修饰型阿马多里酶及其制造法、以及阿马多里酶的耐表面活性剂性提高剂和使用它的HbA1c 测定用组合物

摘要

本发明提供即便在比以往强的表面活性剂的存在下也能够测定糖化血红蛋白的组合物。另外提供维持阿马多里酶的残留活性或者减少残留活性的降低的缓冲剂和/或稳定剂。本发明提供在与序列号1或3表示的来自锥毛壳(Coniochaeta)属的阿马多里酶的选自262位、257位、249位、253位、337位、340位、232位、129位、132位、133位、44位、256位、231位以及81位中的氨基酸对应的位置具有1个或1个以上的氨基酸残基的替换的阿马多里酶，以及含有即便在表面活性剂的存在下也残留有活性的阿马多里酶的糖化血红蛋白测定用组合物。另外，本发明提供含有特定的稳定剂和/或缓冲剂的糖化血红蛋白测定用组合物和试剂盒。根据本发明能够提供即便暴露于表面活性剂中保存稳定性也优异的酶和糖化血红蛋白测定用组合物。

说明书

技术领域

本发明涉及可用作糖尿病的诊断用酶、另外能够有效地用于糖尿病标志物的测定试剂盒的耐表面活性剂性优异的阿马多里酶(Amadoriase)，其基因和重组体DNA以及耐表面活性剂性优异的阿马多里酶的制造法。另外，本发明涉及阿马多里酶的稳定剂和/或缓冲剂以及含有阿马多里酶的稳定剂和/或缓冲剂的组合物。

背景技术

糖化蛋白质是葡萄糖等醛糖(潜在地具有醛基的单糖及其衍生物)的醛基与蛋白质的氨基以非酶形式形成共价键并进行阿马多里重排而生成的。作为蛋白质的氨基，可举出氨基末端的α氨基、蛋白质中的赖氨酸残基侧链的ε氨基。作为生物体内产生的糖化蛋白质，已知有血液中的血红蛋白被糖化而成的糖化血红蛋白、白蛋白被糖化而成的糖化白蛋白等。

这些在生物体内产生的糖化蛋白质中，在糖尿病的临床诊断领域，作为用于糖尿病患者的诊断、症状管理的重要的血糖控制标志物，糖化血红蛋白(HbA1c)备受注目。血液中的HbA1c浓度反应过去的一定期间的平均血糖值，其测定值是诊断、管理糖尿病的症状的重要指标。

作为迅速且简便地测定该HbA1c的方法，提出了使用阿马多里酶的酶方法，即，用蛋白酶等将HbA1c分解，对从其β链氨基末端游离的α-果糖基缬氨酰基组氨酸(以下表示为“αFVH”)或α-果糖缬氨酸(以下表示为“αFV”)进行定量的方法(例如，参照专利文献1～7)。实际上，在从HbA1c切出αFV的方法中，存在受杂质等的影响大，得不到正确的测定值这样的课题，出于得到更正确的测定值的目的，特别是现在测定αFVH的方法成为主流。

阿马多里酶催化以下反应：在氧的存在下将亚氨基二乙酸或其衍生物(也称为“阿马多里化合物”)氧化而生成乙醛酸或α-酮醛、氨基酸或肽和过氧化氢。

阿马多里酶从细菌、酵母、真菌中发现，作为特别是对测定HbA1c有用的、对αFVH和/或αFV具有酶活性的阿马多里酶，例如，报告了来自锥毛壳(Coniochaeta)属、正青霉(Eupenicillium)属、棘壳孢菌(Pyrenochaeta)属、节菱孢菌(Arthrinium)属、弯孢菌(Curvularia)属、新赤壳菌(Neocosmospora)属、隐球菌(Cryptococcus)属、暗球腔菌(Phaeosphaeria)属、曲霉(Aspergillus)属、翘孢霉(Emericella)属、细基格孢(Ulocladium)属、青霉(Penicillium)属、镰刀菌(Fusarium)属、锥毛毛壳(Achaetomiella)属、毛毛壳(Achaetomium)属、梭孢壳(Thielavia)属、毛壳(Chaetomium)属、五谷麻孢壳(Gelasinospora)属、小囊菌(Microascus)属、小球腔菌(Leptosphaeria)属、蛇孢腔菌(Ophiobolus)属、格孢腔菌(Pleospora)属、闭毛孢壳(Coniochaetidium)属、毕赤酵母(Pichia)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、土壤杆菌(Agrobacterium)属、节杆菌(Arthrobacter)属的阿马多里酶(例如，参照专利文献1、6～15、非专利文献1～11)。应予说明，在上述报告例中，根据文献的不同，阿马多里酶有时也被记载为酮胺氧化酶、果糖基氨基酸氧化酶、果糖基肽氧化酶、果糖基胺氧化酶等表达方式。

测定HbA1c时，已知在测定用的试剂组合物中含有过量的阿马多里酶。例如，测定终浓度0.36μM的HbA1c时，阿马多里酶使用1.4kU/L，即每1分钟能够与1.4mM的底物反应的浓度(参照专利文献16)。使用阿马多里酶的HbA1c的测定中，使用自动分析装置的手法成为主流，大多情况下以该阿马多里酶与底物的反应时间为5分钟～25分钟左右进行测定。含有过量的阿马多里酶的理由是为了在如上所述的短时间的测定时间内与底物充分反应，另外，会对阿马多里酶的反应性、稳定性产生大的不良影响的物质在测定用组合物中共存时，作为应对该影响的对策，不得不配合过量的阿马多里酶。

作为用于使用阿马多里酶从全血或红细胞测定HbA1c的前处理方法，可举出使用表面活性剂溶血的事例(例如，参照专利文献2、16～18)。用蛋白酶分解HbA1c时，有时使用表面活性剂作为反应促进剂(例如，参照专利文献19)。因此，当使用阿马多里酶测定HbA1c时，表面活性剂是必不可少的，在将用表面活性剂和蛋白酶处理过的HbA1c溶液与阿马多里酶溶液混合后开始HbA1c定量反应时以及表面活性剂与阿马多里酶混合保存时，表面活性剂使阿马多里酶变性的可能性极高。由于现在的HbA1c测定用试剂盒中配合比必要量更多的阿马多里酶，且配合稳定剂，所以能够实现正确的测定，但由于使用了大量的试剂，所以高成本是避免不了的。另外，如果能够使用效果比现在更强的表面活性剂，则HbA1c的蛋白酶分解效率能够进一步得到改善，HbA1c的测定灵敏度提高的可能性高。此外，由于表面活性剂还有使来自血红蛋白、HbA1c的不溶性肽片段变得可溶的效果，所以能够防止混浊的产生，有助于测定精度的提高。因此，可以说将阿马多里酶作为糖尿病的临床诊断用酶配合到试剂盒试剂中所期望的性质之一是含有表面活性剂的液体的良好稳定性。

实际的测定条件各有不同，公知的文献中看到各种关于阿马多里酶的液态稳定性的公开内容：示出了向含有来自锥毛壳属(Coniochaetasp.)NISL9330株的阿马多里酶的溶液中添加5mM的乙二胺四乙酸和3％的甘氨酸时，在30℃、7天后维持了79％的残留活性(例如，参照专利文献20)。另外，示出了向含有来自尖孢镰刀菌IFO-9972株的果糖基氨基酸氧化酶的溶液中添加3％的L-丙氨酸、3％的甘氨酸或3％的肌氨酸时，在37℃、2天后维持了100％的残留活性(例如，参照专利文献21)。

然而，在如上所述的含有阿马多里酶蛋白质的溶液中没有添加表面活性剂，完全没有减少表面活性剂的影响的记载。另外，没有报告过耐表面活性剂性高的阿马多里酶。此外也没有报告过在表面活性剂存在下维持阿马多里酶的残留活性或减少残留活性的降低的稳定剂、缓冲剂。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:国际公开第2004/104203号

专利文献2:国际公开第2005/49857号

专利文献3:日本特开2001-95598号公报

专利文献4:日本特公平05-33997号公报

专利文献5:日本特开平11-127895号公报

专利文献6:国际公开第97/13872号

专利文献7:日本特开2011-229526号公报

专利文献8:日本特开2003-235585号公报

专利文献9:日本特开2004-275013号公报

专利文献10:日本特开2004-275063号公报

专利文献11:日本特开2010-35469号公报

专利文献12:日本特开2010-57474号公报

专利文献13:国际公开第2010/41715号

专利文献14:国际公开第2010/41419号

专利文献15:国际公开第2011/15325号

专利文献16:国际公开第2012/020744号

专利文献17:国际公开第2005/87946号

专利文献18:国际公开第2002/06519号

专利文献19:国际公开第2006/120976号

专利文献20:日本特开2006-325547号公报

专利文献21:日本特开2009-000128号公报

非专利文献

非专利文献1:Biochem.Biophys.Res.Commun.311,104-11,2003

非专利文献2:Biotechnol.Bioeng.106,358-66,2010

非专利文献3:J.Biosci.Bioeng.102,241-3,2006

非专利文献4:Eur.J.Biochem.242,499-505,1996

非专利文献5:Arch.Microbiol.178,344-50,2002

非专利文献6:Mar.Biotechnol.6,625-32,2004

非专利文献7:Biosci.Biotechnol.Biochem.59,487-91,1995

非专利文献8:Appl.Microbiol.Biotechnol.74,813-819,2007

非专利文献9:Biosci.Biotechnol.Biochem.66,1256-61,2002

非专利文献10:Biosci.Biotechnol.Biochem.66,2323-29,2002

非专利文献11:Biotechnol.Letters27,27-32,2005

发明内容

如上所述，以往为了在测定时间内与底物充分反应而过量使用阿马多里酶。本发明人等首次发现表面活性剂是会对阿马多里酶的稳定性造成显著不良影响的成分。因此，如果制出与现有的阿马多里酶相比具有更优异的耐表面活性剂性的酶，就可以期待在酶和试剂盒的流通中的便利性、减少配合在试剂盒中的阿马多里酶和稳定剂的量而带来的低成本化、通过配合强效的表面活性剂而在HbA1c的测定灵敏度提高方面给予巨大贡献。因此，本发明想要解决的课题在于提供耐表面活性剂性比现有的阿马多里酶优异的阿马多里酶，以及提供即便在表面活性剂存在下也能够定量HbA1c或定量来自HbA1c的糖化肽的试剂组合物。

另外，本发明想要解决的课题在于提供在表面活性剂存在下维持阿马多里酶的残留活性或减少残留活性的降低的稳定剂和/或缓冲剂以及含有该稳定剂和/或缓冲剂的组合物。

在几乎没有公开对酶赋予耐表面活性剂性的信息的现状中，本发明人等经过深入研究，结果发现通过对来自锥毛壳属的阿马多里酶引入特定的氨基酸残基的替换，另外，使试剂组合物中含有即便在表面活性存在下也残留有活性的阿马多里酶，能够解决上述课题，此外，发现如果使用特定的稳定剂和/或缓冲剂，则能够在表面活性剂存在下维持阿马多里酶的残留活性或者有意义地减少残留活性的降低，从而完成了本发明。

即，本发明如下。

[1]一种阿马多里酶，与具有序列号1、3或37表示的氨基酸序列的阿马多里酶相比，在添加表面活性剂5分钟后的残留活性(％)提高，

该阿马多里酶具有(i)在序列号1、3或37表示的氨基酸序列中缺失、插入、添加和/或替换1个或多个氨基酸而得的氨基酸序列，且/或具有(ii)与序列号1、3或37表示的氨基酸序列具有至少70％同源性的氨基酸序列。

[2]根据[1]所述的阿马多里酶，其中，表面活性剂为离子性表面活性剂。

[3]根据[1]或[2]所述的阿马多里酶，其中，在序列号1或3表示的氨基酸序列的与选自以下(i)～(xiv)中的氨基酸对应的位置具有1个或1个以上的氨基酸残基的替换，

(i)262位的天冬酰胺、

(ii)257位的缬氨酸、

(iii)249位的谷氨酸

(iv)253位的谷氨酸、

(v)337位的谷氨酰胺、

(vi)340位的谷氨酸、

(vii)232位的天冬氨酸、

(viii)129位的天冬氨酸、

(ix)132位的天冬氨酸、

(x)133位的谷氨酸、

(xi)44位的谷氨酸、

(xii)256位的甘氨酸、

(xiii)231位的谷氨酸、以及

(xiv)81位的谷氨酸。

[4]根据[1]～[3]中任1项所述的阿马多里酶，其中，序列号1或3表示的氨基酸序列的氨基酸具有以下(i)～(xiv)的替换中的任1个以上，

(i)262位的天冬酰胺被替换成组氨酸；

(ii)257位的缬氨酸被替换成半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸；

(iii)249位的谷氨酸被替换成赖氨酸、精氨酸；

(iv)253位的谷氨酸被替换成赖氨酸、精氨酸；

(v)337位的谷氨酰胺被替换成赖氨酸、精氨酸；

(vi)340位的谷氨酸被替换成脯氨酸；

(vii)232位的天冬氨酸被替换成赖氨酸、精氨酸；

(viii)129位的天冬氨酸被替换成赖氨酸、精氨酸；

(ix)132位的天冬氨酸被替换成赖氨酸、精氨酸；

(x)133位的谷氨酸被替换成丙氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、精氨酸；

(xi)44位的谷氨酸被替换成脯氨酸；

(xii)256位的甘氨酸被替换成赖氨酸、精氨酸；

(xiii)231位的谷氨酸被替换成赖氨酸、精氨酸；以及

(xiv)81位的谷氨酸被替换成赖氨酸、精氨酸。

[5]根据[1]～[4]中任1项所述的阿马多里酶，其中，在序列号1或3表示的氨基酸序列中，具有选自以下(i)～(ix)中的氨基酸残基的替换，

(i)与44位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向脯氨酸的替换和与340位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向脯氨酸的替换；

(ii)与44位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向脯氨酸的替换、与262位的天冬酰胺对应的位置的氨基酸向组氨酸的替换和与340位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向脯氨酸的替换；

(iii)与44位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向脯氨酸的替换、与257位的缬氨酸对应的位置的氨基酸向半胱氨酸的替换、与262位的天冬酰胺对应的位置的氨基酸向组氨酸的替换和与340位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向脯氨酸的替换；

(iv)与44位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向脯氨酸的替换、与257位的缬氨酸对应的位置的氨基酸向半胱氨酸的替换、与262位的天冬酰胺对应的位置的氨基酸向组氨酸的替换、与340位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向脯氨酸的替换和与232位的天冬氨酸对应的位置的氨基酸向赖氨酸的替换；

(v)与44位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向脯氨酸的替换、与257位的缬氨酸对应的位置的氨基酸向半胱氨酸的替换、与262位的天冬酰胺对应的位置的氨基酸向组氨酸的替换、与340位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向脯氨酸的替换和与249位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向赖氨酸的替换；

(vi)与44位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向脯氨酸的替换、与253位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向赖氨酸的替换、与257位的缬氨酸对应的位置的氨基酸向半胱氨酸的替换、与262位的天冬酰胺对应的位置的氨基酸向组氨酸的替换和与340位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向脯氨酸的替换；

(vii)与44位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向脯氨酸的替换、与253位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向赖氨酸的替换、与257位的缬氨酸对应的位置的氨基酸向半胱氨酸的替换、与262位的天冬酰胺对应的位置的氨基酸向组氨酸的替换、与340位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向脯氨酸的替换和与129位的天冬氨酸对应的位置的氨基酸向赖氨酸的替换；

(viii)与44位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向脯氨酸的替换、与133位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向丙氨酸的替换、与253位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向赖氨酸的替换、与257位的缬氨酸对应的位置的氨基酸向半胱氨酸的替换、与262位的天冬酰胺对应的位置的氨基酸向组氨酸的替换和与340位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向脯氨酸的替换；以及

(ix)与44位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向脯氨酸的替换、与133位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向丙氨酸的替换、与253位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向赖氨酸的替换、与257位的缬氨酸对应的位置的氨基酸向半胱氨酸的替换、与262位的天冬酰胺对应的位置的氨基酸向组氨酸的替换、与337位的谷氨酰胺对应的位置的氨基酸向赖氨酸的替换和与340位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向脯氨酸的替换。

[6]根据[1]～[3]中任1项所述的阿马多里酶，其中，序列号37表示的氨基酸序列的氨基酸具有以下(i)～(ix)的替换中的任1个以上，

(i)247位的谷氨酸被替换成赖氨酸、精氨酸；

(ii)251位的谷氨酸被替换成赖氨酸、精氨酸；

(iii)335位的苏氨酸被替换成赖氨酸、精氨酸；

(iv)230位的天冬氨酸被替换成赖氨酸、精氨酸；

(v)129位的天冬氨酸被替换成赖氨酸、精氨酸；

(vi)132位的天冬氨酸被替换成赖氨酸、精氨酸；

(vii)133位的谷氨酸被替换成丙氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、精氨酸；

(viii)254位的天冬酰胺被替换成赖氨酸、精氨酸；以及

(ix)229位的谷氨酸被替换成赖氨酸、精氨酸。

[7]根据[1]～[3]和[6]中任1项所述的阿马多里酶，其中，在序列号37表示的氨基酸序列中，具有选自以下(i)～(iv)中的氨基酸残基的替换，

(i)与251位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向赖氨酸的替换和与335位的苏氨酸对应的位置的氨基酸的赖氨酸的替换；

(ii)与132位的天冬氨酸对应的位置的氨基酸向赖氨酸的替换和与335位的苏氨酸对应的位置的氨基酸向赖氨酸的替换；

(iii)与133位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向丙氨酸的替换和与335位的苏氨酸对应的位置的氨基酸向赖氨酸的替换；以及

(iv)与229位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向赖氨酸的替换和与335位的苏氨酸对应的位置的氨基酸向赖氨酸的替换。

[8]一种阿马多里酶基因，编码[1]～[7]中任1项所述的氨基酸序列。

[9]一种重组载体，包含[8]所述的阿马多里酶基因。

[10]一种宿主细胞，包含[9]所述的重组载体。

[11]一种制造阿马多里酶的方法，包括以下的工序：

(i)培养[10]所述的宿主细胞的工序；

(ii)使宿主细胞所含的阿马多里酶基因表达的工序；和

(iii)从培养物分离阿马多里酶的工序。

[12]一种用于测定糖化血红蛋白的组合物，含有[1]～[7]中任1项所述的阿马多里酶。

[13]一种糖化血红蛋白测定用组合物，含有1种以上的表面活性剂和阿马多里酶。

[14]根据[13]所述的组合物，其中，阿马多里酶是满足如下(i)且/或(ii)的阿马多里酶，

(i)添加表面活性剂5分钟后的残留活性(％)与不添加的情况相比残留15％以上，

(ii)在终浓度0.04％的表面活性剂的存在下，添加发色底物N-(羧甲基氨基羰基)-4,4’-双(二甲基氨基)二苯胺钠(DA-64)反应5分钟后的751nm处的吸光度与添加对照液5分钟后的751nm处的吸光度之差为0.006以上，该对照液是使用离子交换水代替糖化氨基酸溶液或糖化肽溶液而成的。

