龙眼胚胎发育相关基因DlIKU1及其应用

摘要

龙眼胚胎发育相关基因DlIKU1及其应用，属于植物基因工程领域。龙眼胚胎发育相关基因DlIKU1的龙眼DlIKU1开放阅读框共有990个碱基组成；编码329个氨基酸，等电点为11.45的蛋白质。克隆方法：根据拟南芥IKU1保守区序列设计引物，扩增正常发育龙眼的cDNA，通过三轮的PCR扩增，获得1100bp的扩增片段，通过ORF？Finder软件预测龙眼DlIKU1开放阅读框共有990个碱基组成；编码329个氨基酸，等电点为11.45的蛋白质。龙眼DlIKU1基因可以通过抑制其表达用于控制龙眼的胚胎发育，获得稳定的焦核龙眼。对生产上培育具有优良小核的高质龙眼品种具有很高的应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，尤其是涉及一个龙眼胚胎发育相关基因DlIKU1及其应 用。

背景技术

龙眼(DimocarpusLonganLour.)又称桂圆，是我国亚热带名贵果树，广泛分布于福建、 广东、广西等省，其果实经济价值高，富含多种维生素、果糖和矿物质等对人体有益的营养 成分，且有一定的药用保健功效。随着龙眼相关产业的逐步发展，味甜、核小等特征已经成 为筛选龙眼品种的标准(古小玲,李玉萍,梁伟红等.中国龙眼产业发展概况.中国农学通 报,2008,09:470-474)。

对于果树来说，胚胎败育产生的小核或者无核能够提高水果的可食率，从而大幅度提高 水果质量。龙眼胚胎败育大致可分为两种：部分败育型，即在同一植株中有的胚胎发育正常， 具有较大的果核，而有的胚胎在发育的中途败育；完全败育型，即成熟的果实中种子很少或 者没有种子，即所谓的焦核。目前已发现多个优良的龙眼焦核品种，但多数生产性状不够稳 定，难以推广，严重影响龙眼焦核的选育进程(杨永青,陈志峰.焦核龙眼果实遗传性状及 胚培养的研究.园艺学报,1987,04:217-222)。

胚胎发育过程是植物中最重要的发育过程之一，牵涉到多个基因的协同作用，其中一个 或几个关键基因发生突变时可能会导致植物胚胎败育(MeinkeDW.PerspectivesonGenetic AnalysisofPlantEmbryogenesis.ThePlantCell,1991,3(9):857)。目前植物中研究 较多的是拟南芥中的胚胎败育相关基因。

Garcia等(GarciaD,SaingeryV,ChambrierP,etal.Arabidopsishaikumutants revealnewcontrolsofseedsizebyendosperm.PlantPhysiology,2003,131(4): 1661-1670)报道了拟南芥的两个突变体iku1和iku2会导致胚乳细胞化时间提前，引起胚乳 发育减少从而导致种子减小。IKU1属于拟南芥VQ基因家族，VQ蛋白是一类植物特异性蛋白， 参与调控植物的生长发育过程，其名称源于它们都有一个保守的VQ-motif。此后，Luo等(Luo M,DennisES,BergerF,etal.MINISEED3(MINI3),aWRKYfamilygene,andHAIKU2 (IKU2),aleucine-richrepeat(LRR)KINASEgene,areregulatorsofseedsizein Arabidopsis.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStates ofAmerica,2005,102(48):17531-17536)从拟南芥小种子突变体中还分离鉴定出一个属 于WRKY转录因子家族的MINI3基因，MINI3和IKU2的双基因纯合突变体植株长势较弱，胚 乳细胞化的时间提前。研究表明IKU1、IKU2和MINI3这三个基因可能通过同一途径调控拟南 芥种子的发育(图1)(参见文献：WangAH,GarciaDetal.,TheVQmotifproteinIKU1 regulatesendospermgrowthandseedsizeinArabidopsis.ThePlantJournal,2010, 63(4):670-679)。

