可在空气中稳定存在的微纳尺度蛋白质晶体的制备方法

摘要

本发明提供了一种可在空气中稳定存在的微纳尺度蛋白质晶体的制备方法，采用简单易行的方法生长蛋白质微小晶体，然后利用交联剂对微小晶体进行化学交联，获得可在空气中稳定存在的蛋白质微小晶体。本发明操作方便，经济实惠，制备的蛋白质微小晶体用于自由电子激光衍射时不需要晶体环或毛细管，可以消除背景散射；当用作催化剂时，样品不会溶解，可以反复使用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备蛋白质微晶的方法，特别是制备微纳尺度、可在空气中稳定存在的蛋白质微晶的方法，属于蛋白质结晶方法学领域。

背景技术

目前，在蛋白质结构数据库中，超过88％的蛋白质结构是通过X射线单晶衍射技术解析得到的。获取高质量蛋白质单晶是此技术的关键，也是此技术的瓶颈问题。由于很多蛋白质难以结晶或难以获得尺寸适当的单晶，因此，突破传统X射线单晶衍射技术解析结构成为新的努力方向。最近，利用自由电子激光(freeelectronlasers,XFELs)对大量微纳尺度的蛋白质晶体进行衍射以获得衍射数据的方法，已成为X射线衍射技术解析蛋白质结构最前沿的研究方向。为了实现该技术，必须获取微纳尺度的蛋白质晶体。文献“Reliablydistinguishingproteinnanocrystalsfromamorphousprecipitatebymeansofdepolarizeddynamiclightscattering,JournalofAppliedCrystallography,2015,45:476-1484”中，RSchubert等通过在沉淀剂中加入PEG8000制备得到了溶菌酶微晶，可以用于自由电子激光衍射。

上述文献得到的蛋白质微晶只能在结晶母液或粘稠的胶体中保持稳定的结构，一旦脱离母液或胶体会很快开裂，并伴随着晶体的溶解。这些方法得到的晶体在衍射时，不仅会浪费大量的蛋白晶体，而且会存在背景散射，对衍射数据的质量会产生影响。此外，微小晶体由于尺寸太小，其制备方法以及晶体的固化方法存在较大的技术难题。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供一种可在空气中稳定存在的微纳尺度蛋白质晶体的制备方法，通过控制结晶溶液的浓度、晶体生长时间、温度，采用微孔滤膜截取晶体等多种技术，获得微纳尺度的蛋白质晶体。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案包括以下步骤：

第一步，配制两份pH为3～8、浓度为0.05～0.5M的缓冲液；将蛋白质溶解于一份缓冲液中，制得蛋白质溶液，浓度为10～80mgml^-1；将结晶用的盐溶解于另一份缓冲液中，制得沉淀剂溶液，浓度为0.8～1.5M或体积分数为15～70％；将蛋白溶液和沉淀剂溶液等体积混合，得到蛋白质结晶溶液；

第二步，将交联剂溶解于所述的沉淀剂溶液中，得到终浓度为0.015～0.3M或体积分数为1～5％的交联溶液；所述的交联剂为戊二醛、乙二醛、丙二醛、丙二胺、辛二胺、苯乙烯、对甲苯磺酸、三羟乙基胺、2-苯基咪唑、过氧化二异丙苯、正硅酸乙酯、三羟甲基丙烷中的任意一种或任意两种的组合；

第三步，将蛋白质结晶溶液置于控温箱中进行培养，晶体生长时间为4～30min，晶体生长温度为0～10℃；

第四步，把蛋白质结晶溶液置于微孔滤膜上，微孔滤膜的滤径0.01～0.5μm，用吸水纸在微孔滤膜下方吸走未结晶的溶液，在微孔滤膜上滴加所述的沉淀剂溶液后再次用吸水纸在微孔滤膜下方吸走未结晶的溶液，重复3次；

第五步，将交联溶液滴加到微孔滤膜上，在0～10℃条件下放置2～4小时；

第六步，用吸水纸在微孔滤膜下方吸走交联溶液，在微孔滤膜上滴加蒸馏水后再次用吸水纸在微孔滤膜下方吸走溶液，重复3次；将得到的微小晶体放在在干燥皿里干燥2～4天，获得最终的样品。