[15]根据[13]或[14]所述的组合物，其中，阿马多里酶是具有与序列号1、3、37或40表示的氨基酸序列具有至少70％同源性的氨基酸序列的阿马多里酶。

[16]根据[13]～[15]中任1项所述的组合物，其中，表面活性剂具有70mM以下的临界胶束浓度。

[17]根据[13]～[16]中任1项所述的组合物，其中，表面活性剂为选自以下的通式(I)表示的季铵盐、以下的通式(II)表示的吡啶盐、以下的通式(III)表示的盐和十二烷基硫酸钠中的1种以上的离子性表面活性剂，

[式中，R¹～R⁴可以相同或不同，表示取代或无取代的C₁～C₂₀烷基、烯基、芳基或苄基，Z^-表示1价的阴离子。]

[式中，R⁵表示取代或无取代的C₁～C₂₀烷基，各R^a可以相同或不同，表示氢原子或取代或无取代的C₁～C₂₀烷基、烯基、芳基或苄基，n表示1～5的整数，Z^-表示1价的阴离子。]

[式中，R⁶～R⁹可以相同或不同，表示取代或无取代的C₁～C₂₀烷基、烯基、芳基或苄基，Z^-表示1价的阴离子]。

[18]根据[17]所述的组合物，其中，表面活性剂为选自如下化合物中的1种以上的离子性表面活性剂，该化合物是：辛基三甲基氯化铵、辛基三甲基溴化铵、二辛基二甲基氯化铵、二辛基二甲基溴化铵、癸基三甲基氯化铵、癸基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基氯化铵、十二烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基氯化铵、十四烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基溴化铵、十八烷基三甲基氯化铵、十八烷基三甲基溴化铵、二十烷基三甲基氯化铵和二十烷基三甲基溴化铵、苄基十二烷基二甲基氯化铵、苄基十二烷基二甲基溴化铵、苄基十四烷基二甲基氯化铵、苄基十四烷基二甲基溴化铵、苄基十六烷基二甲基氯化铵、以及苄基十六烷基二甲基溴化铵、

1-癸基氯化吡啶1-癸基溴化吡啶1-十二烷基氯化吡啶1-十二烷基溴化吡啶1-十四烷基氯化吡啶1-十四烷基溴化吡啶1-十六烷基氯化吡啶1-十六烷基溴化吡啶N-十六烷基-2-甲基氯化吡啶N-十六烷基-2-甲基溴化吡啶N-十六烷基-3-甲基氯化吡啶N-十六烷基-3-甲基溴化吡啶N-十六烷基-4-甲基氯化吡啶N-十六烷基-4-甲基溴化吡啶1-十八烷基氯化吡啶1-十八烷基溴化吡啶1-二十烷基氯化吡啶以及1-二十烷基溴化吡啶

四乙基氯化四乙基溴化三丁基甲基氯化三丁基甲基溴化三丁基甲基碘化四丁基氯化四丁基溴化四正辛基氯化四正辛基溴化三丁基十二烷基氯化三丁基十二烷基溴化三丁基十六烷基氯化三丁基十六烷基溴化甲基三苯基氯化甲基三苯基溴化甲基三苯基碘化四苯基氯化以及四苯基溴化

[19]根据[13]～[18]中任1项所述的组合物，其含有的表面活性剂以测定时的终浓度计为0.01％(w/v)以上。

[20]根据[13]所述的糖化血红蛋白测定用组合物，还含有选自如下缓冲剂以及它们的组合中的1种以上的缓冲剂：硼酸缓冲剂、Tris盐酸缓冲剂、磷酸缓冲剂、柠檬酸缓冲剂、富马酸缓冲剂、戊二酸缓冲剂、柠康酸缓冲剂、中康酸缓冲剂、丙二酸缓冲剂、酒石酸缓冲剂、琥珀酸缓冲剂、己二酸缓冲剂、ACES(N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸)缓冲剂、BES(N,N-双(2-羟基乙基)-2-氨基乙磺酸)缓冲剂、Bicin(N,N-双(2-羟基乙基)甘氨酸)缓冲剂、Bis-Tris(双(2-羟基乙基)亚氨基三(羟基甲基)甲烷)缓冲剂、EPPS(4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪丙磺酸)缓冲剂、HEPPSO(N-(羟基乙基)哌嗪-N’-2-羟基丙磺酸)缓冲剂、MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)缓冲剂、MOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)缓冲剂、MOPSO(2-羟基-3-吗啉代丙磺酸)缓冲剂、PIPES(哌嗪-N,N’-双(2-乙磺酸))缓冲剂、POPSO(哌嗪-1,4-双(2-羟基丙磺酸))缓冲剂、TAPS(N-三(羟基甲基)甲基-3-氨基丙磺酸)缓冲剂、TAPSO(3-[N-三(羟基甲基)甲基氨基]-2-羟基丙磺酸)缓冲剂、TES(N-三(羟基甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)缓冲剂、TRICINE(N-三(羟基甲基)甲基甘氨酸)缓冲剂。

[21]根据[20]所述的组合物，其中，含有选自如下缓冲剂中的1种以上的缓冲剂：测定溶液的终浓度为100mM以上的磷酸缓冲剂、测定溶液的终浓度为10mM以上的柠檬酸缓冲剂、测定溶液的终浓度为150mM以上的MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)缓冲剂、测定溶液的终浓度为100mM以上的MOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)缓冲剂、测定溶液的终浓度为100mM以上的MOPSO(2-羟基-3-吗啉代丙磺酸)缓冲剂以及测定溶液的终浓度为200mM以上的ACES(N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸)缓冲剂。

[22]根据[13]所述的糖化血红蛋白测定用组合物，还含有选自磷酸、三羧酸、二羧酸、单羧酸、式(IV)的化合物、硫酸铵以及它们的组合中的1种以上的稳定剂，

[式中，n可以为0、1、2或3，R¹⁰可各自独立地为H、OH、-CH₂OH或-COOH]。

[23]根据[22]所述的组合物，其中，三羧酸为柠檬酸，或者二羧酸为选自富马酸、戊二酸、柠康酸、中康酸、丙二酸、酒石酸、琥珀酸、己二酸、马来酸、苹果酸和它们的组合中的二羧酸，或者单羧酸为乙酸，或者式(IV)的化合物为选自MES、MOPS、MOPSO和它们的组合中的化合物。

[24]根据[22]或[23]所述的组合物，其中，上述稳定剂是选自如下稳定剂以及它们的组合中的1种以上的稳定剂：测定溶液的终浓度为2mM以上的磷酸、测定溶液的终浓度为0.2mM以上的柠檬酸、测定溶液的终浓度为2mM以上的苹果酸、测定溶液的终浓度为2mM以上的马来酸、测定溶液的终浓度为2mM以上的柠康酸、测定溶液的终浓度为2mM以上的丙二酸、测定溶液的终浓度为2mM以上的戊二酸、测定溶液的终浓度为2mM以上的酒石酸、测定溶液的终浓度为10mM以上的乙酸、测定溶液的终浓度为10mM以上的MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)、测定溶液的终浓度为10mM以上的MOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)、测定溶液的终浓度为10mM以上的MOPSO(2-羟基-3-吗啉代丙磺酸)、测定溶液的终浓度为2mM以上的硫酸铵。

[25]一种糖化血红蛋白测定用组合物，含有[20]或[21]所述的缓冲剂和[22]、[23]或[24]所述的稳定剂。

[26]根据[20]～[25]中任1项所述的组合物，其中，阿马多里酶是具有序列号1、序列号37或序列号40的氨基酸序列的阿马多里酶或者是[1]～[7]中任1项所述的阿马多里酶。

本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请2013-167005号、2013-221515号的说明书和/或附图中记载的内容。

根据本发明，能够提供可用作糖尿病的诊断用酶、另外能够有效地用于糖尿病标志物的测定试剂盒的耐表面活性剂性优异的阿马多里酶和编码它的基因等。如果使用该阿马多里酶，则即便在高浓度的表面活性剂的存在下也能够进行糖化血红蛋白的测定。另外通过使用本发明的稳定剂和/或缓冲剂，能够维持表面活性剂存在下的阿马多里酶的残留活性或者减少残留活性的降低，即便在高浓度的表面活性剂的存在下也能够进行糖化血红蛋白的测定。

附图说明

图1-1是各种公知的阿马多里酶的氨基酸序列的比对。

图1-2是各种公知的阿马多里酶的氨基酸序列的比对。

图1-3是各种公知的阿马多里酶的氨基酸序列的比对。

图2表示在0.01％的CTAC的混合下使用CFP-T7测定αFVH而得的结果。

图3表示在0.02％的CTAC的混合下使用CFP-T7测定αFVH而得的结果。

图4表示在0.02％的CTAC的混合下使用CFP-D7测定αFVH而得的结果。

图5表示在0.2％的CTAC的混合下使用CFP-D7测定αFVH而得的结果。

具体实施方式

以下，对本发明进行详细说明。

(阿马多里酶)

阿马多里酶也被称为酮胺氧化酶、果糖基氨基酸氧化酶、果糖基肽氧化酶、果糖基胺氧化酶等，是催化在氧的存在下将亚氨基二乙酸或其衍生物(阿马多里化合物)氧化而生成乙醛酸或α-酮醛、氨基酸或肽以及过氧化氢的反应的酶。阿马多里酶在自然界中广泛分布，可以通过探索微生物、动物或植物起源的酶而获得。微生物中，例如可以从丝状菌、酵母或细菌等中获得。

本发明的阿马多里酶的一个方式是基于具有序列号1表示的氨基酸序列的来自锥毛壳属的阿马多里酶或具有序列号37表示的氨基酸序列的来自棒弯孢的阿马多里酶而制得的耐表面活性剂性提高的阿马多里酶的变异体。作为这样的变异体的例子，可举出具有与序列号1或序列号37具有高的序列同源性(例如，为70％以上，优选为75％以上，优选为80％以上，更优选为85％以上，进一步优选为90％以上，进一步优选为95％以上，进一步优选为97％以上，最优选为99％以上)的氨基酸序列的阿马多里酶和具有在序列号1或序列号37的氨基酸序列中1个到多个氨基酸被改变或变异或者缺失、替换、添加和/或插入而成的氨基酸序列的阿马多里酶。

应予说明，本发明的阿马多里酶可以是基于来自例如正青霉属、棘壳孢菌属、节菱孢菌属、弯孢菌属、新赤壳菌属、隐球菌属、暗球腔菌属、曲霉属、翘孢霉属、细基格孢属、青霉属、镰刀菌属、锥毛毛壳属、毛毛壳属、梭孢壳属、毛壳属、五谷麻孢壳属、小囊菌属、小球腔菌属、蛇孢腔菌属、格孢腔菌属、闭毛孢壳属、毕赤酵母属、棒状杆菌属、土壤杆菌属、节杆菌属等生物种类的阿马多里酶制得的。这些中优选具有耐表面活性剂性且/或氨基酸序列如上所述与序列号1或序列号37具有高的序列同源性的阿马多里酶。

耐表面活性剂性被改变的阿马多里酶的变异体(修饰体)可以通过在阿马多里酶的氨基酸序列中将至少1个氨基酸残基进行替换或添加或缺失而获得。

作为提高耐表面活性剂性的氨基酸的替换，可举出在序列号1或3表示的氨基酸序列中的与以下位置的氨基酸对应的位置的氨基酸的替换。

(1)262位的天冬酰胺的替换，例如向组氨酸的替换。

(2)257位的缬氨酸的替换，例如向半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸的替换。

(3)249位的谷氨酸的替换，例如向赖氨酸、精氨酸的替换。

(4)253位的谷氨酸的替换，例如向赖氨酸、精氨酸的替换。

(5)337位的谷氨酰胺的替换，例如向赖氨酸、精氨酸的替换。

(6)340位的谷氨酸的替换，例如向脯氨酸的替换。

(7)232位的天冬氨酸的替换，例如向赖氨酸、精氨酸的替换。

(8)129位的天冬氨酸的替换，例如向赖氨酸、精氨酸的替换。

(9)132位的天冬氨酸的替换，例如向赖氨酸、精氨酸的替换。

(10)133位的谷氨酸的替换，例如向丙氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、精氨酸的替换。

(11)44位的谷氨酸的替换，例如向脯氨酸的替换。

(12)256位的甘氨酸的替换，例如向赖氨酸、精氨酸的替换。

(13)231位的谷氨酸的替换，例如向赖氨酸、精氨酸的替换。

(14)81位的谷氨酸的替换，例如向赖氨酸、精氨酸的替换。

耐表面活性剂性提高的阿马多里酶的变异体只要具有至少1个上述氨基酸替换即可，也可以具有多个氨基酸的替换。例如，具有上述氨基酸替换的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个。

其中，优选具有与以下的氨基酸的位置对应的氨基酸的替换的变异体。

(11)-(6)具有44位的谷氨酸的替换和340位的谷氨酸的替换的变异体，例如具有与44位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向脯氨酸的替换和与340位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向脯氨酸的替换的变异体。

(11)-(1)-(6)具有44位的谷氨酸的替换、262位的天冬酰胺的替换和340位的谷氨酸的替换的变异体，例如具有与44位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向脯氨酸的替换、与262位的天冬酰胺对应的位置的氨基酸向组氨酸的替换与340位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向脯氨酸的替换的变异体。

(11)-(2)-(1)-(6)具有44位的谷氨酸的替换、257位的缬氨酸的替换、262位的天冬酰胺的替换和340位的谷氨酸的替换的变异体，例如具有与44位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向脯氨酸的替换、与257位的缬氨酸对应的位置的氨基酸向半胱氨酸的替换、与262位的天冬酰胺对应的位置的氨基酸向组氨酸的替换和与340位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向脯氨酸的替换的变异体。

(11)-(7)-(2)-(1)-(6)具有44位的谷氨酸的替换、257位的缬氨酸的替换、262位的天冬酰胺的替换、340位的谷氨酸的替换、和232位的天冬氨酸的替换的变异体，例如具有与44位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向脯氨酸的替换、与257位的缬氨酸对应的位置的氨基酸向半胱氨酸的替换、与262位的天冬酰胺对应的位置的氨基酸向组氨酸的替换、与340位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向脯氨酸的替换和与232位的天冬氨酸对应的位置的氨基酸向赖氨酸或精氨酸的替换的变异体。

(11)-(3)-(2)-(1)-(6)具有44位的谷氨酸的替换、257位的缬氨酸的替换、262位的天冬酰胺的替换、340位的谷氨酸的替换、和249位的谷氨酸的替换的变异体，例如具有与44位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向脯氨酸的替换、与257位的缬氨酸对应的位置的氨基酸向半胱氨酸的替换、与262位的天冬酰胺对应的位置的氨基酸向组氨酸的替换、与340位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向脯氨酸的替换和与249位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向赖氨酸或精氨酸的替换的变异体。

(11)-(4)-(2)-(1)-(6)具有44位的谷氨酸的替换、253位的谷氨酸的替换、257位的缬氨酸的替换、262位的天冬酰胺的替换和340位的谷氨酸的替换的变异体，例如具有与44位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向脯氨酸的替换、与253位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向赖氨酸或精氨酸的替换、与257位的缬氨酸对应的位置的氨基酸向半胱氨酸的替换、与262位的天冬酰胺对应的位置的氨基酸向组氨酸的替换和与340位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向脯氨酸的替换的变异体。

(11)-(8)-(4)-(2)-(1)-(6)具有44位的谷氨酸的替换、253位的谷氨酸的替换、257位的缬氨酸的替换、262位的天冬酰胺的替换、340位的谷氨酸的替换和129位的天冬氨酸的替换的变异体，例如具有与44位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向脯氨酸的替换、与253位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向赖氨酸或精氨酸的替换、与257位的缬氨酸对应的位置的氨基酸向半胱氨酸的替换、与262位的天冬酰胺对应的位置的氨基酸向组氨酸的替换、与340位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向脯氨酸的替换和与129位的天冬氨酸对应的位置的氨基酸向赖氨酸或精氨酸的替换的变异体。

(11)-(10)-(4)-(2)-(1)-(6)具有44位的谷氨酸的替换、133位的谷氨酸的替换、253位的谷氨酸的替换、257位的缬氨酸的替换、262位的天冬酰胺的替换和340位的谷氨酸的替换的变异体，例如具有与44位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向脯氨酸的替换、与133位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向丙氨酸的替换、与253位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向赖氨酸或精氨酸的替换、与257位的缬氨酸对应的位置的氨基酸向半胱氨酸的替换、与262位的天冬酰胺对应的位置的氨基酸向组氨酸的替换和与340位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向脯氨酸的替换的变异体。

(11)-(10)-(4)-(2)-(1)-(5)-(6)具有44位的谷氨酸的替换、133位的谷氨酸的替换、253位的谷氨酸的替换、257位的缬氨酸的替换、262位的天冬酰胺的替换、337位的谷氨酰胺向赖氨酸的替换和340位的谷氨酸的替换的变异体，例如具有与44位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向脯氨酸的替换、与133位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向丙氨酸的替换、与253位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向赖氨酸或精氨酸的替换、与257位的缬氨酸对应的位置的氨基酸向半胱氨酸的替换、与262位的天冬酰胺对应的位置的氨基酸向组氨酸的替换、与337位的谷氨酰胺对应的位置的氨基酸向赖氨酸或精氨酸的替换和与340位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向脯氨酸的替换的变异体。

本发明的耐表面活性剂性优异的阿马多里酶变异体在序列号1表示的氨基酸序列中可具有上述带来耐表面活性剂性提高的氨基酸的替换。并且，本发明的耐表面活性剂性阿马多里酶变异体在这些替换氨基酸以外的位置，可以进一步缺失、插入、添加和/或替换1个或数个(例如1～15个，例如1～10个，优选为1～5个，进一步优选为1～3个，特别优选为1个)氨基酸。此外本发明包含如下的阿马多里酶变异体，该阿马多里酶变异体具有上述的带来耐表面活性剂性提高的氨基酸的替换变异、提高底物特异性等耐表面活性剂性以外的性质的氨基酸的替换变异，相对于序列号1或3表示的氨基酸序列中的不包括上述替换的氨基酸以外的氨基酸的部分的氨基酸序列，具有70％以上、75％以上、80％以上、90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为97％以上、特别优选为99％以上的氨基酸序列同源性，具有阿马多里酶活性，耐表面活性剂性被改变。

应予说明，具有序列号1表示的氨基酸序列的阿马多里酶是在国际公开2007/125779号中由保持被称为pKK223-3-CFP-T7的重组体质粒(保藏编号：FERMBP-10593)的大肠菌生产的来自锥毛壳属的阿马多里酶(CFP-T7)，是申请人之前发现的热稳定性优异的修饰型阿马多里酶。该CFP-T7是对天然型的来自锥毛壳属的阿马多里酶在272位、302位和388位依次导入人为的变异而获得的3重变异体。