发明内容

本发明的目的在于针对现有的龙眼胚胎发育基因尚未被克隆的不足，提供一种龙眼胚胎 发育相关基因DlIKU1及其应用。

所述龙眼胚胎发育相关基因DlIKU1的龙眼DlIKU1开放阅读框(ORF)共有990个碱基 组成；编码329个氨基酸，等电点(pI)为11.45的蛋白质，其核苷酸和氨基酸序列如下：

以下给出龙眼胚胎发育相关基因DlIKU1的克隆方法：

根据拟南芥IKU1保守区序列设计引物，扩增正常发育龙眼(FJ7811)的cDNA，通过三 轮的PCR扩增，获得1100bp的扩增片段，通过ORFFinder软件预测龙眼DlIKU1开放阅读框 (ORF)共有990个碱基组成；编码329个氨基酸，等电点(pI)为11.45的蛋白质。

以下给出龙眼DlIKU1基因的功能：

1、龙眼DlIKU1和MINI3存在相互作用

以拟南芥野生型植株受精后2～3天荚果的cDNA为模板，以MINI3-AD-NF、MINI3-AD-NR 和MINI3-AD-F、MINI3-AD-R两对引物，均能成功扩增出目的基因片段。双酶切(EcoRⅠ和Xho Ⅰ)载体pGADT7和目的片段，连接、转化大肠杆菌后挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，鉴定正 确后提取质粒。

DlIKU1基因克隆是以质粒pMD19T-DlIKU1为模板，以DlIKU1-BD-F和DlIKU1-BD-R为PCR 引物，能够扩增一条片段大小在990bp基因片段。双酶切(EcoRⅠ和SalⅠ)载体pGBKT7和 目的片段，连接、转化大肠杆菌后挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，鉴定正确后提取质粒。

酵母双杂交实验结果显示，DlIKU1与拟南芥中MINI3存在相互作用。

在拟南芥中，MINI3和IKU1存在相互作用，MINI3基因的N端序列具有重要作用。将 MINI3-N片段与pGBKT7载体连接，转入Y2HGold酵母感受态细胞，同时将空载体pGBKT7转 化酵母菌株Y2HGold酵母感受态细胞；DlIKU11-120片段与载体pGADT7连接，转入Y187酵 母酵母感受态细胞，同时也将空载pGADT7转化Y187酵母感受态细胞。酵母双杂交实验进一 步验证表明DlIKU1与拟南芥中MINI3-N端存在相互作用。

2、DlIKU1基因对种子发育的影响

龙眼属于木本植物，其组织培养和植株再生困难，而且遗传转化的效率非常低，因此将 DlIKU1基因导入拟南芥进行功能验证。

利用Gateway技术构建过表达载体，转化根癌农杆菌GV3101感受态细胞，菌落PCR鉴定 得到阳性克隆。制备农杆菌侵染液侵染拟南芥，受体材料为野生型Ler拟南芥植株和iku1突 变体植株，获得过表达转基因植株和回补株系。分别提取转基因植株和野生型植株叶片DNA， 以转基因植株总DNA为模板、野生型植株DNA为阴性对照，扩增DlIKU1基因，验证转基因 植株。

分别统计过表达株系(侵染转化Ler植株后的株系)和回补株系(侵染转化iku1突变体 后的株系)T3代种子的长宽。结果表明：当含VQmotif的龙眼DlIKU1过量表达载体转入野 生型Ler植株时，过表达株系的种子大小较野生型种子来说，长和宽均发生变化；当含VQmotif 的表达载体转入iku1突变体植株后，T3代种子变大，说明含有VQmotif的龙眼基因DlIKU1 在能够影响种子发育。

3、龙眼DlIKU1功能分析

通过酵母双杂交验证发现，DlIKU1基因编码的蛋白与拟南芥中MINI3转录因子存在相互 作用，且MINI3基因的N端序列对于DlIKU1蛋白互作是重要的。当DlIKU1基因导入拟南芥 后，可以与MINI3形成稳定的蛋白复合体，从而调控下游基因表达，影响种子的发育。

