一种检测微生物细胞中脂肪烃的构建体及利用构建体原位检测脂肪烃的方法

摘要

本发明涉及基因工程与生物能源领域，具体而言是一种检测微生物细胞中脂肪烃的构建体及利用构建体原位检测脂肪烃的方法。构建体包含至少一个脂肪烃检测元件和一个报告蛋白元件；脂肪烃检测元件由具有脂肪烃响应特性的转录激活因子和启动子组成；所述报告蛋白元件为能够在宿主中功能性表达和被检测的蛋白质。测定方法，利用所述构建体将其导入宿主细胞，再将宿主细胞进行培养并诱导其合成脂肪烃，而后通过检测报告蛋白的表达，从而实现对细胞内脂肪烃的检测。本发明方法操作步骤简单，设备要求低，可同时检测大量样品，也可用于对已知脂肪烃生物合成相关的酶和蛋白质或潜在产烃途径的进化和高通量筛选中。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程与生物能源领域，具体而言是一种检测微生物细胞中脂肪烃的构建体及利用构建体原位检测脂肪烃的方法。

背景技术

发展生物燃料是解决人类所面临的资源、能源与环境等方面问题的有效途径之一。由于脂肪烃是汽油、柴油、航空煤油等发动机燃料的主要成分，具有高能量密度、低吸湿性与低挥发性，并且与现有运输设施及发动机系统相匹配，生物脂肪烃已经被认为是一种最有潜力的优质生物燃料。

近年来，在生物体中发现的脂肪烃合成途径主要有五种，由不同的酶催化完成(WangW,LuX:MicrobialBiosynthesisofAlka(e)nes.FrontiersinBioengineeringandBiotechnology.2013,1(10):1-5)。例如，在蓝细菌中主要存在一条两步法合成脂肪烃的途径，即脂酰ACP(fattyacylacyl-carrierprotein)在脂酰ACP还原酶(acylacyl-carrierproteinreductase，AAR)作用下生成脂肪醛，脂肪醛再经脂肪醛脱甲酰加氧酶(aldehyde-deformylatingoxygenase，ADO)催化脱甲酰基生成脂肪烃和甲酸(SchirmerA,RudeMA,LiXZ,PopovaE,delCardayreSB:MicrobialBiosynthesisofAlkanes.Science2010,329(5991):559-562)。此外，在Jeotgalicoccus菌中存在一种细胞色素P450OleT，它能够直接将脂肪酸脱羧基生成具有末端不饱和双键的烯烃(RudeMA,BaronTS,BrubakerS,AlibhaiM,DelCardayreSB,SchirmerA:TerminalOlefin(1-Alkene)BiosynthesisbyaNovelP450FattyAcidDecarboxylasefromJeotgalicoccusSpecies.AppliedAndEnvironmentalMicrobiology2011,77(5):1718-1727)。目前上述途径均已实现在大肠杆菌或蓝细菌中重组表达，且成功检测到C15、C17、C19等脂肪烃的合成，表现出较好的发展前景。

一些具有天然脂肪烃生物合成途径的微生物合成脂肪烃的效率都很低，并不具备工业应用潜力。因此，通过生物工程技术手段在一些具有工业应用潜力的模式微生物中(如大肠杆菌、酵母、蓝细菌等)，大幅度提高脂肪烃的生物合成效率是当前的研究重点(KallioP,PasztorA,AkhtarMK,JonesPR:Renewablejetfuel.CurrentOpinioninBiotechnology2014,26:50-55)，而实现对细胞内脂肪烃含量的快速检测是实施脂肪烃生物合成途径工程改造的一个关键性的前提条件。然而，由于细胞内脂肪烃含量极低，且通常难以和其他物质发生化学反应，使得快速检测细胞中的脂肪烃含量成为极大的难题。目前最常用也是最主要的脂肪烃检测方法是有机溶剂抽提结合气相色谱-质谱联用(GC-MS)分析技术，该方法实验操作复杂，流程较长，仪器设备要求高，无法实现大量样品的并行分析，不能够满足原位快速与高通量检测的要求。