另外，序列号3是导入了国际公开第2012/18094号中示出的底物特异性改善型变异(E98A)以及国际公开第2007/125779号和国际公开第2013/100006号中示出的热稳定性提高型变异(F43Y、G184D、羧基末端的3个氨基酸残基缺失)的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列。

上述的氨基酸替换中，氨基酸的位置表示序列号1表示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列中的位置，在来自其它生物种的阿马多里酶的氨基酸序列中，与序列号1表示的氨基酸序列中的位置对应的位置的氨基酸被替换。关于“对应的位置”的含义后面叙述。

另外，作为带来耐表面活性剂性提高的氨基酸的替换，可举出序列号37表示的氨基酸序列中的与以下位置的氨基酸对应的位置的氨基酸的替换。

(i)247位的谷氨酸的替换，例如向赖氨酸、精氨酸的替换；

(ii)251位的谷氨酸的替换，例如向赖氨酸、精氨酸的替换；

(iii)335位的苏氨酸的替换，例如向赖氨酸、精氨酸的替换；

(iv)230位的天冬氨酸的替换，例如向赖氨酸、精氨酸的替换；

(v)129位的天冬氨酸的替换，例如向赖氨酸、精氨酸的替换；

(vi)132位的天冬氨酸的替换，例如向赖氨酸、精氨酸的替换；

(vii)133位的谷氨酸的替换，例如向丙氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、精氨酸的替换；

(viii)254位的天冬酰胺的替换，例如向赖氨酸、精氨酸的替换；以及

(ix)229位的谷氨酸的替换，例如向赖氨酸、精氨酸的替换。

耐表面活性剂性提高的阿马多里酶的变异体只要具有至少1个上述氨基酸替换即可，也可以具有多个氨基酸替换。例如，具有上述氨基酸替换的1、2、3、4、5、6、7、8、或9个。

其中，优选具有与以下的氨基酸的位置对应的氨基酸的替换的变异体。

在序列号37表示的氨基酸序列中，以下的(i)～(iv)：

(i)具有与251位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向赖氨酸的替换和与335位的苏氨酸对应的位置的氨基酸向赖氨酸的替换的变异体；

(ii)具有与132位的天冬氨酸对应的位置的氨基酸向赖氨酸的替换和与335位的苏氨酸对应的位置的氨基酸向赖氨酸的替换的变异体；

(iii)具有与133位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向丙氨酸的替换和与335位的苏氨酸对应的位置的氨基酸向赖氨酸的替换的变异体；以及

(iv)具有与229位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向赖氨酸的替换和与335位的苏氨酸对应的位置的氨基酸向赖氨酸的替换的变异体。

(编码阿马多里酶的基因的取得)

为了得到编码这些阿马多里酶的本发明的基因(以下，也简称为“阿马多里酶基因”)，通常采用一般使用的基因的克隆方法。例如，可以利用常规方法例如CurrentProtocolsinMolecularBiology(WILEYInterscience，1989)记载的方法，从具有阿马多里酶生产能力的微生物菌体、各种细胞提取染色体DNA或mRNA。进而可以将mRNA作为模板而合成cDNA。可以使用由此得到的染色体DNA或cDNA来制作染色体DNA或cDNA的文库。

接下来，利用基于上述阿马多里酶的氨基酸序列，合成适当的探针DNA，使用其从染色体DNA或cDNA的文库中选出阿马多里酶基因的方法，或者基于上述氨基酸序列，制作适当的引物DNA，利用5’RACE法、3’RACE法等适当的聚合酶链反应(PCR法)，扩增包含编码阿马多里酶的目标基因片段的DNA，使这些DNA片段连结，能够得到包含目标阿马多里酶基因全长的DNA。

作为由此得到的编码阿马多里酶的基因的1个优选的例子，可举出来自锥毛壳属的阿马多里酶基因(日本特开2003-235585号公报)的例子等。

从操作方面考虑，优选这些阿马多里酶基因通过常规方法与各种载体连结。例如可举出将编码来自锥毛壳属NISL9330株的阿马多里酶基因的DNA插入pKK223-3载体(GEHealthcare公司制)而得的重组体质粒pKK223-3-CFP(日本特开2003-235585号公报)。

(载体)

作为本发明中可使用的载体，不限定为上述质粒，可以使用其以外的例如噬菌体、粘粒等本领域技术人员公知的任意的载体。具体而言，例如，优选pBluescriptIISK+(STRATAGENE公司制)等。

(阿马多里酶基因的变异处理)

阿马多里酶基因的变异处理可以用与想要的变异形态相应的公知的任意的方法进行。即，可以广泛采用使阿马多里酶基因或者整合了该基因的重组体DNA与成为变异原的药剂接触·作用的方法；紫外线照射法；基因工程手段；或者运用蛋白质工程手段的方法等。

作为成为上述变异处理中使用的变异原的药剂，例如可举出羟基胺、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍、亚硝酸、亚硫酸、肼、甲酸或5-溴尿嘧啶等。

上述接触·作用的各条件可以采用与使用的药剂的种类等相应的条件，只要在现实中能够在阿马多里酶基因中引起所需的变异就没有特别限定。通常，优选在0.5～12M的上述药剂浓度、20～80℃的反应温度下接触·作用10分钟以上，优选10～180分钟，能够引起所需的变异。在进行紫外线照射的情况下，如上所述也能够根据常规方法进行(现代化学，p24～30，1989年6月号)。

作为运用蛋白质工程手段的方法，一般采用作为位点特异性突变(Site-SpecificMutagenesis)而已知的手段。例如可举出Kramer法(NucleicAcidsRes.，12，9441(1984)：MethodsEnzymol.，154，350(1987)：Gene，37，73(1985))、Eckstein法(NucleicAcidsRes.，13，8749(1985)：NucleicAcidsRes.，13，8765(1985)：NucleicAcidsRes，14，9679(1986))、Kunkel法(Proc.Natl.Acid.Sci.U.S.A.，82，488(1985)：MethodsEnzymol.，154，367(1987))等。作为转换DNA中的碱基序列的具体方法，例如可举出利用市售的试剂盒(转换突变试剂盒(TransformerMutagenesisKit)，Clonetech公司；EXOIII/MungBean缺失试剂盒(EXOIII/MungBeanDeletionKit)，Stratagene制；快速改变定点突变试剂盒(QuickChangeSite-DirectedMutagenesisKit)，Stratagene制等)。

另外，也可以使用作为一般的PCR法(聚合酶链反应：PolymeraseChainReaction)而已知的手段(Technique，1，11(1989))。应予说明，除上述基因改变法以外，也可以利用有机合成法或酶合成法，直接合成所需的修饰阿马多里酶基因。

对利用上述方法得到的阿马多里酶基因的DNA碱基序列进行确定或确认时，例如，可以使用多毛细管DNA解析系统CEQ2000(BeckmanCoulter公司制)等进行。

(转化·转导)

将如上所述得到的阿马多里酶基因利用常规方法整合到噬菌体、粘粒或者用于原核细胞或真核细胞的转化的质粒等载体中，再利用常规方法对与各载体对应的宿主进行转化或转导。例如，可以使用得到的重组体DNA，对任意的宿主例如属于埃希氏菌属的微生物进行转化或转导到它们中而得到各菌株，作为属于埃希氏菌属的微生物的具体例，可举出大肠菌K-12株，优选为大肠菌JM109株、大肠菌DH5α株(均为TakaraBio公司制)，大肠菌B株，优选为大肠菌BL21株(NipponGene公司制)等。

(氨基酸序列的同源性)

氨基酸序列的同源性可以利用GENETYXVer.11(GENETYX公司制)的最大匹配、同源性检索等程序或DNASISPro(HitachiSoft公司制)的最大匹配、多序列比对等程序进行计算。

(与氨基酸对应的位置的确定)

“与氨基酸对应的位置”是指与序列号1表示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列的特定位置的氨基酸对应的来自其它生物种的阿马多里酶的氨基酸序列中的位置。

作为确定“与氨基酸对应的位置”的方法，例如可以通过利用Lipman-Pearson法等公知的算法将氨基酸序列进行比较，对存在于各阿马多里酶的氨基酸序列中的保守氨基酸残基赋予最大的同源性来进行。通过用这样的方法对齐阿马多里酶的氨基酸序列，无论存在于氨基酸序列中的插入、缺失如何，都能够确定相同氨基酸残基在各阿马多里酶序列的序列中位置。认为相同位置是在三维结构中存在于同一位置，关于成为对象的阿马多里酶的特异性功能，可以推断具有类似的效果。

图1-1、1-2、1-3中例示来自各种公知的生物种的阿马多里酶的序列。在最上面示出序列号1表示的氨基酸序列。图1示出的各种序列均与序列号1的序列具有70％以上的同源性，是使用公知的算法对齐的。图中示出本发明的变异体的变异点。从图1-1、1-2、1-3可知与来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列的特定位置的氨基酸对应的来自其它生物种的阿马多里酶的氨基酸序列中的位置。图1-1、1-2、1-3中，示出了来自锥毛壳(Coniochaeta)属的阿马多里酶(序列号1)、来自土正青霉(Eupenicilliumterrenum)的阿马多里酶(序列号34)、来自棘壳孢菌属(Pyrenochaetasp.)的酮胺氧化酶(序列号35)、来自节菱孢菌属(Arthriniumsp.)的酮胺氧化酶(序列号36)、来自棒弯孢(Curvulariaclavata)的酮胺氧化酶(序列号37)、来自侵管新赤壳菌(Neocosmosporavasinfecta)的酮胺氧化酶(序列号38)、来自新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)的果糖基氨基酸氧化酶(序列号39)、来自颖枯壳针孢(Phaeosphaerianodorum)的果糖基肽氧化酶(序列号40)、来自构巢曲霉(Aspergillusnidulans)的果糖基氨基酸氧化酶(序列号41)、来自细基格孢属(Ulocladiumsp.)的果糖基氨基酸氧化酶(序列号42)和来自微紫青霉菌(Penicilliumjanthinellum)的果糖基氨基酸氧化酶(序列号43)的氨基酸序列。

(与替换位置对应的位置)

应予说明，本发明中，“与序列号1记载的氨基酸序列的44位的谷氨酸对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号1表示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较时，与序列号1的阿马多里酶的44位的谷氨酸对应的氨基酸。由此，通过用确定上述的“相当的位置的氨基酸残基”的方法对齐氨基酸序列的图1-1能够确定。

即，在来自土正青霉的阿马多里酶中为44位的赖氨酸、在来自棘壳孢菌属的酮胺氧化酶中为44位的脯氨酸、在来自节菱孢菌属的酮胺氧化酶中为44位的脯氨酸、在来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为44位的脯氨酸、在来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为44位的脯氨酸、在来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为44位的亮氨酸、在来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为44位的脯氨酸、在来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为43位的脯氨酸、在来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为44位的脯氨酸、在来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为44位的脯氨酸。

另外，“与序列号1记载的氨基酸序列的81位的谷氨酸对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号1表示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较时，与序列号1的阿马多里酶的81位的谷氨酸对应的氨基酸。这个也可以通过用上述的方法对齐氨基酸序列的图1-1来确定。

即，在来自土正青霉的阿马多里酶中为81位的天冬酰胺、在来自棘壳孢菌属的酮胺氧化酶中为81位的谷氨酸、在来自节菱孢菌属的酮胺氧化酶中为81位的组氨酸、在来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为81位的谷氨酸、在来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为81位的天冬酰胺、在来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为81位的天冬酰胺、在来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为81位的谷氨酸、在来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为80位的天冬酰胺、在来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为81位的谷氨酸、在来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为81位的天冬酰胺。

另外，“与序列号1记载的氨基酸序列的133位的谷氨酸对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号1表示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较时，与序列号1记载的氨基酸序列的133位的谷氨酸对应的氨基酸。这个也可以通过用上述的方法对齐氨基酸序列的图1-1来确定。

即，在来自土正青霉的阿马多里酶中为133位的谷氨酸、在来自棘壳孢菌属的酮胺氧化酶中为133位的谷氨酸、在来自节菱孢菌属的酮胺氧化酶中为133位的丙氨酸、在来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为133位的谷氨酸、在来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为133位的丙氨酸、在来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为133位的谷氨酸、在来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为131位的谷氨酸、在来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为132位的谷氨酸、在来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为133位的赖氨酸、在来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为133位的天冬氨酸。

另外，“与序列号1记载的氨基酸序列的253位的谷氨酸对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号1表示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较时，与序列号1记载的氨基酸序列的253位的谷氨酸对应的氨基酸。这个也可以通过用上述的方法对齐氨基酸序列的图1-2来确定。

即，在来自土正青霉的阿马多里酶中为253位的丙氨酸、在来自棘壳孢菌属的酮胺氧化酶中为251位的丙氨酸、在来自节菱孢菌属的酮胺氧化酶中为253位的谷氨酸、在来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为251位的谷氨酸、在来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为253位的缬氨酸、在来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为253位的谷氨酸、在来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为249位的精氨酸、在来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为253位的丙氨酸、在来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为251位的谷氨酸、在来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为253位的谷氨酰胺。

此外，“与序列号1记载的氨基酸序列的256位的甘氨酸对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号1表示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较时，与序列号1的阿马多里酶的256位的甘氨酸对应的氨基酸。这个也可以通过用上述的方法对齐氨基酸序列的图1-2来确定。

即，在来自土正青霉的阿马多里酶中为256位的天冬酰胺、在来自棘壳孢菌属的酮胺氧化酶中为254位的天冬氨酸、在来自节菱孢菌属的酮胺氧化酶中为256位的甘氨酸、在来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为254位的天冬酰胺、在来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为256位的甘氨酸、在来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为256位的谷氨酸、在来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为252位的天冬酰胺、在来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为256位的天冬酰胺、在来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为254位的天冬酰胺、在来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为256位的天冬氨酸。

此外，“与序列号1记载的氨基酸序列的257位的缬氨酸对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号1表示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较时，与序列号1的阿马多里酶的257位的缬氨酸对应的氨基酸。这个也可以通过用上述的方法对齐氨基酸序列的图1-2来确定。

即，在来自土正青霉的阿马多里酶中为257位的缬氨酸、在来自棘壳孢菌属的酮胺氧化酶中为255位的苏氨酸、在来自节菱孢菌属的酮胺氧化酶中为257位的半胱氨酸、在来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为255位的缬氨酸、在来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为257位的半胱氨酸、在来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为257位的半胱氨酸、在来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为253位的丝氨酸、在来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为257位的苏氨酸、在来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为255位的缬氨酸、在来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为257位的缬氨酸。

此外，“与序列号1记载的氨基酸序列的262位的天冬酰胺对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号1表示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较时，与序列号1的阿马多里酶的262位的天冬酰胺对应的氨基酸。这个也可以通过用上述的方法对齐氨基酸序列的图1-2来确定。

即，在来自土正青霉的阿马多里酶中为262位的天冬氨酸、在来自棘壳孢菌属的酮胺氧化酶中为260位的天冬酰胺、在来自节菱孢菌属的酮胺氧化酶中为262位的组氨酸、在来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为260位的天冬酰胺、在来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为262位的组氨酸、在来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为262位的天冬酰胺、在来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为258位的天冬酰胺、在来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为262位的天冬氨酸、在来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为260位的天冬酰胺、在来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为262位的天冬氨酸。

此外，“与序列号1记载的氨基酸序列的337位的谷氨酰胺对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号1表示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较时，与序列号1的阿马多里酶的337位的谷氨酰胺对应的氨基酸。这个也可以通过用上述的方法对齐氨基酸序列的图1-2来确定。

即，在来自土正青霉的阿马多里酶中为337位的赖氨酸、在来自棘壳孢菌属的酮胺氧化酶中为335位的赖氨酸、在来自节菱孢菌属的酮胺氧化酶中为338位的谷氨酰胺、在来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为335位的苏氨酸、在来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为337位的赖氨酸、在来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为337位的赖氨酸、在来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为333位的赖氨酸、在来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为337位的天冬酰胺、在来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为335位的苏氨酸、在来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为337位的赖氨酸。

此外，“与序列号1记载的氨基酸序列的340位的谷氨酸对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号1表示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较时，与序列号1的阿马多里酶的340位的谷氨酸对应的氨基酸。这个也可以通过用上述的方法对齐氨基酸序列的图1-2来确定。

即，在来自土正青霉的阿马多里酶中为340位的谷氨酸、在来自棘壳孢菌属的酮胺氧化酶中为338位的谷氨酸、在来自节菱孢菌属的酮胺氧化酶中为341位的谷氨酸、在来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为338位的谷氨酸、在来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为340位的脯氨酸、在来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为340位的谷氨酸、在来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为336位的赖氨酸、在来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为340位的谷氨酸、在来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为338位的谷氨酸、在来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为340位的谷氨酸。

此外，“与序列号1记载的氨基酸序列的129位的天冬氨酸对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号1表示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较时，与序列号1的阿马多里酶的129位的天冬氨酸对应的氨基酸。这个也可以通过用上述的方法对齐氨基酸序列的图1-1来确定。

即，在来自土正青霉的阿马多里酶中为129位的谷氨酸、在来自棘壳孢菌属的酮胺氧化酶中为129位的天冬氨酸、在来自节菱孢菌属的酮胺氧化酶中为129位的天冬氨酸、在来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为129位的天冬氨酸、在来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为129位的天冬氨酸、在来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为129位的丝氨酸、在来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为127位的天冬氨酸、在来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为128位的谷氨酸、在来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为129位的天冬氨酸、在来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为129位的谷氨酸。

此外，“与序列号1记载的氨基酸序列的132位的天冬氨酸对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号1表示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较时，与序列号1的阿马多里酶的132位的天冬氨酸对应的氨基酸。这个也可以通过用上述的方法对齐氨基酸序列的图1-1来确定。

即，在来自土正青霉的阿马多里酶中为132位的天冬氨酸、在来自棘壳孢菌属的酮胺氧化酶中为132位的天冬氨酸、在来自节菱孢菌属的酮胺氧化酶中为132位的天冬氨酸、在来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为132位的天冬氨酸、在来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为132位的谷氨酸、在来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为132位的天冬氨酸、在来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为130位的天冬氨酸、在来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为131位的天冬氨酸、在来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为132位的天冬氨酸、在来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为132位的天冬氨酸。

此外，“与序列号1记载的氨基酸序列的231位的谷氨酸对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号1表示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较时，与序列号1的阿马多里酶的231位的谷氨酸对应的氨基酸。这个也可以通过用上述的方法对齐氨基酸序列的图1-2来确定。

即，在来自土正青霉的阿马多里酶中为231位的谷氨酸、在来自棘壳孢菌属的酮胺氧化酶中为229位的谷氨酸、在来自节菱孢菌属的酮胺氧化酶中为231位的谷氨酸、在来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为229位的谷氨酸、在来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为231位的谷氨酸、在来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为231位的谷氨酸、在来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为227位的组氨酸、在来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为231位的谷氨酸、在来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为229位的谷氨酰胺、在来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为231位的谷氨酸。