本发明的有益效果是：本发明提供了一种简单易行的方法生长蛋白质微小晶体，然后利用交联剂对微小晶体进行化学交联，获得可在空气中稳定存在的蛋白质微小晶体。由于交联后晶体内新化学键的形成，其机械、化学及热稳定显著提高，并可以在空气中稳定存在。此晶体用于自由电子激光衍射时不需要晶体环或毛细管，可以消除背景散射；当用作催化剂时，样品不会溶解，可以反复使用。本发明提出的制备在空气中能够稳定存在的蛋白质微晶样品，不溶于水和有机溶剂，可以直接对其进行机械接触操作。该样品不需要液氮、液氦等低温环境，可以直接在空气或真空中进行衍射，有效地消除背景散射，获得高质量的衍射数据。同时，样品可以重复使用，这样既可以最大程度的利用样品，还可以节约实验成本。本发明制备的蛋白质微晶还可以作为生长蛋白质大晶体的同质或异质籽晶。此外，获得的样品，也可用于医药、催化、生物检测等领域。由于制备的蛋白质微晶样品很稳定，利于长期存放，也十分容易操纵，可以大幅简化实验操作流程。由于晶体固有的三维有序结构，本发明得到的交联晶体结构非常均一，且颗粒的活性比较均衡。本发明的特点是操作方便、经济实惠，且交联后的小晶体可以在空气中稳定存在。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步说明，本发明包括但不仅限于下述实施例。

本发明的技术方案包括以下步骤：

第一步：配制蛋白质结晶溶液。首先，配制两份pH为3～8，浓度为0.05～0.5M的缓冲液。然后，将蛋白质溶解于一份缓冲液中，浓度为10～80mgml^-1。其次，将结晶用的盐溶解于另一份缓冲液中，浓度为0.8～1.5M或体积分数为15～70％，制得沉淀剂溶液。最后，将蛋白溶液和沉淀剂溶液等体积混合，得到蛋白质结晶溶液。

第二步：配制交联溶液。将交联剂溶解于第一步的沉淀剂中，终浓度为0.015～0.3M或体积分数为1～5％。所用的交联剂包括戊二醛，乙二醛，丙二醛，丙二胺，辛二胺，苯乙烯，对甲苯磺酸，三羟乙基胺，2-苯基咪唑，过氧化二异丙苯，正硅酸乙酯，三羟甲基丙烷中的任意一种或任意2种组合。

第三步：制备微纳尺度蛋白质晶体。将蛋白质结晶溶液置于控温箱中进行培养。本发明主要是通过增加结晶溶液的浓度至普通结晶浓度的120～180％、减少晶体生长的时间至4～30min以及降低晶体生长的温度至0～10℃来获得大量的蛋白质微晶。

第四步：洗涤蛋白质微小晶体。由于溶液中未结晶的蛋白质会跟交联溶液反应生成絮状物沉淀，因此在进行交联之前需要去除溶液中残留的蛋白质分子。首先，把含有小晶体的结晶溶液吸到微孔滤膜(滤径0.01～0.5μm)上，用吸水纸在微孔滤膜下方吸走未结晶的溶液。然后，再在微孔滤膜上滴加第一步的沉淀剂溶液，在膜的下方把溶液吸走，重复洗涤3次。

第五步：交联蛋白质微小晶体。将交联溶液滴加到微孔滤膜(滤径0.01～0.5μm)上，在0～10℃，放置2～4小时，让微小晶体与交联液彻底反应。

第六步：洗涤交联蛋白质小晶体。首先用吸水纸在微孔滤膜下方吸走交联溶液。然后，滴加蒸馏水到微孔滤膜上方，吸水纸在膜下方吸走溶液，重复洗涤3次。最后，将微小晶体放在在干燥皿里干燥2～4天，获得最终的样品。

实施例1：制备可在空气中稳定存在的微纳尺度溶菌酶晶体。

第一步：配制溶菌酶结晶溶液。首先，配制两份pH为3的乙酸-乙酸钠缓冲溶液。然后，将日本Seikagaku公司的No.100940溶菌酶溶解于一份缓冲液中，初始浓度为80mgml^-1。其次，把优级纯氯化钠溶解于另一份缓冲溶液中制得沉淀剂溶液，初始浓度为80mgml^-1。最后，将溶菌酶溶液和氯化钠溶液等体积混合，制得蛋白质结晶溶液。

第二步：配制戊二醛交联溶液。将体积分数为50％的戊二醛滴加到NaCl沉淀剂中，使得终体积分数为5％。

第三步：制备溶菌酶微小晶体。将溶菌酶结晶溶液置于控温箱中进行恒温培养，其温控热源为循环水浴。本发明采用坐滴法进行结晶，结晶温度为4℃，结晶时间为4～6分钟。

第四步：洗涤溶菌酶微小晶体。首先，把含有小晶体的结晶溶液吸到微孔滤膜(滤径0.5μm)上，用吸水纸在微孔滤膜下方吸走未结晶的溶液。然后，再在微孔滤膜上滴加步骤1得到的沉淀剂溶液，在膜的下方把溶液吸走。按照上述方法，重复操作3次，彻底洗去没有结晶的蛋白质分子。