近年来，环境微生物学与合成生物学的发展为微量脂肪烃检测提供了新的可能手段。在不动杆菌(Acinetobacterbaylyi)、假单胞菌(Pseudomonas)等环境微生物中，存在由脂肪烃诱导的信号通路，该信号通路利用环境中的脂肪烃作为信号分子，诱导相关蛋白质的表达。通过将某些易于检测的报告蛋白编码基因置于该信号通路的下游，构建脂肪烃生物传感器元件，即可通过检测由脂肪烃诱导产生的报告蛋白而实现对环境中脂肪烃的间接检测。基于这一发现，在含烃废水的检测方面已有一些成功的例子，例如Zhang等(ZhangDY,HeY,WangY,WangH,WuL,AriesE,HuangWE:Whole-cellbacterialbioreporterforactivelysearchingandsensingofalkanesandoilspills.MicrobialBiotechnology2012,5(1):87-97)构建的以A.baylyiADP1为宿主的AlkR-PalkM::LuxCDABE烃传感器，能够检测环境中碳链长度12～24的脂肪烃；Sticher等(SticherP,JaspersMCM,StemmlerK,HarmsH,ZehnderAJB,vanderMeerJR:Developmentandcharacterizationofawhole-cellbioluminescentsensorforbioavailablemiddle-chainalkanesincontaminatedgroundwatersamples.AppliedandEnvironmentalMicrobiology1997,63(10):4053-4060)构建的以E.coliDH5α为宿主的AlkS-PalkB::LuxAB烃传感器，能够用于检测环境中的微量辛烷(C₈H₁₈)。基于上述发现，可以进一步设计和构建用于检测细胞内脂肪烃含量的生物传感器元件，即可以通过将该生物传感器元件整合进入产烃工程菌，或者说在已整合该生物传感器元件的工程菌中导入产烃途径，从而实现对细胞中合成的脂肪烃的原位快速检测。目前尚无将这一思路成功应用于细胞内生物合成脂肪烃检测的报道。

目前已报道的脂肪烃生物传感器元件均有各自的局限性，无法实现对细胞中合成脂肪烃的原位快速检测。例如，已证明来自不动杆菌ADP1的AlkR-PalkM脂肪烃检测元件在大肠杆菌不能够正常工作(SchirmerA,HuZ,CostaB,USPatent2008/0293060Al)，而能够在大肠杆菌工作的AlkS-PalkB元件对于碳链长度＞9的中长链脂肪烃没有检测效果(ReedB,BlazeckJ,AlperH:Evolutionofanalkane-induciblebiosensorforincreasedresponsivenesstoshort-chainalkanes.JournalofBiotechnology2012,158(3):75-79)。

发明内容

本发明的目的是克服目前对于细胞内脂肪烃的现有检测方法操作复杂，仪器要求高的不足，提供一种检测微生物细胞中脂肪烃的构建体及利用构建体原位检测脂肪烃的方法。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种检测微生物细胞中脂肪烃的构建体，构建体包含至少一个脂肪烃检测元件和一个报告蛋白元件；

脂肪烃检测元件由具有脂肪烃响应特性的转录激活因子和启动子组成；所述报告蛋白元件为能够在宿主中功能性表达和被检测的蛋白质

进一步的说，所述构建体包含由启动子PalkS、转录激活因子AlkR和启动子PalkM组成的脂肪烃检测元件；以及以绿色荧光蛋白、LacZ、荧光素酶或抗性基因作为的报告蛋白元件。

一种原位快速检测细胞内脂肪烃的方法：利用所述构建体将其导入宿主细胞，再将宿主细胞进行培养并诱导其合成脂肪烃，而后通过检测报告蛋白的表达，从而实现对细胞内脂肪烃的检测。

进一步的说，所述检测是将编码脂肪烃检测元件与报告蛋白基因的DNA通过聚合酶链式反应连接入含有抗性基因的表达载体中，将所述表达载体导入含有产烃途径或潜在产烃途径的宿主细胞中；将所述宿主在添加相应抗生素的培养基中进行培养并诱导其合成脂肪烃，继续培养而后检测报告蛋白的表达水平，即检测到报告蛋白的信号，由此获得脂肪烃的含量。所述脂肪烃为中长链脂肪烃。所述宿主细胞为大肠杆菌、酵母或蓝细菌。