此外，“与序列号1记载的氨基酸序列的232位的天冬氨酸对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号1表示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较时，与序列号1的阿马多里酶的232位的天冬氨酸对应的氨基酸。这个也可以通过用上述的方法对齐氨基酸序列的图1-2来确定。

即，在来自土正青霉的阿马多里酶中为232位的天冬氨酸、在来自棘壳孢菌属的酮胺氧化酶中为230位的天冬氨酸、在来自节菱孢菌属的酮胺氧化酶中为232位的谷氨酸、在来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为230位的天冬氨酸、在来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为232位的谷氨酸、在来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为232位的甘氨酸、在来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为228位的谷氨酸、在来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为232位的谷氨酸、在来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为230位的天冬氨酸、在来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为232位的天冬氨酸。

此外，“与序列号1记载的氨基酸序列的249位的谷氨酸对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号1表示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较时，与序列号1的阿马多里酶的249位的谷氨酸对应的氨基酸。这个也可以通过用上述的方法对齐氨基酸序列的图1-2来确定。

即，在来自土正青霉的阿马多里酶中为249位的赖氨酸、在来自棘壳孢菌属的酮胺氧化酶中为247位的赖氨酸、在来自节菱孢菌属的酮胺氧化酶中为249位的组氨酸、在来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为247位的谷氨酸、在来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为249位的谷氨酸、在来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为249位的谷氨酸、在来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为245位的谷氨酸、在来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为249位的丙氨酸、在来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为247位的丝氨酸、在来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为249位的谷氨酰胺。

(本发明的阿马多里酶的生产)

使用具有如上所述得到的耐表面活性剂性优异的阿马多里酶的生产能力的菌株，生产该阿马多里酶时，可以用通常的固体培养法来培养该菌株，但优选尽量采用液体培养法进行培养。

另外，作为培养上述菌株的培养基，例如，使用如下得到的培养基，即，在酵母提取物、胰蛋白胨、蛋白胨、肉提取物、玉米浆或大豆或小麦麸的浸出液等1种以上的氮源中添加氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化镁、氯化铁、硫酸铁或硫酸锰等无机盐类的1种以上，根据需要进一步适当地添加糖原料、维生素等。

应予说明，培养基的初始pH优选调整为pH7～9。

另外，培养可以采用任意的条件，例如，通过通气搅拌深部培养、振荡培养、静置培养等在20～42℃的培养温度、优选为30℃左右的培养温度下实施4～24小时，进一步优选在30℃左右的培养温度实施8～16小时。

培养结束后，从该培养物采集阿马多里酶时，可以采用通常的酶采集手段获得。例如，可以利用常规方法将菌体进行超声波破坏处理、磨碎处理等，或者使用溶菌酶等溶菌酶提取该酶，或者在甲苯等存在下振荡或放置进行溶菌，使该酶向菌体外排出。然后，对该溶液进行过滤、离心分离等除去固体部分，根据需要利用链霉素硫酸盐、鱼精蛋白硫酸盐或硫酸锰等除去核酸后，向其中添加硫酸铵、醇、丙酮等进行分离，采集沉淀物，得到阿马多里酶的粗酶。

由上述阿马多里酶的粗酶进一步获得阿马多里酶纯化酶标准品时，例如，可以适当地选择使用葡聚糖凝胶、Superdex或Ultrogel等的凝胶过滤法；使用离子交换体的吸附溶出法；使用聚丙烯酰胺凝胶等的电泳法；使用羟基磷灰石的吸附溶出法；蔗糖密度梯度离心法等沉降法；亲和层析法；使用分子筛膜或中空丝膜等的分离法等，或者组合这些方法实施，由此得到纯化的阿马多里酶酶标准品。如此，能够得到所需的底物特异性改善的阿马多里酶。

(本发明中的表面活性剂)

作为本发明中的表面活性剂，只要为能够实施本发明的HbA1c的测定方法的表面活性剂就没有特别限制，可举出非离子性表面活性剂、离子性的表面活性剂，例如阳离子性表面活性剂、阴离子性表面活性剂、两性表面活性剂等，特别优选阳离子性表面活性剂、阴离子性表面活性剂。本说明书中提及表面活性剂时，只要没有特别说明，则该表达是指包括1种以上的表面活性剂。

本发明中的表面活性剂的临界胶束浓度(CMC)可为70mM以下、50mM以下、20mM以下、10mM以下、7mM以下、6mM以下、5mM以下、4.5mM以下、4mM以下、3.5mM以下、3mM以下、2.5mM以下、2mM以下、1.5mM以下、1.3mM以下、或1mM以下。在某实施方式中本发明的表面活性剂的临界胶束浓度可为0.1mM或0.01mM以上。优选临界胶束浓度为50mM以下，更优选为20mM以下，更优选为10mM以下，更优选为7mM以下，更优选为6mM以下，最优选为5mM以下。临界胶束浓度是指表面活性剂在溶液中形成胶束的临界浓度，在比其低的浓度不形成胶束。一般有临界胶束浓度低，低浓度的表面活性剂就形成胶束，作为表面活性剂的作用变强的趋势。本领域技术人员利用惯用手法而能够确定所需的表面活性剂的临界胶束浓度。例如可以使用利用与表面活性剂相互作用的荧光试剂的荧光变化来测定表面活性剂的临界胶束浓度的市售试剂盒等(例如PFP公司的洗涤剂临界胶束浓度测定试剂盒(DetergentCriticalMicelleConcentration(CMC)AssayKit)等)。

例如，辛基三甲基溴化铵(C8，OTAB)的CMC约为140mM，癸基三甲基氯化铵(C10)的CMC约为65mM，癸基三甲基溴化铵(C10)的CMC约为70mM，十二烷基三甲基氯化铵(C12)的CMC约为20mM，十二烷基三甲基溴化铵(C12，DTAB)的CMC约为16mM，十四烷基三甲基氯化铵(C14，TTAC)的CMC约为4.5mM，十四烷基三甲基溴化铵(C14，TTAB)的CMC约为5mM，十六烷基三甲基氯化铵(C16，CTAC)的CMC约为1.3mM，十六烷基三甲基溴化铵(C16)的CMC约为1mM，十八烷基三甲基氯化铵(C18，STAC)的CMC约为0.3mM，十八烷基三甲基溴化铵(C18，STAB)的CMC约为0.3mM(例如，参照J.PHYS.COLLIDE.CHEM.,52,130(1948)、J.PHYS.CHEM.,66,1839(1962)、J.AM.OIL.CHEMISTS.SOC.,30,74(1953)、J.PHARM.SCI.,54,436(1965)、KONINKI.NED.AKAD.WETEN.PROC.SERB,58,97(1955)、J.PHYS.CHEM.,65,1807(1961)、J.AM.CHEM.SOC.,65,692(1943)、J.AM.CHEM.SOC.,69,2095(1947)、J.COLLIDE.INTERFACE.SCI.,22,430(1966)、J.AM.CHEM.SOC.,70,3803(1948))。应予说明，括号内表示最长取代基的碳链数。

另外，例如，1-十二烷基溴化吡啶(C12)的CMC约为12mM，1-十二烷基氯化吡啶(C12，1-DPC)的CMC约为14mM，1-十四烷基溴化吡啶(C14)的CMC约为2.9mM，1-十六烷基氯化吡啶(C16，1-CPC)的CMC约为0.6mM，1-十六烷基溴化吡啶(C16，1-CPB)的CMC约为0.9mM，N-十六烷基-4-甲基氯化吡啶(C16，4Me-1-CPC)的CMC约为1.9mM，1-十八烷基溴化吡啶的CMC约为0.6mM，1-十八烷基氯化吡啶的CMC约为0.24mM(例如，参照J.COLLIDE.INTERFACE.SCI.,21,522(1966)、J.PHARM.SCI.,54,436(1965)、TRANS.FARADAY.SOC.,62,3244(1966)、J.AM.CHEM.SOC.,70,3803(1948)、REV.CHIM.AC.REP.POP.ROUM.,6,309(1961)、J.AM.CHEM.SOC.,70,3049(1948))。

另外，苄基十二烷基二甲基氯化铵的CMC约为2.8mM，苄基十四烷基二甲基氯化铵(C14，BDTAC)的CMC约为0.37mM，苄基十六烷基二甲基氯化铵(C16，BCDAC)的CMC约为0.042mM(例如，参照表面活性剂手册，131(1960)、J.COLLIDE.INTERFACE.SCI.,22,430(1966)、J.COLLIDE.SCI.,8,385(1953))。

作为非离子表面活性剂，例如可举出聚氧乙烯烷基醚、脂肪酸失水山梨醇酯、烷基聚葡糖苷、脂肪酸二乙醇酰胺、烷基单甘油醚等。

作为阳离子性表面活性剂，例如可举出烷基三甲基铵盐、二烷基二甲基铵盐、烷基苄基二甲基铵盐，吡啶盐、例如烷基吡啶盐，盐、例如烷基盐，咪唑盐、例如烷基咪唑盐，异喹啉盐、例如烷基异喹啉盐等。

另外，作为本发明的阳离子性表面活性剂，可举出以下的通式表示的季铵盐(I)、吡啶盐(II)、盐(III)。

[式中，R¹～R⁴可以相同或不同，表示取代或无取代的C₁～C₂₀烷基、烯基、芳基或苄基，Z^-表示1价的阴离子。]

[式中，R⁵表示取代或无取代的C₁～C₂₀烷基，各R^a可以相同或不同，表示氢原子或取代或无取代的C₁～C₂₀烷基、烯基、芳基或苄基，n表示1～5的整数，Z^-表示1价的阴离子。]

[式中，R⁶～R⁹可以相同或不同，表示取代或无取代的C₁～C₂₀烷基、烯基、芳基或苄基，Z^-表示1价的阴离子。]

作为季铵盐，例如可举出辛基三甲基氯化铵(OTAC)、辛基三甲基溴化铵(OTAB)、癸基三甲基氯化铵、癸基三甲基溴化铵(DTAB)、十二烷基三甲基氯化铵、十二烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基氯化铵(TTAC)、十四烷基三甲基溴化铵(TTAB)、十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)、十六烷基三甲基溴化铵、十八烷基三甲基氯化铵、十八烷基三甲基溴化铵(STAB)、二十烷基三甲基氯化铵、二十烷基三甲基溴化铵、苄基十二烷基二甲基氯化铵、苄基十二烷基二甲基溴化铵(BDDAB)、苄基十四烷基二甲基氯化铵(BDTAC)、苄基十四烷基二甲基溴化铵、苄基十六烷基二甲基氯化铵(BCDAC)、苄基十六烷基二甲基溴化铵、二辛基二甲基氯化铵以及二辛基二甲基溴化铵。

作为吡啶盐，例如可举出1-癸基氯化吡啶1-癸基溴化吡啶1-十二烷基氯化吡啶(1-DPC)、1-十二烷基溴化吡啶1-十四烷基氯化吡啶1-十四烷基溴化吡啶1-十六烷基氯化吡啶(1-CPC)、1-十六烷基溴化吡啶(1-CPB)、N-十六烷基-2-甲基氯化吡啶N-十六烷基-3-甲基氯化吡啶N-十六烷基-4-甲基氯化吡啶(4Me-1-CPC)、1-十八烷基氯化吡啶1-十八烷基溴化吡啶1-二十烷基氯化吡啶以及1-二十烷基溴化吡啶

作为盐，例如可举出四乙基氯化四乙基溴化三丁基甲基氯化三丁基甲基溴化三丁基甲基碘化四丁基氯化四丁基溴化四正辛基氯化四正辛基溴化三丁基十二烷基氯化三丁基十二烷基溴化三丁基十六烷基氯化三丁基十六烷基溴化(TBCPB)、甲基三苯基氯化甲基三苯基溴化甲基三苯基碘化四苯基氯化四苯基溴化

作为阳离子性表面活性剂的成对的阴离子Z^-，例如可为Cl^-、Br^-、I^-等。

作为阴离子性表面活性剂，例如可举出直链状烷基苯磺酸盐、烷基硫酸盐、α-烯烃磺酸盐、聚氧乙烯烷基醚硫酸盐，α-磺基脂肪酸酯盐和天然脂肪酸的碱金属盐等。作为这样的表面活性剂，例如可举出十二烷基硫酸钠(SDS)。

作为两性表面活性剂，例如可举出烷基二甲基氧化胺、烷基羧基甜菜碱等。

(本发明的包含阿马多里酶和表面活性剂的试剂盒)

本发明提供包含阿马多里酶和表面活性剂的糖化血红蛋白测定用试剂盒。表面活性剂可以为非离子性或离子性表面活性剂。另外，阿马多里酶和表面活性剂在试剂盒中可作为同一或独立的成分被含有。一般而言，阿马多里酶和表面活性剂作为同一成分被包含在试剂盒中时，优选以不使阿马多里酶失活的浓度含有表面活性剂。阿马多里酶和表面活性剂作为独立的成分被包含在试剂盒中时，表面活性剂可以使用比测定时的终浓度高的浓度的原液。将该原液适当地稀释而制备测定中使用的溶液。

本发明的包含阿马多里酶和表面活性剂的试剂盒可进一步包含αFVH测定用试剂、用于切出αFVH的蛋白酶或肽酶、其它公知的稳定剂、缓冲溶液。可以将用于测定αFVH的各种试剂盒中使用的技术适当地用于本发明的包含阿马多里酶和表面活性剂的试剂盒的制造。即本发明提供包括准备适当的阿马多里酶和表面活性剂的步骤的、包含阿马多里酶和表面活性剂的试剂盒的制造方法。此时，阿马多里酶和表面活性剂可以作为同一或独立的成分准备。试剂盒中阿马多里酶和表面活性剂作为独立的成分被提供时，这些成分可在即将测定αFVH之前被混合。

对于本发明的试剂盒所含的阿马多里酶而言，优选在添加将试剂盒所含的表面活性剂调节成终浓度的表面活性剂后的5分钟后的残留活性(％)与不添加的情况相比较，优选为13％以上，更优选为15％以上，最优选为19％以上，例如为20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上或99％以上。关于残留活性，下述进行说明。

对于本发明的试剂盒所含的阿马多里酶，作为测定时的终浓度，优选相对于表面活性剂0.01％(w/v)为110μg/ml以下，例如为100μg/ml以下、70μg/ml以下或者50μg/ml以下。另外，对于试剂盒所含的表面活性剂，作为测定时的终浓度，为0.01％(w/v)以上，例如为0.02％(w/v)以上、0.04％(w/v)以上、0.05％(w/v)以上、0.06％(w/v)以上、0.07％(w/v)以上、0.08％(w/v)以上、0.09％(w/v)以上、0.1％(w/v)以上、0.15％(w/v)以上、0.2％(w/v)以上、0.25％(w/v)以上或者0.3％(w/v)以上。这里，测定时的终浓度是指最终将成分稀释进行糖化血红蛋白测定时的浓度。因此在试剂盒中，可以使用比测定时的终浓度高的浓度的原液。

本发明的试剂盒所含的阿马多里酶可以为具有序列号1或序列号37表示的氨基酸序列的阿马多里酶或者基于它制作的耐表面活性剂性提高的变异体。该变异体可具有与序列号1或序列号37具有例如70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、97％以上或99％以上的序列同源性的氨基酸序列，或者可具有在序列号1或序列号37的氨基酸序列中改变或变异或者缺失、替换、添加和/或插入1个到多个氨基酸而成的氨基酸序列。

另外，本发明的试剂盒所含的阿马多里酶可以是来自正青霉属、棘壳孢菌属、节菱孢菌属、弯孢菌属、新赤壳菌属、隐球菌属、暗球腔菌属、曲霉属、翘孢霉属、细基格孢属、青霉属、镰刀菌属、锥毛毛壳属、毛毛壳属、梭孢壳属、毛壳属、五谷麻孢壳属、小囊菌属、小球腔菌属、蛇孢腔菌属、格孢腔菌属、闭毛孢壳属、毕赤酵母属、棒状杆菌属、土壤杆菌属、节杆菌属等的天然的阿马多里酶或它们的变异体。这样的变异体根据情况在与选自序列号1或3表示的氨基酸序列的262位的天冬酰胺、257位的缬氨酸、253位的谷氨酸、337位的谷氨酰胺、340位的谷氨酸、133位的谷氨酸、44位的谷氨酸、256位的甘氨酸、81位的谷氨酸、129位的天冬氨酸、132位的天冬氨酸、231位的谷氨酸、232位的天冬氨酸、249位的谷氨酸中的氨基酸对应的位置可具有1个或1个以上的氨基酸替换。本领域技术人员通过例如后述的试验法、实施例7的评价法等，能够容易地分析出某种阿马多里酶或其变异体是否能够用于本发明的试剂盒，即是否具有所需的耐表面活性剂性。

(缓冲剂)

本发明的试剂盒或组合物中，可以适当地添加在阿马多里酶的活性不失活的范围即pH5.0～pH10.0、优选为pH6.0～pH8.0的范围具有缓冲能力的缓冲剂或缓冲液。本说明书中提及缓冲剂时，只要没有特别说明，则该术语是指包含1种以上的缓冲剂。缓冲液是指具有将溶液的pH保持在一定范围的缓冲作用(缓冲能力)的溶液，缓冲剂是指对溶液赋予缓冲作用的物质。以弱酸为例，缓冲剂由弱酸及其盐构成，此时，将该盐称为共轭盐。例如缓冲剂由磷酸及其钾盐构成时，本说明书中由于作为基础的化合物为磷酸，所以为了方便，称为磷酸缓冲剂。某缓冲剂的浓度是指作为该缓冲剂的基础的化合物的单独形态与其共轭盐的形态合计的基础化合物的浓度。例如提及100mM的磷酸缓冲剂时，其是指以终浓度计溶液所含的磷酸及其共役盐(例如磷酸钾盐)合计的磷酸浓度为100mM。

各种缓冲剂(缓冲液)中，特别优选在表面活性剂存在下维持阿马多里酶的残留活性或减少残留活性的降低的缓冲剂。本说明书中有时将这样的优选的缓冲剂特别称为具有阿马多里酶稳定作用的缓冲剂或本发明的缓冲剂。例如HEPES即便以500mM(pH7.0)使用，对来自锥毛壳属的阿马多里酶(CFP-T7，序列号1)也不显示阿马多里酶稳定作用。因此HEPES不属于本发明的具有阿马多里酶稳定作用的缓冲剂。如此，并非所有的缓冲剂都具有阿马多里酶稳定作用。因此本发明的具有阿马多里酶稳定作用的缓冲剂不仅仅使溶液的pH保持在一定值，还具有在缓冲pH时使阿马多里酶稳定的作用。这里，本发明的缓冲剂提及的阿马多里酶稳定作用是指在表面活性剂存在下维持阿马多里酶的残留活性或减少残留活性的降低的作用。这样的阿马多里酶稳定作用可以通过在表面活性剂存在下比较不追加缓冲剂的溶液或者使用了不具有本发明的阿马多里酶稳定作用的缓冲剂的溶液的残留阿马多里酶活性与使用了本发明的缓冲剂的溶液的残留阿马多里酶活性来评价。