此外，通过分析该基因在龙眼转录组测序中的表达量显示：在正常发育品种中变化是先 上升后下调，且在第二发育时期表达量最高；而在胚胎败育品种中，在第二时期表达量最高， 且在第三发育时期，没有检测到该基因；在同一发育时期，该基因在正常品种中的表达量高 于胚胎败育品种中的表达量，该基因低表达可能影响了胚胎发育的过程。由于龙眼遗传转化 效率较低，因此将DlIKU1基因导入拟南芥进行功能验证；统计过表达株系和回补株系后代种 子长宽变化，说明DlIKU1基因与拟南芥种子发育相关。

综上所述，龙眼DlIKU1基因可以通过抑制其表达用于控制龙眼的胚胎发育，获得稳定的 焦核龙眼。

本发明公开了一个龙眼胚胎发育相关基因DlIKU1及其应用。本发明中眼胚胎发育相关基 因DlIKU1的核苷酸序列以及其编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表所示。本发明龙眼胚胎发 育相关基因DlIKU1的克隆有助于研究龙眼胚胎败育的分子机制，对生产上培育具有优良小核 的高质龙眼品种具有很高的应用价值。

附图说明

图1为IKU1、IKU2和MINI3相互作用而影响种子发育的模型。

图2为DlIKU1的蛋白保守结构域。

图3为VQmotif蛋白多序列比对。

图4为DlIKU1基因表达谱聚类分析。

图5为DlIKU1与MINI3在酵母中相互作用。

图6为DlIKU1与MINI3在酵母中相互作用。

图7为野生型和转基因植株种子平均长宽。(A)野生型种子与过表达(OE)植株种子长 宽统计；(B)突变体种子与iku1/DlIKU1植株种子长宽统计；a、b、c、d分别表示有显著性 差异(p＜0.05)；ab表示与a、b无显著性差异。

具体实施方式

1、龙眼胚胎发育相关基因DlIKU1的克隆

根据拟南芥IKU1保守区序列设计引物，扩增正常发育龙眼(FJ7811)的cDNA，通过三 轮的PCR扩增，获得1100bp的扩增片段，通过ORFFinder软件预测龙眼DlIKU1开放阅读框 (ORF)共有990个碱基组成；编码329个氨基酸，等电点(pI)为11.45的蛋白质。

蛋白结构预测显示DlIKU1与拟南芥IKU1一样，含有VQmotif保守结构域(图2)。

将DlIKU1与5个参考物种(脐橙(Citrussinensis)、克莱门柚(Citrusclementina)、毛果 杨(Populustrichocarpa)、蓖麻(Ricinuscommunis)、葡萄(Vitisvinifera))中同源基因的氨 基酸序列通过进行多序列比对，结果显示：DlIKU1与等蛋白序列都含有相同的保守结构域， 具有一定的同源性(图3)。

根据上述生物信息学分析结果，推测龙眼DlIKU1基因可能与拟南芥中IKU1基因具有类似 的功能。

对正常品种和胚胎败育品种的4个胚胎发育时期样品进行转录组测序，分析发现：DlIKU1 基因在正常发育品种中的变化是先上升后下调，且在时期2表达量最高；而在胚胎败育品种 中，该基因在时期2表达量最高，且在时期3发育时期，没有检测到该基因；在同一发育时 期，DlIKU1基因在正常发育品种中的表达量高于胚胎败育品种中的表达量(图4)，可能是由 于该基因表达水平的相对降低，影响了胚胎发育的过程。

2、龙眼DlIKU1基因功能研究

2.1龙眼DlIKU1和MINI3存在相互作用

以拟南芥野生型植株受精后2-3天荚果的cDNA为模板，以MINI3-AD-NF、MINI3-AD-NR 和MINI3-AD-F、MINI3-AD-R两对引物，均能成功扩增出目的基因片段。双酶切(EcoRⅠ和Xho Ⅰ)载体pGADT7和目的片段，连接、转化大肠杆菌后挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，鉴定正 确后提取质粒。