更进一步的说，

1)通过聚合酶链式反应(PCR)、限制性酶切和DNA连接技术构建脂肪烃检测元件与报告蛋白基因的串联体基因序列并将其连接入含有抗性基因的表达载体1中，并将所述表达载体1导入携带有产烃途径或潜在产烃途径的宿主中；也可将所述表达载体1与携带潜在产烃途径的表达载体2一起导入原本不具备产烃能力的宿主中；

2)将所述宿主在培养基中进行培养，诱导其产烃途径表达和合成脂肪烃，继续培养6-16小时后，检测报告蛋白的表达，报告蛋白的信号强度即反映细胞中脂肪烃的含量。

其中，步骤1)所述宿主为微生物，优选为大肠杆菌、酵母或蓝细菌，更优选为大肠杆菌，所述含有抗性基因的表达载体为可在上述宿主中复制和表达的载体、质粒、染色体等，如pCom8。所述脂肪烃检测元件包含一个具有脂肪烃响应特性的转录激活因子(优选为AlkR，其具有SEQIDNo:1所示序列)、一个具有脂肪烃响应特性的启动子(优选为PalkM启动子，其具有SEQIDNo:2所示序列)和一个在上述宿主中具有活性的组成型启动子(优选为PalkS启动子，具有SEQIDNo:3所示DNA序列)。所述生物产烃途径是指其表达产物能够在上述宿主中实现脂肪烃合成的基因或基因簇，如脂酰ACP还原酶与脂肪醛脱羰基加氧酶、以及P450OleT_jp等。

步骤2)中所述培养基为适合宿主产烃的培养基，优选为改良M9培养基，其具有如下成分：6g/LNa₂HPO₄,3g/LKH₂PO₄,0.5g/LNaCl,2g/LNH₄Cl,0.25g/LMgSO₄·7H₂O,11mg/LCaCl₂,27mg/LFeCl₃·6H₂O,2mg/LZnCl₂·4H₂O,2mg/LNa₂MoO₄·2H₂O,1.9mg/LCuSO₄·5H₂O,0.5mg/LH₃BO₃,1mg/L维生素B1,200mMBis-Tris(pH7.25)和0.1％(v/v)Triton-X100。所述培养时间为6h-16h，优选为12h。所述检测方法选择视不同模式蛋白而不同，例如当使用绿色荧光蛋白(GFP，SEQIDNo:4)作为报告蛋白时，可以采用测定菌液在488nm激发光下516nm发射光强度的方法进行检测，如利用带有荧光激发和接收模块的酶标仪、激光共聚焦荧光显微镜、流式细胞仪等。

本发明所具有的有益效果：

本发明提供的原位快速检测细胞内脂肪烃的方法及构建体，所述方法基于对不动杆菌和假单胞菌的脂肪烃生物响应信号通路的重组改造，利用脂肪烃诱导的报告蛋白作为标记，实现对细胞内中长链脂肪烃的原位快速与半定量检测；具体：

1)本发明所述方法基于对现有脂肪烃信号通路的重组改造，首次实现了对微生物细胞中合成的中长链脂肪烃的原位检测，在本发明之前无类似的成功报道。

2)本发明所述方法实现了对细胞中脂肪烃的原位快速检测。方法无需使用GC-MS等复杂的大型分析仪器，操作步骤简单，可大幅度降低检测脂肪烃的难度和成本。由于细胞中脂肪烃的含量与报告蛋白信号(如荧光、酶活、最低耐受浓度等，视所选择报告蛋白而定)呈正相关性，因此可以通过提前绘制“脂肪烃-报告蛋白信号”相关标准曲线，根据报告蛋白信号强度半定量计算脂肪烃的浓度。

3)当使用荧光蛋白、荧光素酶、氯霉素等作为报告蛋白元件时，本发明所述方法在检测过程中不需要破坏细胞结构，可根据报告蛋白的信号强度，实现对细胞的在线分选或选择，可应用于对已知脂肪烃生物合成相关的酶和蛋白质的进化和高通量筛选中。