作为本发明的试剂盒(组合物)中可使用的缓冲剂(缓冲液)，例如可举出含有硼酸和/或其盐的硼酸缓冲剂、Tris盐酸缓冲剂、含有磷酸和/或其盐的磷酸缓冲剂、例如磷酸钾缓冲剂或磷酸钠缓冲剂、含有有机酸缓冲剂和/或其盐的有机酸缓冲剂、例如含有三羧酸缓冲剂和/或其盐的三羧酸缓冲剂、例如含有柠檬酸和/或其盐的柠檬酸缓冲剂、含有单羧酸缓冲剂和/或其盐的单羧酸缓冲剂、例如含有乙酸缓冲剂和/或其盐的乙酸缓冲剂等缓冲剂。另外，作为可用于本发明的试剂盒等的缓冲剂，可举出含有ACES(N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸)、BES(N,N-双(2-羟基乙基)-2-氨基乙磺酸)、Bicin(N,N-双(2-羟基乙基)甘氨酸)、Bis-Tris(双(2-羟基乙基)亚氨基三(羟基甲基)甲烷)、CHES(N-环己基-2-氨基乙磺酸)、EPPS(4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪丙磺酸)、HEPES(4-2-羟基乙基-1-哌嗪乙磺酸)、HEPPSO(N-(羟基乙基)哌嗪-N’-2-羟基丙磺酸)、MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)、MOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)、MOPSO(2-羟基-3-吗啉代丙磺酸)、PIPES(哌嗪-N,N’-双(2-乙磺酸))、POPSO(哌嗪-1,4-双(2-羟基丙磺酸))、TAPS(N-三(羟基甲基)甲基-3-氨基丙磺酸)、TAPSO(3-[N-三(羟基甲基)甲基氨基]-2-羟基丙磺酸)、TES(N-三(羟基甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)、TRICINE(N-三(羟基甲基)甲基甘氨酸)和/或它们的盐等的Good’s缓冲剂。另外，还可举出含有以下的式(IV)的化合物和/或其盐的缓冲剂，

[式中，n可以为0、1、2或3，R¹⁰可各自独立地为H、OH、-CH₂OH或-COOH]。另外，还可举出含有邻苯二甲酸和/或其盐的邻苯二甲酸缓冲剂、含有马来酸和/或其盐的马来酸缓冲剂、含有富马酸和/或其盐的富马酸缓冲剂、含有戊二酸和/或其盐的戊二酸缓冲剂、含有柠康酸和/或其盐的柠康酸缓冲剂、含有中康酸和/或其盐的中康酸缓冲剂、含有丙二酸和/或其盐的丙二酸缓冲剂、含有酒石酸和/或其盐的酒石酸缓冲剂、含有琥珀酸和/或其盐的琥珀酸缓冲剂、含有己二酸和/或其盐的己二酸缓冲剂、含有苹果酸和/或其盐的苹果酸缓冲剂等以二羧酸为基础的缓冲剂。除HEPES和CHES以外，这些缓冲剂可为本发明的具有阿马多里酶稳定作用的缓冲剂。作为优选的本发明的具有阿马多里酶稳定作用的缓冲剂，可举出磷酸缓冲剂、ACES缓冲剂、柠檬酸缓冲剂、苹果酸缓冲剂、乙酸缓冲剂、马来酸缓冲剂、柠康酸缓冲剂、丙二酸缓冲剂、戊二酸缓冲剂、酒石酸缓冲剂以及式(IV)表示的缓冲剂，例如MES缓冲剂、MOPS缓冲剂和MOPSO缓冲剂，但并不限定于此。这些中可以仅使用1种，也可以使用2种以上。另外，可以将本发明的具有阿马多里酶稳定作用的缓冲剂与上述缓冲剂以外的物质(例如不具有阿马多里酶稳定作用的缓冲剂)组合使用。作为盐，可举出基础化合物的钠盐、钾盐、镁盐、钙盐和铵盐，但并不限定于此。

本发明的缓冲剂可以以适当的浓度在本发明的试剂盒或组合物中使用。通常，添加到本发明的试剂盒或组合物的本发明的缓冲剂的量可以基于测定溶液的终浓度计算。某实施方式中测定溶液中的本发明的缓冲剂的终浓度优选为对于缓冲该测定溶液会发生的pH变化充分的浓度。在其它的实施方式中，测定溶液中的本发明的缓冲剂的终浓度是使含有表面活性剂的溶液中的阿马多里酶的残留活性成为20％以上、优选为40％以上、优选为60％以上、优选为80％以上的浓度。本发明的缓冲剂的终浓度可为例如1mM以上、5mM以上、10mM以上、20mM以上，例如50mM以上、1M以下、500mM以下、400mM以下、300mM以下、200mM以下、100mM以下，例如1mM～1M、5mM～500mM、10mM～300mM，例如50mM～100mM。使用磷酸缓冲剂作为本发明的具有阿马多里酶稳定作用的缓冲剂时，其浓度可为50mM～500mM，例如50mM～300mM，优选为100mM～300mM。使用柠檬酸缓冲剂、苹果酸缓冲剂、马来酸、柠康酸缓冲剂、丙二酸缓冲剂、戊二酸缓冲剂、或酒石酸缓冲剂作为本发明的缓冲剂时，其浓度可为5mM～500mM，优选为10mM～200mM，例如10mM～100mM。使用式(IV)表示的缓冲剂例如MES缓冲剂、MOPS缓冲剂或MOPSO缓冲剂作为本发明的缓冲剂时，其浓度可为10mM～500mM，例如100mM～500mM、例如150mM～300mM。使用ACES缓冲剂作为本发明的缓冲剂时，其浓度可为200mM～1M，例如200mM～500mM。作为本发明的缓冲剂，可以组合多个缓冲剂。应予说明，在组合物中还添加有稳定剂时，组合物中使用的本发明的缓冲剂的量会根据该稳定剂的量发生变化。

(稳定剂)

本发明的试剂盒或组合物中，可以适当地添加维持在表面活性剂存在下的阿马多里酶的残留活性或减少残留活性的降低的稳定剂。本说明书中，稳定剂是指维持在表面活性剂存在下的阿马多里酶的残留活性或减少残留活性的降低的物质。本说明书中提及稳定剂时，只要没有特别说明，则该表达是指包含1种以上的稳定剂。作为本发明的试剂盒或组合物所含的稳定剂(稳定剂)，例如可举出磷酸、三羧酸(例如柠檬酸)、二羧酸(例如苹果酸、马来酸、柠康酸、丙二酸、戊二酸、酒石酸)、单羧酸(例如乙酸)、式(IV)表示的化合物(例如MES、MOPS、MOPSO)、硫酸铵、它们的盐和它们的任意组合。

本发明的稳定剂可以以适当的浓度在本发明的试剂盒或组合物中使用。通常，向本发明的试剂盒或组合物添加的稳定剂的量基于测定溶液的终浓度计算。在某实施方式中添加的稳定剂的量是使含有表面活性剂的溶液中的阿马多里酶的残留活性成为35％以上、37.5％以上、优选为40％以上、45％以上、50％以上、55％以上、优选为60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、优选为80％以上、85％以上、90％以上或95％以上的量。本发明的稳定剂例如可以测定溶液中的终浓度成为0.1mM～100mM、0.2mM～100mM、0.5mM～50mM、1mM～30mM、2mM～30mM、5mM～20mM或10mM～20mM的方式添加到试剂盒或组合物中。本发明的组合物中还添加有缓冲剂时，稳定剂的量会根据该缓冲剂的量发生变化。例如添加稳定剂时，为了防止pH的变化，可以适当地选择调整添加的缓冲剂的种类和量，可以适当地调整稳定剂的溶液的pH。

本发明的缓冲剂中，特别是磷酸缓冲剂、柠檬酸缓冲剂和MES缓冲剂以发挥将溶液的pH保持在一定值的缓冲能力的浓度，即磷酸缓冲剂例如为100mM、柠檬酸缓冲剂例如为50mM、MES缓冲剂例如为150mM进行使用时，观察到阿马多里酶稳定作用。然而，即便使用不显示阿马多里酶稳定作用的HEPES作为pH缓冲剂来将溶液的pH保持在一定范围，同时进一步减少添加到组合物中的磷酸和/或其钾盐、柠檬酸和/或其钠盐或者MES和/或其钠盐的浓度，也能观察到在表面活性剂存在下的阿马多里酶的残留活性的稳定。该稳定作用即便在比磷酸和/或其钾盐、柠檬酸和/或其钠盐以及MES和/或其钠盐有效发挥缓冲作用的浓度低的浓度，具体而言磷酸为5mM、柠檬酸为0.5mM、MES为20mM时也能观察到。由此确认磷酸和/或其钾盐、柠檬酸和/或其钠盐以及MES和/或其钠盐除具有作为本发明的缓冲剂的阿马多里酶稳定作用以外，另外还具有使阿马多里酶活性残留的稳定作用。为了与本发明的缓冲剂的阿马多里酶稳定作用进行区别，从方便角度考虑，有时将这样的作用称为本发明的稳定剂的阿马多里酶稳定作用。因此，磷酸和/或其钾盐、柠檬酸和/或其钠盐以及MES和/或其钠盐具有本发明的缓冲剂的阿马多里酶稳定作用，且具有本发明的稳定剂的阿马多里酶稳定作用。也就是说，磷酸和/或其钾盐、柠檬酸和/或其钠盐以及MES和/或其钠盐属于本发明的缓冲剂，另一方面还属于本发明的稳定剂。

另外，具有阿马多里酶稳定作用的马来酸、柠康酸、丙二酸、戊二酸、酒石酸、MOPS和MOPSO在比有效发挥缓冲作用的浓度低的浓度、即10mM或20mM时被观察到阿马多里酶稳定作用，但它们是在更高浓度(50mM、100mM、150mM等)下发挥缓冲作用的化合物。因此马来酸、柠康酸、丙二酸、戊二酸、酒石酸、MOPS、MOPSO、式(IV)表示的化合物也是属于本发明的缓冲剂，且还属于本发明的稳定剂。

本发明的试剂盒或组合物含有阿马多里酶、表面活性剂、稳定剂和/或缓冲剂时，它们可以以任意的顺序添加到试剂盒或组合物中。优选先向本发明的试剂盒或组合物中添加稳定剂和/或缓冲剂(含有它们时)，其后添加表面活性剂，由此能够减少阿马多里酶的残留活性的降低。

(本发明的阿马多里酶的耐表面活性剂性的提高)

通过如上所述的手段得到的本发明的阿马多里酶的特征在于通过基因修饰等使其氨基酸序列发生变异，结果与修饰前相比较耐表面活性剂性提高。具体而言，与修饰前的阿马多里酶的活性相比较，修饰阿马多里酶的特征在于，在本说明书中记载的活性测定方法和耐表面活性剂性评价方法中记载的反应条件下，进行规定的表面活性剂处理，例如，添加0.01％(w/v)的十六烷基三甲基氯化铵(以下，表示为“CTAC”)后，在30℃、5分钟后的残留活性(％)提高。这里，残留活性(％)是用百分比(％)表示将表面活性剂处理前的活性设为100时的表面活性剂处理后的活性的比例。应予说明，本说明书中用百分比记载表面活性剂的浓度时，只要没有特别说明，则其表示％(w/v)。

本发明的修饰阿马多里酶的残留活性(％)的提高程度没有限定，例如，对导入本发明变异前和后的阿马多里酶进行表面活性剂处理后的残留活性(％)优选为13％以上、更优选为15％以上、最优选为19％以上、例如20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上或99％以上的修饰阿马多里酶包含在本发明中。另外，在对导入本发明变异前和后的阿马多里酶进行表面活性剂处理后的残留活性(％)彼此的数值比较中为2％以上、优选为9％以上、最优选为19％以上、例如20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上或99％以上、残留活性提高的修饰阿马多里酶包含在本发明中。

在某实施方式中，如果对导入本发明变异前的阿马多里酶进行表面活性剂处理则有时活性完全消失。这样的情况下，想要观察导入本发明变异后的阿马多里酶的残留活性(％)的提高时，可以使用经过表面活性剂处理活性不会完全消失的作为基准的阿马多里酶，比较作为基准的阿马多里酶在表面活性剂处理后的残留活性与导入变异后的阿马多里酶在表面活性剂处理后的残留活性。

实际中，除测定时的温度条件以外，导入变异前的阿马多里酶的耐表面活性剂性的程度也会对相对的评价结果造成差异，所以仅比较残留活性(％)、残留活性比率数值的大小，难以评价各变异体的绝对的耐表面活性剂性。但是，通过沿用本发明中的实施例的条件，能够绝对地评价各变异体的耐表面活性剂性。另外，从使本发明的阿马多里酶的选拔容易的意图出发，通过选择导入变异前的阿马多里酶的残留活性(％)被非常低地算出的表面活性剂处理条件，一般而言，有较高地算出残留活性(％)的提高程度和残留活性比率的趋势。

例如，将本发明所包含的由大肠菌JM109(pKK223-3-CFP-T7/253K)株生产的本发明的阿马多里酶与0.01％的CTAC混合并在30℃经过5分钟时，作为导入本发明变异前的阿马多里酶的CFP-T7的残留活性为69.9％，与此相对，导入本发明变异后的阿马多里酶的残留活性超过72％。另外，将由大肠菌JM109(pKK223-3-CFP-D7)株生产的本发明的阿马多里酶与0.04％的CTAC混合并在30℃经过5分钟时，作为导入本发明变异前的阿马多里酶的CFP-D的残留活性为12.7％，与此相对，导入本发明变异后的阿马多里酶的残留活性超过15％。这样耐表面活性剂性提高的阿马多里酶使含有该酶的制品等的保存性显著提高，另外，提高HbA1c的蛋白酶分解效率，即便为了提高测定灵敏度而使用强的表面活性剂时也稳定，所以在工业上非常有利。

(阿马多里酶活性的测定方法)

作为阿马多里酶的活性的测定方法，可以使用各种方法，作为1个例子，以下对本发明中使用的阿马多里酶活性的测定方法进行说明。

(阿马多里酶活性的测定方法)

作为本发明中的阿马多里酶的酶活性的测定方法，可举出测定由酶反应生成的过氧化氢量的方法、测定由酶反应消耗的氧量的方法等作为主要的测定方法。以下，作为1个例子，示出测定过氧化氢量的方法。

以下，只要没有特别限定则本发明中的阿马多里酶的活性测定中使用果糖缬氨酸作为底物。应予说明，就酶效价而言，以果糖缬氨酸为底物测定时，将1分钟生成1μmol的过氧化氢的酶量定义为1U。果糖缬氨酸等糖化氨基酸和果糖基缬氨酰基组氨酸等糖化肽可以基于阪上等的方法合成、纯化(参照日本特开2001-95598号)。

A.试剂的制备

(1)试剂1：POD-4-AA溶液

将4.0kU的过氧化酶(KIKKOMAN公司制)和100mg的4-氨基安替比林(东京化成工业公司制)溶解于0.1M的磷酸钾缓冲液(pH7.0)，定容成1L。

(2)试剂2：TOOS溶液

将500mg的TOOS(N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)间甲基苯胺钠，同仁化学公司制)溶解于离子交换水，定容成100ml。

(3)试剂3：底物溶液(150mM，终浓度5mM)

将果糖缬氨酸417mg溶解于离子交换水，定容成10ml。

B.测定法

将2.7ml的试剂1、100μl的试剂2和100μl的试剂3混合，在37℃预备加热5分钟。其后，加入100μl酶液充分混合后，利用分光光度计(U-3010，HitachiHighTechnologies公司制)，测定555nm处的吸光度。测定值是555nm处的1分钟后～3分钟后的每1分钟的吸光度变化。应予说明，对照液除添加100μl的离子交换水代替100μl的试剂3以外与上述同样地制备。将在37℃、每1分钟生成的过氧化氢的微摩尔数设为酶液中的活性单位(U)，根据下述式算出。

活性(U/ml)＝{(ΔAs－ΔA0)×3.0×df}÷(39.2×0.5×0.1)

ΔAs：反应液每1分钟的吸光度变化

ΔA₀：对照液每1分钟的吸光度变化

39.2：反应生成的醌亚胺色素的毫摩尔吸光系数(mM^-1·cm^-1)

0.5：由1mol的过氧化氢生成的醌亚胺色素的摩尔数

df：稀释系数

(耐表面活性剂性测定方法)

用30mM的MES/21mMTris缓冲液(pH6.5)将阿马多里酶粗酶液或阿马多里酶纯化标准品稀释至约1.0U/ml，将CTAC(例如，东京化成工业公司制)以终浓度成为0.01％(w/v)或0.04％的方式添加后，在30℃加热5分钟。加热后，用含有0.15％的BSA的10mM的磷酸缓冲液(pH7.0)稀释2倍，使用上述的B.的方法测定表面活性剂处理前和表面活性剂处理后的样品的酶活性，求出将表面活性剂处理前的活性设为100时的表面活性剂处理后的活性的比例，即，残留活性(％)，评价耐表面活性剂性。

(缓冲剂评价方法)

在上述的耐表面活性剂性测定方法中，可以使用各种缓冲剂代替30mM的MES/21mMTris缓冲液进行阿马多里酶的残留活性的测定，由此评价缓冲剂对阿马多里酶活性残留的贡献。例如可以使用磷酸缓冲液(pH7.0)、柠檬酸缓冲液(pH6.0)、HEPES缓冲液(pH7.0)、ACES缓冲液(pH7.0)等代替30mM的MES/21mMTris缓冲液(pH6.5)。其它的条件和顺序可与上述的耐表面活性剂性测定方法相同。

(稳定剂评价方法)

在上述的耐表面活性剂性测定方法中，可以进一步添加各种稳定剂进行阿马多里酶的残留活性的测定，由此评价该稳定剂的作用。作为评价对象的稳定剂为也具有缓冲作用的化合物时，为了评价不依赖于该化合物的缓冲作用对阿马多里酶活性残留的贡献的阿马多里酶稳定作用，可以将不具有阿马多里酶稳定作用的缓冲剂以足够对溶液赋予缓冲能力的浓度来使用(例如将HEPES(pH7.0)以500mM使用)，同时将稳定剂以低浓度、即不足以对溶液赋予缓冲能力的低浓度来使用。足够对溶液赋予缓冲能力的浓度是指不发生由添加到该溶液的其它试剂引起的pH变动而将pH保持在一定的范围(例如pH5～10，pH6～8)的浓度。不足以对溶液赋予缓冲能力的浓度是指如果向该溶液添加其它试剂则发生pH变动而pH从一定范围脱离的浓度。这些浓度根据添加到溶液的其它试剂的种类和量而变化，但本领域技术人员利用惯用方法就能够适当地确定该浓度。其它的条件和步骤可与上述的耐表面活性剂性测定方法同样。

(并用作用)

