀，上清液加入2倍丙酮 沉淀，静置，离心保留沉淀，分别用无水乙醇，丙酮洗涤，烘箱干燥后得 到干燥肉苁蓉鳞茎水提多糖275g，为棕褐色粉末。

水提粗多糖10g以适量水溶解，离心除去不溶物。在终浓度为0.4M盐 酸溶液中，以及160℃加热1小时获得混合寡糖。用孔径为100Da的透析 袋透析除去盐酸，离心后取上清液。获得深棕色水溶液，包含寡糖的肉苁 蓉鳞茎提取物，固含量84mg/ml。

50g椰壳活性炭混合50g硅藻土于600ml去离子水中，搅拌均匀后缓 慢倒入直径6cm高80cm的玻璃柱中，装柱后用蠕动泵压纯水平衡3天至 柱体积不变，吸出上层清水，加入降解除酸后的混合寡糖溶液。以5％乙醇 洗脱，苯酚-硫酸法绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集合并洗脱液，蒸馏去 乙醇后用蒸馏水溶解获得浅黄色澄清溶液，固体含量11.3mg/ml。

实施例3

取肉苁蓉鳞茎2kg，氯仿浸泡脱脂，通风橱内室温自然干燥，干燥后 的肉苁蓉鳞茎原药材用60L沸水提取，直至水提液中糖含量值较低，低温 浓缩至8L，加入8L30％(w/v)三氯乙酸溶液，脱蛋白之后用碱中和至pH 为7.1，对流动水透析三天，内液浓缩，离心去沉淀，上清液加入3倍乙醇 沉淀，静置，离心保留沉淀，分别用无水乙醇，丙酮洗涤，真空干燥后得 到干燥肉苁蓉鳞茎水提多糖310g，为棕褐色粉末。

水提粗多糖10g以适量水溶解，离心除去不溶物。在终浓度为0.4M三 氟乙酸溶液中，以及100℃加热4小时获得混合寡糖。蒸馏除去三氟乙酸， 离心后取上清液。获得深棕色水溶液，包含寡糖的肉苁蓉鳞茎提取物，固 含量50mg/ml。

60g椰壳活性炭混合60g硅藻土于450ml去离子水中，搅拌均匀后缓 慢倒入直径6cm高80cm的玻璃柱中，装柱后用蠕动泵压纯水平衡2天至 柱体积不变，吸出上层清水，加入降解除酸后的混合寡糖溶液。以50％乙 醇洗脱，苯酚-硫酸法绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集合并洗脱液，蒸馏 去乙醇后用蒸馏水溶解获得浅黄色澄清溶液，固体含量5mg/ml。

实施例4

取肉苁蓉鳞茎2kg，乙醇浸泡脱脂，室温自然干燥，干燥后的肉苁蓉 鳞茎原药材用50L沸水提取，直至水提液中糖含量值较低，低温浓缩至8L， 加入8L30％(w/v)三氯乙酸溶液，脱蛋白之后用碱中和至pH为7.6，对 流动水透析三天，内液浓缩，离心去沉淀，上清液加入2倍丙酮沉淀，静 置，离心保留沉淀，分别用无水乙醇，丙酮洗涤，烘箱干燥后得到干燥肉 苁蓉鳞茎水提多糖298g，为棕褐色粉末。

水提粗多糖10g以适量水溶解，离心。在终浓度为3M三氟乙酸溶液 中，以及120℃加热1小时获得混合寡糖。蒸馏除去三氟乙酸，离心后取上 清液。获得深棕色水溶液，包含寡糖的肉苁蓉鳞茎提取物，固含量32mg/ml。

40g椰壳活性炭混合40g硅藻土于700ml去离子水中，搅拌均匀后缓 慢倒入直径6cm高80cm的玻璃柱中，装柱后用蠕动泵压纯水平衡3天至 柱体积不变，吸出上层清水，加入降解除酸后的混合寡糖溶液。以65％乙 醇洗脱，苯酚-硫酸法绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集合并洗脱液，蒸馏 去乙醇后用蒸馏水溶解获得浅黄色澄清溶液，固体含量5.6mg/ml。

实施例5

取肉苁蓉鳞茎2kg，丙酮浸泡脱脂，通风橱内室温自然干燥，干燥后 的肉苁蓉鳞茎原药材用70L沸水提取，直至水提液中糖含量值较低，低温 浓缩至5L，加入9L30％(w/v)三氯乙酸溶液，脱蛋白之后用碱中和至pH 为7.8，对流动水透析三天，内液浓缩，离心去沉淀，上清液加入5倍氯仿 沉淀，静置，离心保留沉淀，分别用无水乙醇，丙酮洗涤，真空干燥后得 到干燥肉苁蓉鳞茎水提多糖322g，为棕褐色粉末。