4)本发明所述方法能够快速、灵敏地测定宿主细胞内脂肪烃的含量，所述构建体产生的信号响应仅与脂肪烃含量有关，不受所筛选的目的基因或基因簇来源的影响，因此本发明所述方法与构建体也能够应用于未知产烃基因或基因簇的筛选，有助于自然界中新的产烃基因或产烃途径的发现与获得。

附图说明

图1为本发明实施例提供的利用构建体原位检测细胞内脂肪烃原理示意图。其中AlkR和PalkM均来源于不动杆菌ADP1，PalkS来源于假单胞菌，分别具有SEQIDNo:1、SEQIDNo:2、SEQIDNo:3所示序列。①细胞内的产烃途径在诱导剂作用下表达并合成脂肪烃；②脂肪烃与转录激活因子AlkR结合形成“AlkR-脂肪烃”复合体；③PalkM启动子被激活并驱动GFP表达；④利用荧光显微镜、酶标仪、流式细胞仪等手段检测荧光强度。

图2为本发明实施例提供的携带脂肪烃检测元件与报告蛋白元件的载体pWW02示意图。该载体基于pCom8构建，选择XhoI和SalI作为外源基因插入位点，其中AlkR编码转录激活因子，来源于不动杆菌ADP1；PalkS为组成型启动子，来源于假单胞菌；PalkM为受AlkR调控的诱导型启动子，来源于不动杆菌ADP1；GFP为绿色荧光蛋白；GmR为庆大霉素抗性基因。

图3为本发明实施例提供的携带产烃基因的载体pAL87示意图，该载体基于pET21b构建。其中位于NdeI和XhoI位点之间的orf1593和orf1594分别编码来源于聚球藻7942的脂肪醛脱甲酰加氧酶(ADO)和脂酰ACP还原酶(AAR)，其表达受T7启动子控制；rbs为核糖体结合位点；AmpR为氨苄青霉素抗性基因，pBR322为质粒复制起始位点。

图4为本发明实施例中提供的携带所述构建体pWW02和AAR-ADO产烃途径的大肠杆菌BL21(DE3)ΔfadE细胞(WW04)在加入0.5mMIPTG诱导产烃后的荧光响应结果(A)。分别构建了以下细胞作为对照，包括仅携带pWW02载体(B)、携带pWW02载体和AAR基因(C)。

图5为本发明实施例中提供的不同浓度诱导剂IPTG诱导下携带所述构建体pWW02和产烃途径pAL87的细胞WW04产烃量及菌液相对荧光强度。A.细胞荧光显微镜照片；B.等细胞浓度等体积菌液的相对荧光强度；C.等细胞浓度等体积菌液中的脂肪烃含量；D.荧光强度与脂肪烃含量呈正相关性。WW04主要合成正十五烷(C15-ane)和8-十七烯(C17-ene)两种脂肪烃。

具体实施方式

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对发明的范围的限定。根据附图和优选方法的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。

除非特别指出，否则本发明中所使用的分子生物学试验方法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆:实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，JohnWiley&Sons，Inc.，1995中所述的方法进行或者按照产品说明书进行。所用试剂未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。

序列表信息：

SEQIDNO:1：来源于不动杆菌(AcinetobacterbaylyiADP1)的AlkR基因的核苷酸序列，克隆自AcinetobacterbaylyiADP1基因组。

SEQIDNO:2：来源于不动杆菌(AcinetobacterbaylyiADP1)的PalkM启动子核苷酸序列，克隆自AcinetobacterbaylyiADP1基因组。

SEQIDNO:3：来源于门多萨假单胞菌(PseudomonasmendocinaYMP)的PalkS启动子的核苷酸序列，克隆自pCom8质粒。

SEQIDNO:4：绿色荧光蛋白(GFP)核苷酸序列。

SEQIDNo:5：PalkM-PalkS-AlkR串联体DNA的核苷酸序列。

SEQIDNO:6：来源于聚球藻(SynechococcuselongatusPCC7942)的ADO(orf1593)和AAR(orf1594)基因簇核苷酸序列。