第五步：交联溶菌酶微小晶体。将戊二醛交联溶液滴加到微孔滤膜上方，在4℃环境下，放置2～4个小时，让戊二醛与小晶体彻底反应。

第六步：洗涤交联溶菌酶微小晶体。首先，把吸水纸放到微孔滤膜下方吸走戊二醛交联液。然后，滴加蒸馏水到微孔滤膜上方，吸水纸在膜下方吸走溶液。按照上述方法，重复操作3次，彻底洗去小晶体表面的戊二醛。最后，将微小晶体放在在干燥皿里干燥2～4天，获得最终的样品。

结果如下：通过上面的步骤，制备得到了可以在空气中稳定存在的微纳尺度溶菌酶晶体。这些小晶体呈现淡黄色，在真空炉中100℃下烧结1小时，微小晶体的结构没有发生变化。

实施例2：制备可在空气中稳定存在的微纳尺度乳酸脱氢酶晶体。

第一步：配制乳酸脱氢酶结晶溶液。首先，配制两份pH为8.000.1M磷酸缓冲溶液。然后，将美国Sigma公司的No.61309乳酸脱氢酶溶解于一份缓冲溶液中，初始浓度为10mgml^-1。其次，将硫酸铵溶解于另一份缓冲液中制成沉淀剂溶液，体积分数为70％。最后，把乳酸脱氢酶溶液和沉淀剂溶液等体积混合，制得蛋白质结晶溶液。

第二步：配制交联溶液。首先配制pH为7.50的0.5M三羟乙基胺缓冲液，然后把戊二醛溶解于缓冲液中，浓度为15mM。

第三步：制备乳酸脱氢酶微小晶体。将乳酸脱氢酶结晶溶液置于控温箱中进行恒温培养，其温控热源为循环水浴。本发明采用坐滴法进行结晶，结晶温度为10℃，结晶时间为10～15分钟。

第四步：洗涤乳酸脱氢酶微小晶体。首先，把含有小晶体的结晶溶液吸取到微孔滤膜(滤径0.2μm)上，用吸水纸在微孔滤膜下方吸走未结晶的溶液。然后，再在微孔滤膜上滴加步骤1得到的沉淀剂溶液，在膜的下方把溶液吸走。按照上述方法，重复操作3次，彻底洗去没有结晶的蛋白质分子。

第五步：交联乳酸脱氢酶微小晶体。将交联溶液滴加到微孔滤膜上方，在4℃环境下，放置3～4个小时，让交联液与小晶体彻底反应。

第六步：洗涤乳酸脱氢酶微小晶体。首先，把吸水纸放到微孔滤膜下方吸走交联液。然后，滴加蒸馏水到微孔滤膜上，吸水纸在膜下面吸走溶液。按照上述方法，重复操作3次，彻底洗去小晶体表面的交联液。最后，将微小晶体放在在干燥皿里干燥2～4天，获得最终的样品。

结果如下：通过上面的步骤，制备得到了可以在空气中稳定存在的乳酸脱氢酶微小晶体。

实施例3：制备可在空气中稳定存在的微纳尺度蛋白酶K晶体

第一步：配制蛋白酶K结晶溶液。首先，配制两份0.08M醋酸镁，0.05M二甲砷酸钠，pH为4.60的缓冲溶液。然后，将美国Sigma公司的No.P6556蛋白酶K溶解于一份缓冲溶液中，初始浓度分别为20mgml^-1。其次，将PEG8000溶解于另一份缓冲溶液中制得沉淀剂溶液，体积分数为20％。最后，将蛋白酶K溶液和PEG8000沉淀剂等体积混合，制得蛋白质结晶溶液。

第二步：配制交联溶液。将体积分数为50％的戊二醛滴加到20％PEG8000沉淀剂中，使得终体积分数为1％。

第三步：制备溶菌酶微小晶体。将蛋白酶K结晶溶液置于控温箱中进行恒温培养，其温控热源为循环水浴。本发明采用坐滴法进行结晶，结晶温度为10℃，结晶时间为10～15分钟。

第四步：洗涤蛋白酶K微小晶体。首先，把含有小晶体的结晶溶液吸取到微孔滤膜(滤径0.05μm)上，用吸水纸在微孔滤膜下方吸走未结晶的溶液。然后，再在微孔滤膜上滴加步骤1得到的沉淀剂溶液，在膜的下方把溶液吸走。按照上述方法，重复操作3次，彻底洗去没有结晶的蛋白质分子。

第五步：交联蛋白酶K微小晶体。将2％的戊二醛滴加到微孔滤膜上方，在10℃环境下，放置2～4个小时，让戊二醛与小晶体彻底反应。

第六步：洗涤交联蛋白酶K微小晶体。首先，把吸水纸放到微孔滤膜下方吸走戊二醛交联液。然后，滴加蒸馏水到微孔滤膜上，吸水纸在膜下面吸走溶液。按照上述方法，重复操作3次，彻底洗去小晶体表面的戊二醛。最后，将微小晶体放在在干燥皿里干燥2～4天，获得最终的样品。