DlIKU1基因克隆是以质粒pMD19T-DlIKU1为模板，以DlIKU1-BD-F和DlIKU1-BD-R为PCR 引物，能够扩增一条片段大小在990bp基因片段。双酶切(EcoRⅠ和SalⅠ)载体pGBKT7和 目的片段，连接、转化大肠杆菌后挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，鉴定正确后提取质粒。

酵母双杂交实验结果显示DlIKU1与拟南芥中MINI3存在相互作用(图5)。

在拟南芥中，MINI3和IKU1存在相互作用，MINI3基因的N端序列具有重要作用。将 MINI3-N片段与pGBKT7载体连接，转入Y2HGold酵母感受态细胞，同时将空载体pGBKT7转 化酵母菌株Y2HGold酵母感受态细胞；DlIKU11-120片段与载体pGADT7连接，转入Y187酵 母酵母感受态细胞，同时也将空载pGADT7转化Y187酵母感受态细胞。酵母双杂交实验进一 步验证表明DlIKU1与拟南芥中MINI3-N端存在相互作用(图6)。

2.2DlIKU1基因对种子发育的影响

龙眼属于木本植物，其组织培养和植株再生困难，而且遗传转化的效率非常低，因此将 DlIKU1基因导入拟南芥进行功能验证。

利用Gateway技术构建过表达载体，转化根癌农杆菌GV3101感受态细胞，菌落PCR鉴定 得到阳性克隆。制备农杆菌侵染液侵染拟南芥，受体材料为野生型Ler拟南芥植株和iku1突 变体植株，获得过表达转基因植株和回补株系。分别提取转基因植株和野生型植株叶片DNA， 以转基因植株总DNA为模板、野生型植株DNA为阴性对照，扩增DlIKU1基因，验证转基因 植株。

分别统计过表达株系(侵染转化Ler植株后的株系)和回补株系(侵染转化iku1突变体 后的株系)T3代种子的长宽。结果表明：当含VQmotif的龙眼DlIKU1过量表达载体转入野 生型Ler植株时，过表达株系的种子大小较野生型种子来说，长和宽均发生变化；当含VQmotif 的表达载体转入iku1突变体植株后，T3代种子变大，说明含有VQmotif的龙眼基因DlIKU1 在能够影响种子发育(图7)。

2.3龙眼DlIKU1功能分析

通过酵母双杂交验证发现，DlIKU1基因编码的蛋白与拟南芥中MINI3转录因子存在相互 作用，且MINI3基因的N端序列对于DlIKU1蛋白互作是重要的。当DlIKU1基因导入拟南芥 后，可以与MINI3形成稳定的蛋白复合体，从而调控下游基因表达，影响种子的发育。

此外，通过分析该基因在龙眼转录组测序中的表达量显示：在正常发育品种中变化是先 上升后下调，且在第二发育时期表达量最高；而在胚胎败育品种中，在第二时期表达量最高， 且在第三发育时期，没有检测到该基因；在同一发育时期，该基因在正常品种中的表达量高 于胚胎败育品种中的表达量，该基因低表达可能影响了胚胎发育的过程。由于龙眼遗传转化 效率较低，因此将DlIKU1基因导入拟南芥进行功能验证；统计过表达株系和回补株系后代种 子长宽变化，说明DlIKU1基因与拟南芥种子发育相关。

综上所述，龙眼DlIKU1基因可以通过抑制其表达用于控制龙眼的胚胎发育，获得稳定的 焦核龙眼。

本发明公开了一个龙眼胚胎发育相关基因DlIKU1及其应用。本发明中眼胚胎发育相关基 因DlIKU1的核苷酸序列以及其编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表所示。本发明龙眼胚胎发 育相关基因DlIKU1的克隆有助于研究龙眼胚胎败育的分子机制，对生产上培育具有优良小核 的高质龙眼品种具有很高的应用价值。