SEQIDNO:7：引物AlkR-for的核苷酸序列。

SEQIDNO:8：引物AlkR-rev的核苷酸序列。

SEQIDNO:9：引物AlkM-for的核苷酸序列。

SEQIDNO:10：引物AlkM-rev的核苷酸序列。

SEQIDNO:11：引物AlkS-for的核苷酸序列。

SEQIDNO:12：引物AlkS-rev的核苷酸序列。

SEQIDNO:13：引物GFP-for的核苷酸序列。

SEQIDNo:14：引物GFP-rev的核苷酸序列。

SEQIDNO:15：ADO(orf1593)的核苷酸序列。

SEQIDNO:16：AAR(orf1594)的核苷酸序列。

SEQIDNO:17：引物ADO-for的核苷酸序列。

SEQIDNO:18：引物ADO-rev的核苷酸序列。

SEQIDNO:19：引物AAR-for的核苷酸序列。

SEQIDNO:20：引物AAR-rev的核苷酸序列。

实施例1：一种用于原位快速检测细胞内脂肪烃构建体的构建及转化大肠杆菌

菌株：

不动杆菌ADP1；大肠杆菌BL21(DE3)ΔfadE；大肠杆菌DH5α

载体：

pCom8；pEGFP

培养基：

LB培养基(含胰蛋白胨10g/L，酵母浸膏粉5g/L，NaCl10g/L,若为固体培养基，则每升培养基添加琼脂15g/L)

实施步骤：(1)利用引物alkR-for和alkR-rev以AcinetobacterbaylyiADP1基因组为模板扩增AlkR基因DNA；利用引物alkM-for和alkM-rev以AcinetobacterbaylyiADP1基因组为模板扩增PalkM启动子DNA；利用引物alkS-for和alkS-rev从pCom8质粒(参见GenBank:AJ299427.1)扩增PalkS启动子DNA；利用引物GFP-for和GFP-rev以pEGFP质粒(参见NCBIGenBank:U76561.1)为模板扩增GFP基因，并将其插入pCom8质粒的EcoRI和SalI位点之间，获得pCom8-GFP基因。

(2)通过重叠PCR将PalkM、PalkS和AlkR三段DNA串联(方向顺序如图1所示)后，将该串联DNA插入pCom8-GFP质粒的XhoI和EcoRI位点之间，获得携带脂肪烃传感器元件的质粒pWW02(图2)。

所用引物序列如下(划线部分为酶切位点)：

AlkR-for：GCGAGAATAGCATATACATATGGATGCACTTAGTAAAAT

AlkR-rev：

ACTCTCGAGTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGCTGGATCCTCATGATTGCTGGCGATAG

alkM-for：TCGCGGTACCTGGCATTCTAGAAAATGCCAAAGACTTTG

alkM-rev：GCTCACCATGAATTCAGTGAATCCTTTCTTGTTATCCTC

alkS-for：GCCAGGTACCGCGAGCTACTCGCGAC

alkS-rev：CATCCATATGTATATGCTATTCTCGCGCCAGCTGACT

GFP-for：GGAGAATTCCATTTAAAGAGGAGAAAGGTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC

GFP-rev：GCAGGTCGACCTTGTACAGCTCGTC

具体的，PCR反应分别以AcinetobacterbaylyiADP1基因组、pCom8质粒和pEGFP质粒为模板，使用Fermentas公司的2×EasyTaqPCR混合物(含EasyTaq聚合酶和dNTPs)，PCR反应条件为：先95℃2min；然后94℃1min,55℃1min,72℃1min，共30个循环；最后72℃10min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，获得四条位置正确的条带；

将pCom8质粒与PCR扩增得到的GFP基因片段分别用限制性内切酶SalI和EcoRI双切，将凝胶回收得到的两个较长片段进行连接，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化细胞涂布于添加有50μg/mL庆大霉素的LB平板上，挑取阳性克隆并进行测序。挑取序列正确的菌落进行质粒抽提，获得质粒pCom8-GFP；