水提粗多糖10g以适量水溶解，离心。在终浓度为2M盐酸溶液中， 以及90℃加热2小时获得混合寡糖。用孔径为100Da的透析袋透析除去盐 酸，离心后取上清液。获得深棕色水溶液，包含寡糖的肉苁蓉鳞茎提取物， 固含量128mg/ml。

60g椰壳活性炭混合60g硅藻土于800ml去离子水中，搅拌均匀后缓 慢倒入直径6cm高80cm的玻璃柱中，装柱后用蠕动泵压纯水平衡2天至 柱体积不变，吸出上层清水，加入降解除酸后的混合寡糖溶液。以95％乙 醇洗脱，苯酚-硫酸法绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集合并洗脱液，蒸馏 去乙醇后用蒸馏水溶解获得浅黄色澄清溶液，固体含量3.5mg/ml。

以下实施例6-16中所使用的肉苁蓉鳞茎提取物均为实施例3得到的肉 苁蓉鳞茎提取物(未经分纯)，其生药浓度为50mg/ml(即5％w/w)；实 施例中各组分的单位均为重量百分比。

实施例6：面霜的制备

实施例7：乳液的制备

实施例8：啫喱的制备

实施例9：化妆水的制备

实施例10：精华液的制备

实施例11：面膜的制备

实施例12：眼霜的制备

实施例13：气雾(清洁泡)的制备

实施例14：喷雾的制备

实施例15：沐浴露的制备

实施例16：洗面奶的制备

以上6-16实施例中所述的牛肝菌组合物均经过①稳定性测试，将料体 分别在-20℃、4℃、室温、48℃、循环(连续变换四个温度条件)放置12 周，各料体的颜色和形态都保持稳定；②皮肤安全性测试，证实对皮肤无 刺激，不会引发红斑、脱屑、刺痛及灼热等不良反应，可安心使用；③使 用感觉测试，请20位中国女性志愿者在面部连续使用实施例5所述的面霜 8周，评估结果表明，肉苁蓉鳞茎提取物能够显著增强皮肤弹性、改善纹理。

实施例17：肉苁蓉鳞茎提取物的延缓皮肤衰老作用

(一)XTT法检测角质细胞活性

1)实验原理

年老肌肤的表皮层厚度明显变薄，其中的主要组成细胞角质细胞的分裂速 度减慢、新陈代谢水平也明显降低，肌肤失去活力，也因此变得暗沉、细纹曾 多、水分流失快。故而，增加表皮细胞的新陈代谢和增殖能力，成为延缓衰老 的重要手段之一。

线粒体是细胞氧化代谢的部位，其活性可以直接反映细胞新陈代谢的能 力。我们通过XTT法来检测角质细胞的线粒体活性，从而反映细胞的新陈代 谢水平。XTT是一种四唑氮衍生物，能被活细胞中线粒体脱氢酶降解而产生棕 黄色水溶性的甲臜，在450nm处有吸光度，其读数对应的甲臜生成量与细胞的 线粒体活性呈正相关。在实验室的体外细胞平台中，细胞增殖带来的线粒体数 量增多，也能引起XTT结果升高。即，本发明涉及的XTT实验结果，反映的 是细胞新陈代谢水平和增殖能力的综合结果。

2)实验方法

在96孔板每孔加入50μL含0.2％生长因子的细胞培养液，再用排枪加入 150μL成纤维细胞悬液。细胞接种量为8500个/孔，置于37℃，5％CO2培养 箱中培养24h。吸出150μL培养基，再加入含有肉苁蓉鳞茎提取多糖(对应 图中多糖)、肉苁蓉鳞茎制备寡糖(对应图中混合寡糖)的培养基各150μl/孔， 使其终浓度分别为0.1mg/ml、1mg/ml。所有药物浓度均已做过细胞毒性检测， 对该细胞密度下的成纤维细胞无毒害作用。继续培养48h后重新按之前所述方 法更换一次培养基，24h后吸出培养基，用PBS清洗后，加入125μL0.2mg/ml 的XTT反应液(含0.1％PMS，Sigma)，再培养2h后在酶标仪上450nm处测 定吸光度。

3)实验结果

角质细胞活性结果如图2所示。实验表明，使用1mg/ml肉苁蓉鳞茎制备 的寡糖混合物培养的实验组对应的读值明显高于对照组，超过20％。也即是说， 混合寡糖处理的细胞，其线粒体降解的XTT量明显更大，从而证明其细胞活 性(新陈代谢水平和增殖能力的综合结果)比照组强，并且结果显示它的效果 优于未经降解的多糖。