为了评价并用本发明的缓冲剂和本发明的稳定剂时的阿马多里酶稳定作用，也可以向含有本发明的阿马多里酶和表面活性剂的溶液中边适当地调整浓度边添加稳定剂和缓冲剂，测定阿马多里酶的残留活性。其它的条件和步骤可与上述的耐表面活性剂性测定方法同样。

以下，通过实施例，对本发明进行更具体的说明。但是，本发明的技术范围不受这些例子限定。

[实施例1]

(耐表面活性剂性提高型变异)

(1)重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA的制备

将具有包含CFP-T7基因(序列号2)的重组体质粒的大肠菌JM109(pKK223-3-CFP-T7)株(参照国际公开2007/125779号)接种于2.5ml的LB-amp培养基[1％(W/V)BACTO胰蛋白胨、0.5％(W/V)蛋白胨、0.5％(W/V)NaCl、50μg/ml氨苄青霉素]，在37℃振荡培养20小时，得到培养物。

以7000rpm将该培养物离心分离5分钟进行集菌而得到菌体。接下来，使用QIAGENtip-100(Qiagen公司制)从该菌体提取重组体质粒pKK223-3-CFP-T7进行纯化，得到2.5μg重组体质粒pKK223-3-CFP-T7的DNA。

(2)重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA的部位特异性修饰操作

以得到的重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA为模板，使用序列号5、6的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东洋纺织公司制)，按以下的条件进行PCR反应。

即，加入10×KOD-Plus-缓冲液5μl、以dNTP成为各2mM的方式制备的dNTPs混合溶液5μl、25mM的MgSO₄溶液2μl、50ng作为模板的pKK223-3-CFP-T7DNA、上述合成寡核苷酸各15pmol、1Unit的KOD-Plus-，利用灭菌水使总量为50μl。使用热循环仪(Eppendorf公司制)，将制备的反应液在94℃下温育2分钟，接着，将“94℃，15秒”-“50℃、30秒”-“68℃、6分钟”的循环重复30次。

用1.0％琼脂糖凝胶使反应液的一部分进行电泳，确认了约6000bp的DNA被特异性地扩增。这样得到的DNA用限制性内切酶DpnI(NEWENGLANDBIOLABS公司制)处理，将残留的模板DNA切断后，对大肠菌JM109转化，展开于LB-amp琼脂培养基。将生长的菌落接种于LB-amp培养基进行振荡培养，用与上述(1)同样的方法分离质粒DNA。使用多毛细管DNA解析系统AppliedBiosystems3130xl型基因分析仪(LifeTechnologies公司制)确定编码该质粒中的阿马多里酶的DNA碱基序列，其结果，得到了编码序列号1记载的氨基酸序列的262位的天冬酰胺被替换成组氨酸的修饰型阿马多里酶的重组体质粒(pKK223-3-CFP-T7-262H)。

接着，为了将序列号1记载的氨基酸序列的257位的缬氨酸替换成半胱氨酸，以重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA为模板，使用序列号7、8的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东洋纺织公司制)，按与上述同样的条件进行PCR反应、大肠菌JM109的转化和生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果，得到了编码序列号1记载的氨基酸序列的257位的缬氨酸被替换成半胱氨酸的修饰型阿马多里酶的重组体质粒(pKK223-3-CFP-T7-257C)。

接着，为了将序列号1记载的氨基酸序列的257位的缬氨酸替换成丝氨酸，以重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA为模板，使用序列号8、9的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东洋纺织公司制)，按与上述同样的条件进行PCR反应、大肠菌JM109的转化和生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果，得到了编码序列号1记载的氨基酸序列的257位的缬氨酸被替换成丝氨酸的修饰型阿马多里酶的重组体质粒(pKK223-3-CFP-T7-257S)。

接着，为了将序列号1记载的氨基酸序列的257位的缬氨酸替换成苏氨酸，以重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA为模板，使用序列号8、10的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东洋纺织公司制)，按与上述同样的条件进行PCR反应、大肠菌JM109的转化和生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果，得到了编码序列号1记载的氨基酸序列的257位的缬氨酸被替换成苏氨酸的修饰型阿马多里酶的重组体质粒(pKK223-3-CFP-T7-257T)。

接着，为了将序列号1记载的氨基酸序列的253位的谷氨酸替换成赖氨酸，以重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA为模板，使用序列号11、12的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东洋纺织公司制)，按与上述同样的条件进行PCR反应、大肠菌JM109的转化和生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果，得到了编码序列号1记载的氨基酸序列的253位的谷氨酸被替换成赖氨酸的修饰型阿马多里酶的重组体质粒(pKK223-3-CFP-T7-253K)。

接着，为了将序列号1记载的氨基酸序列的253位的谷氨酸替换成精氨酸，以重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA为模板，使用序列号12、13的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东洋纺织公司制)，按与上述同样的条件进行PCR反应、大肠菌JM109的转化和生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果，得到了编码序列号1记载的氨基酸序列的253位的谷氨酸被替换成精氨酸的修饰型阿马多里酶的重组体质粒(pKK223-3-CFP-T7-253R)。

接着，为了将序列号1记载的氨基酸序列的337位的谷氨酰胺替换成赖氨酸，以重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA为模板，使用序列号14、15的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东洋纺织公司制)，按与上述同样的条件进行PCR反应、大肠菌JM109的转化和生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果，得到了编码序列号1记载的氨基酸序列的337位的谷氨酰胺被替换成赖氨酸的修饰型阿马多里酶的重组体质粒(pKK223-3-CFP-T7-337K)。

接着，为了将序列号1记载的氨基酸序列的340位的谷氨酸替换成脯氨酸，以重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA为模板，使用序列号16、17的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东洋纺织公司制)，按与上述同样的条件进行PCR反应、大肠菌JM109的转化和生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果，得到了编码序列号1记载的氨基酸序列的340位的谷氨酸被替换成脯氨酸的修饰型阿马多里酶的重组体质粒(pKK223-3-CFP-T7-340P)。

接着，为了将序列号1记载的氨基酸序列的133位的谷氨酸替换成丙氨酸，以重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA为模板，使用序列号18、19的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东洋纺织公司制)，按与上述同样的条件进行PCR反应、大肠菌JM109的转化和生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果，得到了编码序列号1记载的氨基酸序列的133位的谷氨酸被替换成丙氨酸的修饰型阿马多里酶的重组体质粒(pKK223-3-CFP-T7-133A)。

接着，为了将序列号1记载的氨基酸序列的133位的谷氨酸替换成甲硫氨酸，以重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA为模板，使用序列号19、20的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东洋纺织公司制)，按与上述同样的条件进行PCR反应、大肠菌JM109的转化和生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果，得到了编码序列号1记载的氨基酸序列的133位的谷氨酸被替换成甲硫氨酸的修饰型阿马多里酶的重组体质粒(pKK223-3-CFP-T7-133M)。

接着，为了将序列号1记载的氨基酸序列的133位的谷氨酸替换成赖氨酸，以重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA为模板，使用序列号19、21的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东洋纺织公司制)，按与上述同样的条件进行PCR反应、大肠菌JM109的转化和生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果，得到了编码序列号1记载的氨基酸序列的133位的谷氨酸被替换成赖氨酸的修饰型阿马多里酶的重组体质粒(pKK223-3-CFP-T7-133K)。

接着，为了将序列号1记载的氨基酸序列的44位的谷氨酸替换成脯氨酸，以重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA为模板，使用序列号22、23的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东洋纺织公司制)，按与上述同样的条件进行PCR反应、大肠菌JM109的转化和生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果，得到了编码序列号1记载的氨基酸序列的44位的谷氨酸被替换成脯氨酸的修饰型阿马多里酶的重组体质粒(pKK223-3-CFP-T7-44P)。

接着，为了将序列号1记载的氨基酸序列的256位的甘氨酸替换成赖氨酸，以重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA为模板，使用序列号8、24的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东洋纺织公司制)，按与上述同样的条件进行PCR反应、大肠菌JM109的转化和生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果，得到编码序列号1记载的氨基酸序列的256位的甘氨酸被替换成赖氨酸的修饰型阿马多里酶的重组体质粒(pKK223-3-CFP-T7-256K)。

接着，为了将序列号1记载的氨基酸序列的256位的甘氨酸替换成精氨酸，以重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA为模板，使用序列号8、25的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东洋纺织公司制)，按与上述同样的条件进行PCR反应、大肠菌JM109的转化和生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果，得到了编码序列号1记载的氨基酸序列的256位的甘氨酸被替换成精氨酸的修饰型阿马多里酶的重组体质粒(pKK223-3-CFP-T7-256R)。

接着，为了将序列号1记载的氨基酸序列的81位的谷氨酸替换成赖氨酸，以重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA为模板，使用序列号26、27的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东洋纺织公司制)，按与上述同样的条件进行PCR反应、大肠菌JM109的转化和生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果，得到了编码序列号1记载的氨基酸序列的81位的谷氨酸被替换成赖氨酸的修饰型阿马多里酶的重组体质粒(pKK223-3-CFP-T7-81K)。

接着，为了将序列号1记载的氨基酸序列的129位的天冬氨酸替换成赖氨酸，以重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA为模板，使用序列号46、47的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东洋纺织公司制)，按与上述同样的条件进行PCR反应、大肠菌JM109的转化和生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果，得到了编码序列号1记载的氨基酸序列的129位的天冬氨酸被替换成赖氨酸的修饰型阿马多里酶的重组体质粒(pKK223-3-CFP-T7-129K)。

接着，为了将序列号1记载的氨基酸序列的132位的天冬氨酸替换成赖氨酸，以重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA为模板，使用序列号19、48的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东洋纺织公司制)，按与上述同样的条件进行PCR反应、大肠菌JM109的转化和生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果，得到了编码序列号1记载的氨基酸序列的132位的天冬氨酸被替换成赖氨酸的修饰型阿马多里酶的重组体质粒(pKK223-3-CFP-T7-132K)。

接着，为了将序列号1记载的氨基酸序列的231位的谷氨酸替换成赖氨酸，以重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA为模板，使用序列号49、50的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东洋纺织公司制)，按与上述同样的条件进行PCR反应、大肠菌JM109的转化和生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果，得到了编码序列号1记载的氨基酸序列的231位的谷氨酸被替换成赖氨酸的修饰型阿马多里酶的重组体质粒(pKK223-3-CFP-T7-231K)。

接着，为了将序列号1记载的氨基酸序列的232位的天冬氨酸替换成赖氨酸，以重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA为模板，使用序列号50、51的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东洋纺织公司制)，按与上述同样的条件进行PCR反应、大肠菌JM109的转化和生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果，得到了编码序列号1记载的氨基酸序列的232位的天冬氨酸被替换成赖氨酸的修饰型阿马多里酶的重组体质粒(pKK223-3-CFP-T7-232K)。

接着，为了将序列号1记载的氨基酸序列的249位的谷氨酸替换成赖氨酸，以重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA为模板，使用序列号52、53的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东洋纺织公司制)，按与上述同样的条件进行PCR反应、大肠菌JM109的转化和生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果，得到了编码序列号1记载的氨基酸序列的249位的谷氨酸被替换成赖氨酸的修饰型阿马多里酶的重组体质粒(pKK223-3-CFP-T7-249K)。

(3)各种修饰型阿马多里酶的生产

将保持经过上述步骤得到的上述重组体质粒的各大肠菌JM109株在添加有0.1mM的IPTG的LB-amp培养基3ml中于30℃培养16小时。其后，用pH7.0的0.01M磷酸缓冲液清洗各菌体，并进行超声波粉碎，以15000rpm离心分离10分钟，制备各粗酶液1.5ml。

(4)各种修饰型阿马多里酶的耐表面活性剂性评价

以这样制备的各粗酶液为样品，使CTAC的终浓度为0.01％，根据上述的耐表面活性剂性测定法，进行各种修饰型阿马多里酶的耐表面活性剂性评价。将结果示于表1-1。应予说明，确认了即便将加热后的样品用BSA溶液稀释2倍后在30分钟后再次进行活性测定，活性值也没有变化。在表1-1中，CFP-T7表示来自大肠菌JM109(pKK223-3-CFP-T7)株的阿马多里酶。应予说明，本实施例中来自大肠菌JM109(pKK223-3-CFP-T7)株的阿马多里酶即CFP-T7为变异原酶，因此表中记载的“氨基酸变异”的记载中没有包含已经导入到CFP-T7的各种变异点。

表1-1：

如表1-1所示，在本实施例的条件下，CFP-T7的残留活性为69.9％。与此相对，通过部位特异性变异导入而得到的15个变异体，即，CFP-T7的262位的天冬酰胺变异成组氨酸、257位的缬氨酸变异成半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、253位的谷氨酸变异成赖氨酸、精氨酸、337位的谷氨酰胺变异成赖氨酸、340位的谷氨酸变异成脯氨酸、44位的谷氨酸变异成脯氨酸、133位的谷氨酸变异成丙氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、256位的甘氨酸变异成赖氨酸、精氨酸、81位的谷氨酸变异成赖氨酸、129位的天冬氨酸变异成赖氨酸、132位的天冬氨酸变异成赖氨酸、231位的谷氨酸变异成赖氨酸、232的天冬氨酸变异成赖氨酸或者249位的谷氨酸变异成赖氨酸的阿马多里酶中，残留活性均提高至72％以上，显著的酶提高至79％以上，更显著的酶提高至89％以上。因此，确认了这些各变异点是提高阿马多里酶的耐表面活性剂性的变异点。

应予说明，对CFP-T7的253位和256位进行向作为碱性氨基酸残基的赖氨酸的替换和向精氨酸的替换，发现耐表面活性剂性均有提高。因此认为对81位、129位、132位、133位、231位、232位、249位和337位进行向与赖氨酸同样为碱性氨基酸残基的精氨酸的替换，耐表面活性剂性也会提高。

(5)来自棒弯孢的CcFX

序列号37是来自棒弯孢的酮胺氧化酶(以下称为CcFX)的氨基酸序列(国际公开第2004/104203号)。通过利用作为常规方法的基因片段的PCR全合成将cDNA进行全合成而取得编码序列号37的氨基酸序列的基因(序列号55)(包含终止密码子TAA)。此时，在序列号55的5′末端、3′末端分别添加EcoRI位点和HindIII位点。另外，确认了由克隆的基因序列预料的氨基酸序列全长与图1的CcFX的序列一致。接着，为了使取得的序列号55的基因在大肠菌中表达，进行以下的步骤。首先，将上述全合成的基因用EcoRI位点和HindIII位点(TakaraBio公司制)的两种限制性内切酶处理，并插入到pKK-223-3载体(GEHealthcare公司制)的EcoRI-HindIII位点，由此取得重组体质粒pKK223-3-CcFX，按与上述同样的条件对大肠菌JM109株进行转化，得到大肠菌JM109(pKK223-3-CcFX)株。

接下来，向CcFX导入耐表面活性剂性提高变异。具体而言，在与来自锥毛壳属的阿马多里酶(CFP-T7)的129位、132位、133位、231位、232位、249位、253位、256位和337位对应的位置即CcFX的129位、132位、133位、229位、230位、247位、251位、254位和335位导入变异。

使用包含CcFX基因(序列号55)的重组体质粒作为初始质粒，对具有它的大肠菌JM109(pKK223-3-CcFX)株，与上述(1)和(2)中记载的步骤同样地制成各种变异体。用于变异导入的引物的序列如序列号56～74所示。接下来按照上述(3)中记载的步骤生产修饰型阿马多里酶。接着，根据(4)中记载的耐表面活性剂性测定方法，进行各种修饰型阿马多里酶的耐表面活性剂性评价，其中，关于表面活性剂处理条件，用20mM的磷酸钾缓冲液(pH7.0)稀释阿马多里酶，进行0.01％的CTAC的混合。将结果示于表1-2。应予说明，确认了即便用BSA溶液将加热后的样品稀释2倍后在30分钟后再次进行活性测定，活性值也没有变化。

表1-2

如表1-2所示，在本实施例的条件下，CcFX的残留活性为27.4％。与此相对，通过部位特异性变异导入而得到的12个变异体阿马多里酶中，残留活性均提高到34％以上，显著的酶提高到56％以上，更显著的酶提高到64％以上。

将这样对CFP-T7确认了提高耐表面活性剂性的变异导入到CcFX的对应的位置，结果确认了如上所述同样的耐表面活性剂性提高。因此，这些各变异导入的效果不限定于来自特定物种的阿马多里酶，通过向对应的位置导入变异，具有使各种阿马多里酶的耐表面活性剂性都提高的效果。

应予说明，来自锥毛壳属的阿马多里酶和来自棒弯孢的酮胺氧化酶具有约80％的氨基酸序列同源性。因此认为针对与来自锥毛壳属的阿马多里酶或来自棒弯孢的酮胺氧化酶具有80％以上的氨基酸序列同源性的来自其它物种的阿马多里酶，通过向与上述位置对应的位置导入变异也能够提高耐表面活性剂性。

另外，通过在CcFX的251位和335位进行向赖氨酸或精氨酸的替换，发现耐表面活性剂性提高。由此，认为在CcFX的81位、129位、132位、133位、229位、230位、247位、251、254和335位进行向作为碱性氨基酸残基的赖氨酸或精氨酸的替换也能提高耐表面活性剂性。另外其它的各种阿马多里酶也同样。

另外，通过在CFP-T7的133位进行向丙氨酸或甲硫氨酸的替换、在CcFX的133位进行向丙氨酸的替换，发现耐表面活性剂性提高。由此，认为在CFP-T7的133位和CcFX的133位进行向作为疏水性氨基酸残基的丙氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸的替换也能提高耐表面活性剂性。另外其它的各种阿马多里酶也同样。

应予说明，虽不局限于特定的理论，但认为本发明的变异体阿马多里酶变得有耐表面活性剂性的机制例如如下。即，认为通过将阿马多里酶的酸性氨基酸替换成疏水性氨基酸、碱性氨基酸，从而降低阿马多里酶与阳离子性表面活性剂的亲和性，使阿马多里酶免受表面活性剂的变性作用。特别是认为如果导入作为碱性氨基酸残基的赖氨酸或精氨酸，则碱性氨基酸残基与阳离子性表面活性剂相互排斥，使阿马多里酶进一步免受表面活性剂的变性作用。

本发明的这些变异点不仅作为单独变异有效，还期待通过与已知的各种公知的变异组合、或者将本发明的变异彼此组合而创造出具有实用上优点的变异体。

[实施例2]

(耐表面活性剂性提高型变异的累积)

基于实施例1中发现的耐表面活性剂性提高变异的见解，为了将它们组合使变异累积而取得耐表面活性剂性进一步提高的阿马多里酶，尝试了通过制作多重变异体(2重变异体、3重变异体、4重变异体、5重变异体、6重变异体、7重变异体)来进行耐表面活性剂性提高型变异的累积。