以三个片段(AlkR，PalkS，PalkM)为模板进行重叠PCR反应：①先在不加入引物的情况下先95℃2min；然后94℃1min,55℃1min,72℃1min30sec，共15个循环；最后72℃10min；②加入引物AlkR-rev和alkM-rev，PCR程序为95℃2min；然后94℃1min,55℃1min,72℃2min30sec，共30个循环；最后72℃10min。反应结束后对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，获得一条位置正确的条带。将PCR扩增产物进行凝胶分离回收，用限制性内切酶EcoRI和XhoI进行双酶切，然后与经过同样酶双酶切的质粒pCom8-GFP质粒进行连接，将连接产物转化到大肠杆菌BL21(DE3)ΔfadE感受态细胞(构建过程参见Duan,Y.K.,Zhu,Z.,Cai,K.,etal.DenovoBiosynthesisofBiodieselbyEscherichiacoliinOptimizedFed-BatchCultivation[J].PlosOne,2011,6(5):e20265)，将转化细胞涂布于添加有50μg/mL庆大霉素的LB平板上，挑取阳性克隆并进行测序。挑取序列正确的菌落进行质粒抽提，从而完成携带脂肪烃传感器元件的质粒pWW02的构建。

实施例2：完整的脂肪烃合成途径能够诱导报告蛋白(GFP)的表达

菌株：

E.coliBL21(DE3)ΔfadE

载体：

pWW02；pET21b(+)；pET28a；pET30a(+)

培养基：

LB培养基(含胰蛋白胨10g/L，酵母浸膏粉5g/L，NaCl10g/L,若为固体培养基，则每升培养基添加琼脂15g)

改良M9培养基(含6g/LNa₂HPO₄,3g/LKH₂PO₄,0.5g/LNaCl,2g/LNH₄Cl,0.25g/LMgSO₄·7H₂O,11mg/LCaCl₂,27mg/LFeCl₃·6H₂O,2mg/LZnCl₂·4H₂O,2mg/LNa₂MoO₄·2H₂O,1.9mg/LCuSO₄·5H₂O,0.5mg/LH₃BO₃,1mg/L维生素B1,200mMBis-Tris(pH7.25)和0.1％(v/v)Triton-X100)

实施步骤：(1)利用引物ADO-for和AAR-rev以聚球藻7942基因组为模板，扩增orf1593-orf1594DNA(SEQIDNO:6)；利用引物ADO-for和ADO-rev，以聚球藻7942基因组为模板，扩增ADO序列(SEQIDNO:15)；利用引物AAR-for和AAR-rev，以聚球藻7942基因组为模板，扩增AAR序列(SEQIDNO:16)。

所用引物序列如下：

ADO-for：TATACATATGCCGCAGCTTGAAGCCAGC

ADO-rev：TGGACTCGAGTCAAACGGCCGCAAGGCC

AAR-for：CTGACATATGTTCGGTCTTATCGGTCATC

AAR-rev：CGAGCTCGAGTCAAATTGCCAATGCCAAG

具体的，PCR反应使用Fermentas公司的2×EasyTaqPCR混合物(含EasyTaq聚合酶和dNTPs)，PCR反应条件为：先95℃2min；然后94℃1min,55℃1min,72℃1min30sec，共30个循环。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，获得三条位置正确的条带。用PCR产物纯化试剂盒(Promega)纯化上述三种PCR产物后，利用限制性内切酶NdeI和XhoI进行双酶切反应，并分别与同样进行双酶切的载体pET21b(+)、pET28a(+)和pET30a(+)(Novagen)连接，获得pET21b-ADO-AAR(即pAL87，图3)、pET28b-AAR、pET30a-ADO质粒，将连接产物转化BL21(DE3)ΔfadE，筛选阳性克隆进行测序，分别挑取序列正确的菌株提取质粒。

(2)利用步骤(1)构建的质粒pET21b-ADO-AAR、pET28b-AAR与实施例(1)中构建的质粒pWW02分别进行如下操作：

将pWW02单独转化BL21(DE3)ΔfadE，获得WW03；

将pWW02与pET21b-ADO-AAR(即pAL87)质粒共同转化BL21(DE3)ΔfadE，获得WW04；

将pWW02与pET28b-AAR质粒共同转化BL21(DE3)ΔfadE，获得WW05；

将所构建的WW03、WW04和WW05分别在LB培养基中30℃，250rpm下过夜培养，而后按1:50(v/v)将过夜培养液转接至新鲜改良M9培养基中，培养至对数期(OD600＝0.6-0.8)，再加入0.5mmol/LIPTG作为AAR与ADO的诱导剂，细胞在30℃继续培养约16h后，取5μl菌液在荧光显微镜下观察细胞荧光。