(二)细胞培养基中羟脯氨酸含量测定

1)实验原理

就如背景中所说，随着年龄的增长，成纤维细胞的合成能力下降，导致皮 肤中缺乏胶原蛋白，皮肤便会因此失去柔软、弹性和光泽，发生老化。因此， 提高成纤维细胞合成胶原蛋白的能力可以有效延缓皮肤衰老。

胶原蛋白是由18种氨基酸组成的，羟脯氨酸是其中的一种主要成分，它 与胶原蛋白的稳定性密切相关。同时，因为它在其他一些普通的蛋白(如大豆 蛋白)中比较少见，所以可作为胶原蛋白的特征性氨基酸。很多研究常用细胞 培养基中羟脯氨酸的含量来反映细胞分泌合成的胶原蛋白的量。

本实验测量的就是培养基中的羟脯氨酸含量。其原理是，胶原在碱性条件 下被切割降解，由此得来的游离的羟脯氨酸被氧化，在反应液中能产生在 550nm处有吸光度的发色基团，从而由吸光度OD值的强弱来判断羟脯氨酸含 量的高低。

2)实验方法

在12孔板每孔加入500μL含2％血清的细胞培养液，再分别加入500 μL成纤维细胞悬液。细胞接种量为1.5×10⁵个/孔，置于37℃，5％CO₂培 养箱中培养24h。吸出培养基，分别加入含有肉苁蓉鳞茎提取多糖(对应 图中多糖)、肉苁蓉鳞茎制备寡糖(对应图中混合寡糖)、纯化的肉苁蓉 鳞茎制备寡糖(对应图中寡糖)的培养基各1ml/孔，使其终浓度分别为 0.3mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml。所有药物浓度均已做过细胞毒性检测， 对该细胞密度下的成纤维细胞无毒害作用。37℃5％CO₂培养箱培养96 小时。每孔各取出500μL培养基，使用羟脯氨酸试剂盒(南京建成)测量 其中的羟脯氨酸含量。培养基以及药物本身对OD值的影响已经通过空白 样品(未培养过细胞)除去。

3)实施结果

细胞培养基中羟脯氨酸含量检测结果如图3所示。

可以看出，使用肉苁蓉鳞茎制备的混合寡糖培养的细胞，其培养基中 羟脯氨酸的含量高出基础值(对照)9％，差异非常显著，并且此效果优于 未经降解的多糖，而分纯后的寡糖效果更佳。

(三)免疫荧光检测细胞分泌I型前胶原

1)实验原理

与皮肤衰老密切相关的胶原蛋白有很多种类型，其中，I型胶原(即胶 原I)占到皮肤中所有胶原的80％。胶原I的合成可以分为两个阶段：在细 胞内合成I型前胶原，而后该分子被分泌到细胞外继续聚合，最终形成胶 原I。因此，I型前胶原作为胶原I的合成前体，其含量多少也能反映出皮 肤合成胶原蛋白的能力。通过抗原抗体的特异性结合，可以用荧光基团标 记出成纤维细胞表达的I型前胶原，用荧光显微镜可以观察并拍摄到荧光 基团标记的I型前胶原。荧光强度即对应了该蛋白的表达量，从而可以一 定程度上反映出胶原I的表达量。

2)实验方法

在8孔板每孔加入500μL细胞培养液，再分别加入500μL角质细胞悬液。 细胞接种量为7.32×10³个/孔，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养24h。吸出培 养基，再加入含有肉苁蓉鳞茎提取多糖(对应图中多糖)、纯化后的肉苁蓉鳞 茎制备寡糖(对应图中寡糖)的培养基各1ml/孔，使其终浓度分别为0.3mg/ml、 0.05mg/ml。所有药物浓度均已做过细胞毒性检测，对该细胞密度下的成纤维 细胞无毒害作用。37℃5％CO₂培养箱培养72小时。用丙酮固定细胞后，用 单克隆抗体(一抗)分别处理每孔细胞12h后洗去，再用含有荧光基团的二抗 (sigma)染色2h。洗去后，最终用DAPI溶液衬染细胞核，洗去，并封片。

3)实验结果

细胞分泌I型前胶原免疫荧光图片如图4所示。

由图4可以看出，使用纯化后肉苁蓉鳞茎制备的混合寡糖(不含单糖、 多糖)培养的成纤维细胞，分泌的I型前胶原量明显高于普通培养基，并 且此效果优于未经降解的多糖。

综合以上三个不同实验的结果，可以看出通过本发明使用的方法制备 的肉苁蓉鳞茎提取物(主要成分为寡糖)能够明显提高角质细胞活性、增 加成纤维细胞中胶原蛋白的表达，从而能够从肌肤内部着手，改善肌肤结 构、增加弹性，延缓肌肤衰老。