序列号3是导入了底物特异性改善型变异(E98A)和热稳定性提高型变异(F43Y，G184D，羧基末端的3个氨基酸残基缺失)的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列(以下，表述为“CFP-D”)，被序列号4的基因编码。以在pKK223-3载体中插入CFP-D基因的质粒DNA为模板，进行耐表面活性剂性提高型变异的累积。使用合成寡核苷酸(序列号5、6、7、16、17、18、19、23、28、29、30、31、32、33、46、47、50、51、52、54)、KOD-Plus-(东洋纺织公司制)，按与上述(2)同样的条件进行PCR反应、大肠菌JM109株的转化和生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。

由此得到：44位的谷氨酸被替换成脯氨酸的变异体，即pKK223-3-CFP-D1；44位的谷氨酸被替换成脯氨酸且340位的谷氨酸被替换成脯氨酸的二重变异体，即pKK223-3-CFP-D2；44位的谷氨酸被替换成脯氨酸、262位的天冬酰胺被替换成组氨酸、且340位的谷氨酸被替换成脯氨酸的三重变异体，即pKK223-3-CFP-D3；44位的谷氨酸被替换成脯氨酸、257位的缬氨酸被替换成半胱氨酸、262位的天冬酰胺被替换成组氨酸、且340位的谷氨酸被替换成脯氨酸的四重变异体，即pKK223-3-CFP-D4；44位的谷氨酸被替换成脯氨酸、257位的缬氨酸被替换成半胱氨酸、262位的天冬酰胺被替换成组氨酸、340位的谷氨酸被替换成脯氨酸、且232位的天冬氨酸被替换成赖氨酸的五重变异体，即pKK223-3-CFP-D4/232K；44位的谷氨酸被替换成脯氨酸、257位的缬氨酸被替换成半胱氨酸、262位的天冬酰胺被替换成组氨酸、340位的谷氨酸被替换成脯氨酸、且249位的谷氨酸被替换成赖氨酸的五重变异体，即pKK223-3-CFP-D4/249K；44位的谷氨酸被替换成脯氨酸、253位的谷氨酸被替换成赖氨酸、257位的缬氨酸被替换成半胱氨酸、262位的天冬酰胺被替换成组氨酸、且340位的谷氨酸被替换成脯氨酸的五重变异体，即pKK223-3-CFP-D5；44位的谷氨酸被替换成脯氨酸、253位的谷氨酸被替换成赖氨酸、257位的缬氨酸被替换成半胱氨酸、262位的天冬酰胺被替换成组氨酸、340位的谷氨酸被替换成脯氨酸、且129位的天冬氨酸被替换成赖氨酸的六重变异体，即pKK223-3-CFP-D5/129K；44位的谷氨酸被替换成脯氨酸、133位的谷氨酸被替换成丙氨酸、253位的谷氨酸被替换成赖氨酸、257位的缬氨酸被替换成半胱氨酸、262位的天冬酰胺被替换成组氨酸、且340位的谷氨酸被替换成脯氨酸的六重变异体，即pKK223-3-CFP-D6；44位的谷氨酸被替换成脯氨酸、133位的谷氨酸被替换成丙氨酸、253位的谷氨酸被替换成赖氨酸、257位的缬氨酸被替换成半胱氨酸、262位的天冬酰胺被替换成组氨酸、337位的谷氨酰胺被替换成赖氨酸、且340位的谷氨酸被替换成脯氨酸的七重变异体，即pKK223-3-CFP-D7。

然后，按与上述同样的条件对大肠菌JM109株进行转化，得到大肠菌JM109(pKK223-3-CFP-D)株、大肠菌JM109(pKK223-3-CFP-D1)株、大肠菌JM109(pKK223-3-CFP-D2)株、大肠菌JM109(pKK223-3-CFP-D3)株、大肠菌JM109(pKK223-3-CFP-D4)株、大肠菌JM109(pKK223-3-CFP-D4/232K)株、大肠菌JM109(pKK223-3-CFP-D4/249K)株、大肠菌JM109(pKK223-3-CFP-D5)株、大肠菌JM109(pKK223-3-CFP-D5/129K)株、大肠菌JM109(pKK223-3-CFP-D6)株、大肠菌JM109(pKK223-3-CFP-D7)株。

用上述的方法培养如上所述得到的具有修饰型阿马多里酶生产能力的大肠菌JM109(pKK223-3-CFP-T7)株、大肠菌JM109(pKK223-3-CFP-D)株、大肠菌JM109(pKK223-3-CFP-D1)株、大肠菌JM109(pKK223-3-CFP-D2)株、大肠菌JM109(pKK223-3-CFP-D3)株、大肠菌JM109(pKK223-3-CFP-D4)株、大肠菌JM109(pKK223-3-CFP-D4/232K)株、大肠菌JM109(pKK223-3-CFP-D4/249K)株、大肠菌JM109(pKK223-3-CFP-D5)株、大肠菌JM109(pKK223-3-CFP-D5/129K)株、大肠菌JM109(pKK223-3-CFP-D6)株、大肠菌JM109(pKK223-3-CFP-D7)株，制备各种修饰型阿马多里酶的粗酶液1.5ml。以得到的各粗酶液为样品，根据上述(4)中记载的耐表面活性剂性测定方法，进行各种修饰型阿马多里酶的耐表面活性剂性评价，其中，关于表面活性剂处理条件，变成更严格的条件、即混合0.04％的CTAC。将结果示于表2-1。应予说明，确认了即便用BSA溶液将加热后的样品稀释2倍后在30分钟后再次进行活性测定，活性值也没有变化。

表2-1

如表2-1所示，在本实施例的条件下，CFP-T7的残留活性仅为2.27％。确认了在这样苛刻的表面活性剂条件下，现有的阿马多里酶几乎失去了活性。

与此相对，将实施例1中确认了的各种单独变异进行组合而制成的各种多重变异体中，残留活性均显著提高。具体而言，44位的谷氨酸被替换成脯氨酸且340位的谷氨酸被替换成脯氨酸的二重变异体的残留活性为37.1％，与CFP-T7相比较提高了。进而，该变异中262位的天冬酰胺被替换成组氨酸的三重变异体的残留活性为51.4％，与CFP-T7相比较进一步提高。进而，该变异中257位的缬氨酸被替换成半胱氨酸的四重变异体的残留活性为60.7％，与CFP-T7相比较显著提高。进而，该变异中253位的谷氨酸被替换成赖氨酸的五重变异体的残留活性为95.6％，进而，该变异中133位的谷氨酸被替换成丙氨酸的六重变异体的残留活性为99.2％，进而，该变异中337位的谷氨酰胺被替换成赖氨酸的七重变异体的残留活性为100％，与CFP-T7相比较显著提高，几乎没有CTAC导致的阿马多里酶的失活。另外，上述四重变异体CFP-D4的232位的天冬氨酸被进一步替换成赖氨酸的五重变异体的残留活性为66.2％，上述四重变异体CFP-D4的249位的谷氨酸被进一步替换成赖氨酸的五重变异体的残留活性为91.0％，上述五重变异体CFP-D5的129位的天冬氨酸被进一步替换成赖氨酸的六重变异体的残留活性为98.1％，与CFP-T7相比较显著提高，几乎没有CTAC导致的阿马多里酶的失活。

并且，清楚了每次对CFP-D累积变异，得到的更多重的变异体的耐表面活性剂性阶梯性提高，通过将实施例1中确认的本发明的变异点适当地组合，能够制出具有更优异的耐表面活性剂性的阿马多里酶。

接下来，以在pKK223-3载体中插入CcFX基因的质粒DNA为模板，进行耐表面活性剂性提高型变异的累积。除使用CcFX基因代替CFP-D基因以外，步骤与上述同样地进行。使用合成寡核苷酸(序列号72、73)、KOD-Plus-(东洋纺织公司制)，按与上述(2)同样的条件进行PCR反应、大肠菌JM109株的转化和生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。

由此，得到132位的天冬氨酸被替换成赖氨酸、335位的苏氨酸被替换成赖氨酸的变异体，即pKK223-3-CcFX/132K/335K；133位的谷氨酸被替换成丙氨酸、335位的苏氨酸被替换成赖氨酸的变异体，即pKK223-3-CcFX/133A/335K；229位的谷氨酸被替换成赖氨酸、335位的苏氨酸被替换成赖氨酸的变异体，即pKK223-3-CcFX/229K/335K；以及251位的谷氨酸被替换成赖氨酸、335位的苏氨酸被替换成赖氨酸的变异体，即pKK223-3-CcFX/251K/335K。然后，按与上述同样的条件转化大肠菌JM109株，并用上述的方法培养转化株，制备各种修饰型阿马多里酶的粗酶液1.5ml。以得到的各粗酶液为样品，根据上述(4)中记载的耐表面活性剂性测定方法，进行各种修饰型阿马多里酶的耐表面活性剂性评价，其中，关于表面活性剂处理条件，用20mM的磷酸钾缓冲液(pH7.0)稀释阿马多里酶，进行0.01％的CTAC的混合。将结果示于表2-2。应予说明，确认了即便用BSA溶液将加热后的样品稀释2倍后在30分钟后再次进行活性测定，活性值也没有变化。

表2-2：

如表1-2、表2-2所示，在本实施例的条件下，CcFX的残留活性为27.4％，与此相对，组合实施例1中确认了的各种单独变异而制成的各种二重变异体中，残留活性均显著提高。另外确认了与表1-2的CcFX的单独变异体相比，CcFX的二重变异体的耐表面活性剂性提高，仍然是无论阿马多里酶的种类如何变异的效果均累积。

[实施例3-1]

(对表面活性剂TTAC的评价)

使用十四烷基三甲基氯化铵(以下，表述为“TTAC”)代替实施例2中使用的表面活性剂CTAC，评价CFP-D的稳定性。根据基于实施例1的耐表面活性剂性测定方法，进行各种修饰型阿马多里酶的耐表面活性剂性评价，其中，关于表面活性剂处理条件，用20mM的磷酸钾缓冲液(pH7.0)稀释阿马多里酶，进行0.04％的TTAC的混合。将结果示于表3-1。应予说明，确认了即便用BSA溶液将加热后的样品稀释2倍后在30分钟后再次进行活性测定，活性值也没有变化。

表3-1：

如表3-1所示，在本实施例的条件下，CFP-D的残留活性为29.2％。

与此相对，实施例2中制成的各种多重变异体中，残留活性均显著提高。具体而言，44位的谷氨酸被替换成脯氨酸且340位的谷氨酸被替换成脯氨酸的二重变异体的残留活性为69.9％，与CFP-D相比较提高了。进而，该变异中262位的天冬酰胺被替换成组氨酸的三重变异体的残留活性为85.3％，与CFP-D相比较进一步提高。进而，该变异中257位的缬氨酸被替换成半胱氨酸的四重变异体的残留活性为91.1％，与CFP-D相比较显著提高。进而，该变异中253位的谷氨酸被替换成赖氨酸的五重变异体的残留活性为94.9％，进而，该变异中133位的谷氨酸被替换成丙氨酸的六重变异体的残留活性为96.4％，进而，该变异中337位的谷氨酰胺被替换成赖氨酸的七重变异体的残留活性为100％，与CFP-D相比较显著提高，几乎没有TTAC导致的阿马多里酶的失活。

因此，可知这些氨基酸替换提高了阿马多里酶对TTAC的耐性。

[实施例3-2]

(CFP-T7、CFP-D2、CFP-D7的纯化)

使用实施例1、2中得到的CFP-T7、CFP-D2和CFP-D7的粗酶，使制备的粗酶液吸附于用20mM的磷酸钾缓冲液(pH8.0)平衡化的4ml的QSepharoseFastFlow树脂(GEHealthcare公司制)，接下来用80ml的上述缓冲液清洗树脂，接着用含有100mM的NaCl的20mM的磷酸钾缓冲液(pH8.0)使吸附于树脂的蛋白质溶出，回收显示阿马多里酶活性的组分。

将得到的显示阿马多里酶活性的组分用AmiconUltra-15,30KNMWL(Millipore公司制)浓缩。其后，在用含有150mM的NaCl的20mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)平衡化的HiLoad26/60Superdex200pg(GEHealthcare公司制)中上样，用上述缓冲液使其溶出，回收显示阿马多里酶活性的组分，得到野生型和修饰型阿马多里酶的纯化标准品。得到的纯化标准品通过基于SDS-PAGE的分析，确认了纯化至单一的条带。

(对各种表面活性剂的评价)

使用各种表面活性剂，评价如上所述得到的纯化酶CFP-T7、CFP-D2和CFP-D7的稳定性。根据基于实施例1的耐表面活性剂性测定方法，进行各种修饰型阿马多里酶的耐表面活性剂性评价，其中，关于表面活性剂处理条件，用20mM的磷酸钾缓冲液(pH7.0)稀释阿马多里酶，进行各种浓度的表面活性剂的混合。将结果示于表3-2。应予说明，确认了即便用BSA溶液将加热后的样品稀释2倍后在30分钟后再次进行活性测定，活性值也没有变化。

表3-2：

由表3-2可知，对于导入变异前的CFP-T7而言，除使用OTAB和OTAC作为表面活性剂的情况以外，大部分表面活性剂使活性大幅降低。与此相对，二重变异体CFP-D2对试验的全部种类的表面活性剂显示比CFP-T7优异的耐表面活性剂性。另外，七重变异体CFP-D7对试验的全部种类的表面活性剂也显示比CFP-T7优异的耐表面活性剂性，大部分情况下，与二重变异体CFP-D2相比耐表面活性剂性提高。

由表3-2可知使用碳链长度不同的OTAB(C8)、DTAB(C12)、TTAB(C14)、STAB(C18)作为表面活性剂时，D2和D7的耐表面活性剂性均提高。因此认为对于碳链C10的癸基三甲基溴化铵、碳链C16的十六烷基三甲基溴化铵等表面活性剂也是同样的。认为对于与这些溴化物盐对应的氯化物盐，即OTAC(C8)、TTAC(C14)、CTAC(C16)、和STAC(C18)也是同样的，本发明的阿马多里酶对碳链C10的癸基三甲基氯化铵、碳链C12的十二烷基三甲基氯化铵具有耐性。

另外，由表3-2可知无论相反离子(Z)为氯化物离子还是溴化物离子，D2和D7均显示了耐表面活性剂性。

另外，由表3-2可知D2和D7不仅对铵离子系的表面活性剂显示耐性，对吡啶离子系表面活性剂和离子系表面活性剂也显示了耐性，因此表明耐表面活性剂性是针对各种阳离子性表面活性剂的。

综上所述，证实了本发明的耐表面活性剂性阿马多里酶无论表面活性剂的相反离子的种类、链长以及阳离子性表面活性剂的基本结构如何，均具有广泛的耐表面活性剂性谱。

应予说明，使用的各种表面活性剂的名称和结构概括如下。

表3-3：

H表示氢原子，Bn表示苄基。

数字表示烷基的碳链长度。

[实施例4]

(对表面活性剂SDS的评价)

使用十二烷基硫酸钠(以下，表述为“SDS”)代替实施例2中使用的表面活性剂CTAC，评价CFP-D的稳定性。根据基于实施例1的耐表面活性剂性测定方法，进行各种修饰型阿马多里酶的耐表面活性剂性评价，其中，关于表面活性剂处理条件，用30mM的MES/21mMTris缓冲液(pH6.5)稀释阿马多里酶，进行0.04％的SDS的混合。将结果示于表4。应予说明，确认了即便用BSA溶液将加热后的样品稀释2倍后在30分钟后再次进行活性测定，活性值也没有变化。

表4：

如表4所示，在本实施例的条件下，CFP-T7的残留活性为2.76％。

与此相对，实施例2中制成的各种多重变异体中，残留活性均显著提高。具体而言，44位的谷氨酸被替换成脯氨酸且340位的谷氨酸被替换成脯氨酸的二重变异体的残留活性为19.2％，与CFP-T7相比较提高了。进而，该变异中262位的天冬酰胺被替换成组氨酸的三重变异体的残留活性为11.3％，与CFP-T7相比较提高了。进而，该变异中257位的缬氨酸被替换成半胱氨酸的四重变异体的残留活性为17.1％，与CFP-T7相比较提高了。进而，该变异中253位的谷氨酸被替换成赖氨酸的五重变异体的残留活性为5.07％，进而，该变异中133位的谷氨酸被替换成丙氨酸的六重变异体的残留活性为3.62％，进而，该变异中337位的谷氨酰胺被替换成赖氨酸的七重变异体的残留活性为3.92％，与CFP-T7相比较提高了。

因此，可知这些氨基酸替换提高了阿马多里酶对SDS的耐性。

[实施例5](表面活性剂混合下的果糖基肽试样的测定)

使用实施例3-2中得到的CFP-T7和CFP-D7纯化酶，实施下述示出的试样的测定。应予说明，CFP-T7和CFP-D7的活性值是根据阿马多里酶活性的测定方法中记载的方法，将终浓度为5mM的αFVH作为底物，使用调整至pH7.0的(试剂1)确定的。

(11)果糖基肽试样的制备

(试剂4)将αFVH125mg溶解于离子交换水，定容成10ml，由此得到底物溶液30mM。进一步用CTAC溶液稀释714倍，由此得到42μM的αFVH/0％～0.2％的CTAC溶液。

(12)果糖基肽试样的测定

(试剂5)

0.21mM的DA-64(N-(羧甲基氨基羰基)-4,4’-双(二甲基氨基)二苯胺钠，和光纯药工业公司制)

20mM的磷酸钾缓冲液(pH7.0)

(试剂6)

6.7U/ml的CFP-T7或者CFP-D7

19U/ml的过氧化酶(KIKKOMAN公司制)

20mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)

向预先在37℃加热5分钟的135μl的(试剂5)和上述(11)中制备的25μl的试样的混合溶液添加50μl的(试剂6)开始反应，用自动分析装置BioMajestyJCA‐BM1650(日本电子)测定在37℃反应5分钟后的波长751nm处的吸光度。对使用离子交换水代替底物溶液而制成的(试剂4)也同样进行操作，将测定的波长751nm处的吸光度(空白试剂)作为对照，通过下述式，算出测定各试样时的吸光度变化量(差)。发色底物DA-64的终浓度为0.15mM，有底物时αFVH的终浓度为5μM，吸光度测定中使用的比色杯(セル)的长度(光路)为1cm。

吸光度变化量＝ΔAes－Ae0

ΔAes：从反应开始经过5分钟后的吸光度

ΔAe0：添加对照液时从反应开始经过5分钟后的吸光度

算出以αFVH/0％～0.2％CTAC为试样时的吸光度变化量。将结果示于表5。

表5：

各CTAC浓度混合下的波长751nm处的吸光度变化量

如表5所示，在本实施例的条件下，在0％的CTAC混合下，CFP-T7的吸光度变化量为0.150，在0.005％的CTAC混合下，CFP-T7的吸光度变化量为0.111。进而，在0.01％的CTAC混合下，CFP-T7的吸光度变化量为0.077，在0.02％的CTAC混合下，CFP-T7的吸光度变化量为0.031，在0.04％的CTAC混合下，CFP-T7的吸光度变化量减少至0.005，可知CTAC浓度越高，吸光度变化量越小。