结果如图4所示，与对照组(WW03、WW05)相比，构建体WW04在诱导后可以观察到显著的绿色荧光；当细胞中没有完整产烃途径时(如WW03、WW05)，细胞仅表现出微弱荧光，和GFP的渗漏表达有关，但这种渗漏表达产生的荧光远低于诱导后的荧光信号强度；此外，单独表达AAR的细胞(WW05)荧光信号与WW03相比无明显差别，表明E.coli中单独表达AAR不能够合成脂肪烃，因而不能够诱导GFP的表达。上述结果证明所述构建体能够用于大肠杆菌细胞内合成脂肪烃的原位检测。

实施例3：构建体的荧光强度与细胞内脂肪烃浓度呈正相关性

菌株：

大肠杆菌BL21(DE3)ΔfadE

载体：

pWW02；pAL87

培养基：

LB培养基(含胰蛋白胨10g/L，酵母浸膏粉5g/L，NaCl10g/L,若为固体培养基，则每升培养基添加琼脂15g)

改良M9培养基(含6g/LNa₂HPO₄,3g/LKH₂PO₄,0.5g/LNaCl,2g/LNH₄Cl,0.25g/LMgSO₄·7H₂O,11mg/LCaCl₂,27mg/LFeCl₃·6H₂O,2mg/LZnCl₂·4H₂O,2mg/LNa₂MoO₄·2H₂O,1.9mg/LCuSO₄·5H₂O,0.5mg/LH₃BO₃,1mg/L维生素B1,200mMBis-Tris(pH7.25)和0.1％(v/v)Triton-X100)

实施步骤：将上述携带pWW02和pAL87的大肠杆菌BL21(DE3)ΔfadE(WW04)在LB培养基中37℃，250rpm下过夜培养，而后按1:50(v/v)将过夜培养液转接至新鲜改良M9培养基中，培养至对数期(OD600＝0.6-0.8)，分别取培养至对数生长期的培养液并向其中分别加入诱导剂IPTG至以下终浓度(mmol/L)：0.01，0.02，0.03，0.05，0.5。上述各培养液细胞在30℃继续分别培养约12h后，分别取5μL菌液在荧光显微镜下观察细胞荧光；而后再分别取25μL菌液,用175μLddH₂O稀释，分别在荧光酶标仪中定量检测稀释后菌液的吸光度(600nm)和相对荧光强度(激发波长为485nm，发射波长为516nm)，用相对荧光强度除以相应吸光度，即得到等细胞浓度菌液的相对荧光强度。

将上述稀释的各菌液继续培养约24h，培养后分别取10mL菌液超声破碎，粉碎后分别加入10mL氯仿和甲醇(氯仿与甲醇按体积比2:1混合)溶液充分震荡，分别在4℃离心(8000g,10min)取各自下层有机相吹干后用色谱纯正己烷溶解，用GC-MS检测样品中的脂肪烃含量，检测条件如下：采用配备有HP-INNOWax(30m×250μm×0.25μm)色谱柱的Agilent7890A气相色谱，使用Helium为载气，流速为1mL/min。进样量为1μL，进样口温度为250℃。GC-MS测试程序为：40℃1min，以5℃/min的速率升至200℃，然后以25℃/min的速率升至240℃，在240℃维持15min。利用正二十烷作为内标计算脂肪烃浓度。)。

如图5所示，随着IPTG浓度逐渐升高，脂肪烃(包括正十五烷和十七烯)含量逐渐提高，与细胞荧光强度呈较为一致的正相关性。由于IPTG对于报告蛋白并无直接的诱导作用，以上结果表明构建体中报告蛋白的表达水平能够定性或半定量反映细胞内脂肪烃的含量。因此，可以利用所述构建体检测细胞内脂肪烃的浓度。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。