结果如下：通过上面的步骤，制备得到了可以在空气中稳定存在的蛋白酶K微小晶体。

实施例4：制备可在空气中稳定存在的微纳尺度过氧化氢酶晶体

第一步：配制过氧化氢酶结晶溶液。首先，配制两份pH为7.000.1M丁二酸缓冲溶液。然后，将美国Sigma公司生产的No.C40过氧化氢酶溶解于一份缓冲溶液中，初始浓度为12mgml^-1。其次，将PEG3350溶解于另一份缓冲溶液中制得沉淀剂溶液，体积分数为15％。最后，把过氧化氢酶溶液和15％PEG3350溶液等体积混合，制得蛋白质结晶溶液。

第二步：配制交联溶液。将体积分数为50％的戊二醛滴加到15％PEG3350沉淀剂中，使得终体积分数为4％。

第三步：制备溶菌酶微小晶体。将过氧化氢酶结晶溶液置于控温箱中进行恒温培养，其温控热源为循环水浴。本发明采用坐滴法进行结晶，结晶温度为0℃，结晶时间为20～30分钟。

第四步：洗涤过氧化氢酶微小晶体。首先，把含有小晶体的结晶溶液吸取到微孔滤膜(滤径0.01μm)上，用吸水纸在微孔滤膜下方吸走未结晶的溶液。然后，再在微孔滤膜上滴加步骤1得到的沉淀剂溶液，在膜的下方把溶液吸走。按照上述方法，重复操作3次，彻底洗去没有结晶的蛋白质分子。

第五步：交联过氧化氢酶微小晶体。将4％的戊二醛滴加到微孔滤膜上方，在0℃环境下，放置2～4个小时，让戊二醛与小晶体彻底反应。

第六步：洗涤交联过氧化氢酶微小晶体。首先，把吸水纸放到微孔滤膜下方吸走戊二醛交联液。然后，滴加蒸馏水到微孔滤膜上，吸水纸在膜下面吸走溶液。按照上述方法，重复操作3次，彻底洗去小晶体表面的戊二醛。最后，将微小晶体放在在干燥皿里干燥2～4天，获得最终的样品。

结果如下：通过上面的步骤，制备得到了可以在空气中稳定存在的过氧化氢酶微小晶体。

实施例5：制备可在空气中稳定存在的微纳尺度葡萄糖氧化酶晶体。

第一步：配制葡萄糖氧化酶结晶溶液。首先，配制两份pH为5.00的0.5M乙酸-乙酸钠缓冲溶液。然后，将美国Sigma公司的No.G3660葡萄糖氧化酶溶解于一份缓冲溶液中，初始浓度分别为10mgml^-1。其次，将PEG6000和2-丙醇溶解于另一份缓冲液中制成沉淀剂溶液，体积分数分别为18％和32％。最后，把葡萄糖氧化酶溶液和沉淀剂溶液等体积混合，制得蛋白质结晶溶液。

第二步：配制交联溶液。首先将沉淀剂溶液稀释一倍，然后将1,8-辛二胺溶解于此溶液中，浓度为0.3M，制得交联溶液。

第三步：制备葡萄糖氧化酶微小晶体。将葡萄糖氧化酶结晶溶液置于控温箱中进行恒温培养，其温控热源为循环水浴。本发明采用坐滴法进行结晶，结晶温度为6℃，结晶时间为10～15分钟。

第四步：洗涤葡萄糖氧化酶微小晶体。首先，把含有小晶体的结晶溶液吸取到微孔滤膜(滤径0.3μm)上，用吸水纸在微孔滤膜下方吸走未结晶的溶液。然后，再在微孔滤膜上滴加步骤1得到的沉淀剂溶液，在膜的下方把溶液吸走。按照上述方法，重复操作3次，彻底洗去没有结晶的蛋白质分子。

第五步：交联乳酸脱氢酶微小晶体。将交联溶液滴加到微孔滤膜上方，在6℃环境下，放置2～4个小时，让交联液与小晶体彻底反应。

第六步：洗涤交联葡萄糖氧化酶微小晶体。首先，把吸水纸放到微孔滤膜下方吸走交联液。然后，滴加蒸馏水到微孔滤膜上，吸水纸在膜下面吸走溶液。按照上述方法，重复操作3次，彻底洗去小晶体表面的交联液。最后，将微小晶体放在在干燥皿里干燥2～4天，获得最终的样品。

结果如下：通过上面的步骤，制备得到了可以在空气中稳定存在的葡萄糖氧化酶微小晶体。