与此相对，对于CFP-D7而言，在0.02％的CTAC混合下，CFP-D7的吸光度变化量为0.140，在0.2％的CTAC混合下，CFP-D7的吸光度变化量为0.069。即，CFP-T7与CTAC混合，吸光度变化量减少，与此相对，CFP-D7抑制吸光后变化量的减少，且在0.1％以上的CTAC存在下吸光度变化量变得恒定。另外，在小于作为CTAC的临界胶束浓度的1.3mM(0.04％)时吸光度变化量的减少幅度大，但在临界胶束浓度以上的浓度，对阿马多里酶造成的影响的变化变小。因此，可知在高浓度的CTAC混合下，CFP-D7稳定存在，能够测定αFVH。

[实施例6]

(表面活性剂混合下的果糖基肽试样的定量)

使用CFP-T7和CFP-D7纯化酶，在CTAC混合下，在0.5～3μM的范围比较αFVH测定值的线性。CFP-T7在混合0.01％或0.02％的CTAC，进一步使用4.2μM、8.4μM、13μM、17μM、21μM或25μM的αFVH，即终浓度为0.5μM、1.0μM、1.5μM、2.0μM、2.5μM或3.0μM的αFVH的条件下，与实施例5同样地测定吸光度变化量，算出相关系数。同样地，CFP-D7在混合0.02％或0.2％的CTAC，使用与上述同样的αFVH的条件下，与实施例5同样地测定吸光度变化量，算出相关系数。将其结果示于表6，将各相关数据示于图2、3、4、5。图2是在0.01％的CTAC的混合下使用CFP-T7测定αFVH的结果，图3是在0.02％的CTAC的混合下使用CFP-T7测定αFVH的结果，图4是在0.02％的CTAC的混合下使用CFP-D7测定αFVH的结果，图5是在0.2％的CTAC的混合下使用CFP-D7测定αFVH的结果。

表6：

各CTAC浓度混合下的相关系数

如表6所示，在本实施例的条件下，在0.01％的CTAC混合下，使用CFP-T7得到的0.5μM～3.0μM的αFVH的相关系数高达0.924，但在0.02％的CTAC混合下，变成低至0.625的相关系数。与此相对，如果使用CFP-D7，则即便在0.2％的CTAC混合下，0.5μM～3.0μM的αFVH的相关系数也显示了高达0.965的线性。

另外，根据作为酶法的HbA1c测定试剂盒的CinQHbA1c(ARKRAY公司制)的说明书，使全血检体以稀释416倍的状态与阿马多里酶反应。例如，NGSP值中的HbA1c值为6.5％，另外，Hb总浓度为141～150g/l，将血液试样稀释416倍测定时，用蛋白酶切出的αFVH的浓度为0.50～0.53μM。实际的糖尿病诊断的HbA1c值的边界值以NGSP值计为6.5％。因此，可以说CFP-D7在实际的HbA1c测定中能够充分利用，另外，通过并用强的表面活性剂，例如CTAC，能够提高测定灵敏度。

[实施例7]

(各种阿马多里酶的耐表面活性剂性的评价)

为了提供含有在表面活性剂、优选离子性表面活性剂的存在下也残留有活性的阿马多里酶的糖化血红蛋白测定用组合物，如上所述通过修饰来自锥毛壳属的阿马多里酶来提高耐表面活性剂性。另外，不知道来自锥毛壳属的阿马多里酶以外的阿马多里酶在离子性表面活性剂存在下是否能够测定HbA1c。因此，将来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶和来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶与离子性表面活性剂组合，尝试测定αFVH。

1.来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶的生产·纯化

序列号40是来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶(以下称为PnFX)的氨基酸序列(参照BiotechnologyandBioengineering,106,358-366,2010)。通过利用作为常规方法的基因片段的PCR全合成将cDNA进行全合成而取得编码序列号40的氨基酸序列的基因(序列号44)。此时，在序列号40的5′末端、3′末端分别添加NdeI位点和BamHI位点。另外，确认了由克隆的基因序列预料的氨基酸序列全长与图1的PnFX的序列一致。接着，为了使取得的序列号44的基因在大肠菌中表达，进行以下的步骤。首先，将上述全合成的基因用NdeI位点和BamHI(TakaraBio公司制)的两种限制性内切酶处理，并插入到pET-22b(+)载体(Novagen公司制)的NdeI-BamHI位点，由此取得重组体质粒pET22b-PnFX，按与上述同样的条件转化大肠菌BL21(DE3)株，得到大肠菌BL21(DE3)(pET22b-PnFX)株。

将如上所述得到的具有PnFX生产能力的大肠菌BL21(DE3)(pET22b-PnFX)株接种于以终浓度成为0.1mM的方式添加有IPTG的LB-amp培养基，在25℃培养16小时。用10mM的磷酸钾缓冲液(pH8.0)清洗得到的各培养菌体后，使菌体在该缓冲液中悬浮，并进行超声波粉碎处理，以20000×g离心分离10分钟，制备粗酶液。

将制备的PnFX的粗酶液按照上述的非专利文献(BiotechnologyandBioengineering,106,358-366,2010)记载的方法进行纯化。即，利用硫酸铵分离粗酶液，用10mM的磷酸钾缓冲液(pH8.0)透析，利用阴离子交换色谱(本实施例中使用QSepharoseFastFlow)进行纯化，再利用凝胶过滤色谱(本实施例中使用HiLoad26/600Sueprdex200)进行纯化。将得到的组分用SDS-PAGE分析，确认纯化至不含有其它杂蛋白质的纯度，制成PnFX的纯化标准品。

2.来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶的生产·纯化

序列号38是来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶(NvFX)的氨基酸序列，通过使插入了编码序列号38的氨基酸序列的基因(序列号45)的重组体质粒pET22b-NvFX在大肠菌中表达，确认了NvFX的活性(参照国际公开第2012/18094号)。与实施例1同样地转换大肠菌BL21(DE3)株，使用得到的大肠菌BL21(DE3)(pET22b-NvFX)株并用上述的方法培养，制备NvFX的粗酶液。

使制备的粗酶液吸附于用10mM的磷酸钾缓冲液(pH8.0)平衡化的QSepharoseFastFlow树脂(GEHealthcare公司制)，接下来用含有20mMNaCl的10mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)清洗树脂，接着用含有300mMNaCl的10mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)使吸附于树脂的NvFX溶出并回收。

将得到的含有NvFX的粗酶液上样于用含有150mMNaCl的20mMMES-NaOH缓冲液(pH7.0)平衡化的HiLoad26/600Superdex200柱，并用上述缓冲液使NvFX溶出，回收显示果糖基氨基酸氧化酶活性(阿马多里酶活性)的组分。将得到的组分利用SDS-PAGE分析，确认纯化至不含有其它杂蛋白质的纯度，制成NvFX的纯化标准品。

以如上所述得到的各种阿马多里酶纯化标准品为样品，与实施例5同样地使用PnFX和NvFX进行CTAC混合下的αFVH的测定。将结果示于表7。

表7：

各CTAC浓度混合下的波长751nm处的吸光度变化量

如表7所示，在本实施例的条件下，在0％的CTAC混合下，PnFX的吸光度变化量为0.173，在0.01％的CTAC混合下，吸光度变化量为0.115。另外，在0.02％的CTAC混合下，PnFX的吸光度变化量为0.084，与此相对，CFP-T7的吸光度变化量为0.031，在0.04％的CTAC混合下，PnFX的吸光度变化量为0.026，与此相对，CFP-T7的吸光度变化量为0.005。即，可以说PnFX在0.02％以上这样的高浓度的CTAC的混合下，能够测定作为底物的αFVH。

对于NvFX，在低于0.02％的CTAC混合下，吸光度增加，但在受产生混浊的影响而使用离子交换水代替底物的空白试验中吸光度也增加，无法正确地测定αFVH。

[实施例8]

(各种缓冲剂存在下的阿马多里酶的耐表面活性剂性评价)

研究了使用30mM的MES/21mMTris缓冲剂(pH6.5)以外的缓冲剂时，阿马多里酶的耐表面活性剂性是否提高。以如上所述纯化的CFP-T7为样品，使CTAC的终浓度为0.01％，代替30mM的MES/21mMTris缓冲剂(pH6.5)，在各种缓冲剂具体而言在含有磷酸和磷酸钾的磷酸缓冲剂(pH7.0)、含有柠檬酸和柠檬酸钠的柠檬酸缓冲剂(pH6.0)、含有MES及其钠盐的MES缓冲剂(pH7.0)、含有HEPES及其钠盐的HEPES缓冲剂(pH7.0)、含有ACES及其钠盐的ACES缓冲剂(pH7.0)的存在下，根据实施例1的耐表面活性剂性测定法，进行CFP-T7的耐表面活性剂性评价。将结果示于表8。应予说明，确认了即便用BSA溶液将加热后的样品稀释2倍后在30分钟后再次进行活性测定，活性值也没有变化。

表8：

如表8所示，可知在本实施例的条件下，在磷酸缓冲剂、MES缓冲剂、ACES缓冲剂的存在下，CFP-T7的耐表面活性剂性是缓冲剂浓度依赖性地提高。在柠檬酸缓冲剂下，即便为10mM也没有发现表面活性剂导致的失活，特别有用。没有发现HEPES缓冲剂使阿马多里酶活性残留的效果。由此，意想不到地表明了磷酸缓冲剂、柠檬酸缓冲剂、MES缓冲剂、ACES缓冲剂具有提高阿马多里酶对表面活性剂的耐性的效果。

[实施例9]

(添加各稳定剂时的阿马多里酶的耐表面活性剂性评价)

研究了添加各种稳定剂时，阿马多里酶的耐表面活性剂性是否提高。作为稳定剂，使用磷酸、三羧酸(例如柠檬酸)、二羧酸(例如苹果酸、马来酸、柠康酸、丙二酸、戊二酸、酒石酸)、单羧酸(例如乙酸)、MES、MOPS、MOPSO、硫酸铵。另外，作为比较例，使用了CHES。添加稳定剂时，为了防止pH的变化，缓冲液使用500mM的HEPES(pH7.0)，以如上所述纯化的CFP-T7为样品，使CTAC的终浓度为0.01％，进一步添加各种稳定剂，根据实施例1的耐表面活性剂性测定法，进行CFP-T7的耐表面活性剂性评价。将结果示于表9-1、9-2。另外，使用500mM的HEPES(pH7.0)缓冲剂，以如上所述纯化的CFP-D2为样品，进一步添加各种稳定剂，根据实施例1的耐表面活性剂性测定法，进行CFP-D2的耐表面活性剂性评价，其中，关于表面活性剂处理条件，使CTAC的终浓度为0.08％，处理温度为37℃，设定成更苛刻的条件。将结果示于表9-3。实际添加稳定剂时，确认了pH实际显示7.0。应予说明，确认了即便用BSA溶液将加热后的样品稀释2倍后在30分钟后再次进行活性测定，活性值也没有变化。

表9-1：

表9-2：

表9-3：

稳定剂浓度CFP-D2残留活性(％)无-9.4磷酸5mM72.8苹果酸5mM59.2MOPS20mM42.4

如表9-1、9-2所示，可知在本实施例的条件下，添加磷酸、柠檬酸、苹果酸、马来酸、柠康酸、丙二酸、戊二酸、酒石酸、乙酸、MES、MOPS、MOPSO、硫酸铵作为稳定剂时，CFP-T7的耐表面活性剂性是稳定剂浓度依赖性地提高。特别是即便添加0.2mM极微量的柠檬酸时也能够提高CFP-T7的耐表面活性剂性。另外，如表9-3所示，如果添加磷酸、苹果酸、MOPS作为稳定剂，则与不存在稳定剂的情况相比，CFP-D2纯化酶的耐表面活性剂性显著提高。利用各种化合物能够提高阿马多里酶对表面活性剂的稳定性这点不是公知的，是意想不到的。特别是具有以下结构的CHES不具有稳定作用，

但与此相对，意想不到的是与其结构非常类似的式(IV)中包含的MES(n＝1，R¹⁰为H)、MOPS(n＝2，R¹⁰均为H)、MOPSO(n＝2，R¹⁰为OH和H)均显示了阿马多里酶稳定作用。

[式中，n可以为0、1、2或3，R¹⁰可各自独立地为H、OH、-CH₂OH或-COOH]。

由此，表明了磷酸、三羧酸、二羧酸、单羧酸、MES、MOPS、MOPSO等式(IV)表示的化合物以及硫酸铵具有提高阿马多里酶的耐表面活性剂性的效果。另外，对没有导入本发明变异的阿马多里酶CFP-T7和导入了本发明变异的阿马多里酶CFP-D2均观察到耐表面活性剂性的提高。

应予说明，综合表8和9-1的结果，可知本发明的稳定剂的阿马多里酶稳定作用是与本发明的缓冲剂的阿马多里酶稳定作用不同的作用。具体而言，由表8确认了使用MES作为本发明的缓冲剂时，在浓度50mM下CFP-T7阿马多里酶的残留活性为14.3％，在浓度100mM下上述残留活性为17.6％，在浓度150mM下上述残留活性为62.9％。与此相对，由表9确认了如果使用不具有阿马多里酶稳定作用的作为单纯的pH缓冲剂的HEPES(pH7.0)并使用MES作为本发明的稳定剂，则在MES的浓度10mM下CFP-T7阿马多里酶的残留活性为19.5％，在MES浓度20mM下上述残留活性为54.1％。即，即便在无法充分发挥缓冲能力的20mM这样的低浓度下MES也显示阿马多里酶稳定作用，确认到的阿马多里酶的残留活性意想不到地超过了以浓度100mM使用MES作为本发明的缓冲剂时的残留活性(表8，17.6％)。因此可知本发明的稳定剂的阿马多里酶稳定作用是与本发明的缓冲剂的阿马多里酶稳定作用不同的稳定作用。对于磷酸和柠檬酸也同样。另外，对于显示稳定作用的二羧酸、MOPS、MOPSO，由于它们也可以作为缓冲剂使用，所以认为也是同样的。

(添加各稳定剂时的PnFX的耐表面活性剂性评价)

研究了上述的稳定剂对来自锥毛壳属的阿马多里酶以外的阿马多里酶例如PnFX是否有耐表面活性剂性提高效果。稳定剂使用与上述同样的稳定剂，添加稳定剂时，为了防止pH的变化，缓冲液使用300mMHEPES(pH7.0)，以如上所述纯化的PnFX为样品，使CTAC的终浓度为0.04％，与上述同样地进行PnFX的耐表面活性剂性评价。实际添加稳定剂时，确认了pH实际显示7.0。将结果示于表10。应予说明，确认了即便用BSA溶液将加热后的样品稀释2倍后在30分钟后再次进行活性测定，活性值也没有变化。

表10：

稳定剂浓度PnFX残留活性(％）无-27.9磷酸5mM37.5柠檬酸0.5mM47.3苹果酸5mM60.4乙酸20mM42.6MES20mM89.6硫酸铵5mM53.0

如表10所示，在本实施例的条件下，与CFP-T7同样地对PnFX添加了磷酸、柠檬酸、苹果酸、乙酸、MES、硫酸铵时，也显示了耐表面活性剂性提高效果。因此，可以说磷酸、三羧酸、二羧酸、单羧酸、MES、硫酸铵作为使各种各样的阿马多里酶的耐表面活性剂性提高的稳定剂有用。CFP-T7与PnFX的氨基酸序列同源性为75％，因此可以说与CFP-T7具有75％氨基酸序列同源性的阿马多里酶具有上述的效果。

序列号1.CFP-T7的氨基酸序列

序列号2.CFP-T7的基因序列

序列号3.CFP-D的氨基酸序列

序列号4.CFP-D的基因序列

序列号5.导入N262H的引物Fw

序列号6.导入N262X的引物Rv

序列号7.导入V257C的引物Fw

序列号8.导入V257X的引物Rv

序列号9.导入V257S的引物Fw

序列号10.导入V257T的引物Fw

序列号11.导入E253K的引物Fw

序列号12.导入E253X的引物Rv

序列号13.导入E253R的引物Fw

序列号14.导入Q337K的引物Fw

序列号15.导入Q337X的引物Rv

序列号16.导入E340P的引物Fw

序列号17.导入E340X的引物Rv

序列号18.导入E133A的引物Fw

序列号19.导入E133X的引物Rv

序列号20.导入E133M的引物Fw

序列号21.导入E133K的引物Fw

序列号22.导入E44P的引物Fw

序列号23.导入E44X的引物Rv

序列号24.导入G256K的引物Fw

序列号25.导入G256R的引物Fw

序列号26.导入E81K的引物Fw

序列号27.导入E81X的引物Rv

序列号28.导入F43Y/E44P的引物Fw

序列号29.导入V257X/N262H的引物Rv

序列号30.导入E253K/V257C的引物Fw

序列号31.导入E253X/V257C/N262H的引物Rv

序列号32.导入Q337K/E340P的引物Fw

序列号33.导入Q337X/E340P的引物Rv

序列号34.来自土正青霉的阿马多里酶

序列号35.来自棘壳孢菌属的酮胺氧化酶

序列号36.来自节菱孢菌属的酮胺氧化酶

序列号37.来自棒弯孢的酮胺氧化酶

序列号38.来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶

序列号39.来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶

序列号40.来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶

序列号41.来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶

序列号42.来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶

序列号43.来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶

序列号44.来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶的基因

序列号45.来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶的基因

序列号46.导入D129K的引物Fw

序列号47.导入D129K的引物Rv

序列号48.导入D132K的引物Fw

序列号49.导入E231K的引物Fw

序列号50.导入E231X的引物Rv

序列号51.导入D232K的引物Fw

序列号52.导入E249K的引物Fw

序列号53.导入E249K的引物Rv

序列号54.导入E249K/V257C的引物Rv

序列号55.来自棒弯孢的酮胺氧化酶的基因

序列号56.CcFX的导入D129K的引物Fw

序列号57.CcFX的导入D129K的引物Rv

序列号58.CcFX的导入D132K的引物Fw

序列号59.CcFX的导入E133K的引物Fw

序列号60.CcFX的导入E133A的引物Fw

序列号61.CcFX的导入E133X的引物Rv

序列号62.CcFX的导入E229K的引物Fw

序列号63.CcFX的导入D230K的引物Fw

序列号64.CcFX的导入D230X的引物Rv

序列号65.CcFX的导入E247K的引物Fw

序列号66.CcFX的导入E247K的引物Rv

序列号67.CcFX的导入E251K的引物Fw

序列号68.CcFX的导入E251X的引物Rv

序列号69.CcFX的导入E251R的引物Fw

序列号70.CcFX的导入N254K的引物Fw

序列号71.CcFX的导入N254K的引物Rv

序列号72.CcFX的导入T335K的引物Fw

序列号73.CcFX的导入T335X的引物Rv

序列号74.CcFX的导入T335R的引物Fw

将本说明书中引用的全部刊物、专利和专利申请直接作为参考引入本说明书中。