一种中国人口腔黑色素瘤细胞系COMM-1及其建立方法

摘要

本发明公开了一种中国人口腔黑色素瘤细胞系COMM-1，所述中国人口腔黑色素瘤细胞系COMM-1保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC：C201586，其保藏日期为2015年6月8日。本发明的有益效果为：本发明建立了中国人口腔黑色素瘤细胞系COMM-1，并用该细胞系实现了肿瘤干细胞的富集，为研究人中国人口腔黑色素瘤的特性及其治疗药物提供了物质基础。

说明书

技术领域

本发明属于细胞工程领域，具体涉及一株中国人口腔黑色素瘤细胞系COMM-1及其 建立方法。

背景技术

1.1口腔黑色素瘤的发病及预后

恶性黑色素瘤源于神经脊细胞，是侵袭性最强的恶性肿瘤之一。原发性口腔黑色 素瘤是一种罕见疾病，约占口腔恶性肿瘤0.5％及口腔活检组织0.01％。该疾病多发于41- 60岁之间，男女比例为2:1，患者在患病初期未见明显症状，大部分口腔黑色素瘤在确诊时 已进入晚期，可见肿瘤块大于4mm。口腔黑色素瘤严重影响患者味觉，预后较差，5年生存率 仅为15-20％。

1.2细胞系的建立

建立肿瘤细胞系是研究肿瘤致关重要的环节。细胞系广泛应用于生物学各个研究 领域。它是指直接从生物体的组织中分离培养出细胞，为后续研究提供稳定细胞系的一种 方法。细胞系是研究特定细胞的生长、代谢、调控特性，细胞与细胞间相互作用，细胞与基质 的相互作用等有效的研究材料。人类的第一株连续细胞系是1951年由GeorgeOttoGey实 验室建立的子宫颈癌细胞系(Hela)，这株细胞系的建立是人体细胞体外培养的里程碑， Hela细胞推进了细胞、基因、病毒、疫苗等许多研究领域的进程，也加深了人们对肿瘤的认 识：发现肿瘤的各种特性、研究肿瘤发生发展的原因和过程、筛选抗癌药物等。

除了研究细胞本身的特性和癌症的发生发展外，还应用于遗传、免疫、分化、发育 的研究领域。此外，国内外不少企业还可以利用细胞进行生产各种因子、蛋白等。细胞的广 泛应用推动了细胞生物学的蓬勃发展。

原代培养主要有机械法和酶消化法。机械法主要是利用物理剪切，直接将组织剪 碎，然后将这些组织小块贴壁培养的方法。酶消化法是应用适当的酶裂解组织从而分离出 单细胞，直接悬浮或贴壁培养的方法。用于消化的酶主要有：胰蛋白酶、胶原酶、链酶蛋白 酶、透明质酸酶等。

癌细胞的体外建系难度较大，一是要有效预防和去除支原体、霉菌及细菌等的污 染；二是要保证细胞生存环境如血清，培养基，生长因子等的质量；三是有效控制纤维细胞 的生长；四是必须控制好前10代细胞的传代与保种。虽然70年代Moore等相继建立了HT- 144Melanoma，RPMI-7951等黑色素瘤细胞系，但来源不同的黑色素瘤其生物学特性各异，且 这些细胞系在体外生存时间过长，其生物学特性与体内实体瘤相比较有较大差异，难以客 观反映体内实体瘤的情况，因此，建立体外培养的黑色素瘤细胞系，能为基础研究与临床 治疗提供丰富的实验材料，对于探讨其发病机制，寻找新的治疗手段意义重大。

1.3黑色素瘤干细胞的研究

近年来随着对肿瘤研究的不断进展，针对一些复发肿瘤和对放射性、化学治疗不 敏感提出了肿瘤干细胞(cancerstemcell，CSC)的概念，该学说认为肿瘤细胞具有异质 性，同一肿瘤中，大部分细胞高分化的细胞已经失去了生长分化潜能，只有一小部分细胞具 有无限增殖、分化和体外克隆的能力。

区分CSC的基本特点主要包括：一是将肿瘤移植到免疫缺陷小鼠时，肿瘤中只有很 少一部分细胞是肿瘤干细胞，较少的癌细胞就能使小鼠致瘤。二是CSC与非CSC可通过独特 的细胞表面标志物用流式的方法富集细胞。三是CSC具有自我更新能力可以通过多代的连 续传代和移植实验证实。

恶性黑色素瘤亲代细胞在添加生长因子的独特无血清培养基中悬浮培养后部分 细胞形成悬浮生长的肿瘤细胞球，目前已经被实验证实的黑色素瘤细胞表面标志物是 CD20、CD271、JARID1B、ABCB5、ABCG2等。CD20是第1个被发现的恶性黑色素瘤干细胞的表面 标志物，CD20⁺黑色素瘤细胞亚群具有多能性和多向分化能力，具有体外自我更新能力和致 瘤性，可以通过体外诱导成为神经祖细胞。CD271是低亲和性神经生长因子受体，也是神经 脊细胞的表面标志物，CD271被认为与黑色素瘤细胞的外周神经的侵袭和转移相关，CD271 大约占黑色素瘤亚群的2.5％-41％。JARID1B是一个组蛋白脱甲基酶，具有促进肿瘤持续增 殖、自我更新和多能性。JARID1B在正常组织中低表达或不表达，而在再生能力强的黑色素 痣组织异常高表达，但是，JARID1B阳性细胞仅占5％-10％。ATP结合盒式蛋白(ATP-binding cassettetransporter，ABC)是古老而庞大的家族，是一类ATP驱动泵，ABC家族蛋白水解 ATP产生能量用以转运各种物质，ABCG2和ABCB5被认为在具有黑色素瘤干性的细胞中表达。

发明内容

本发明提供了一种中国人口腔黑色素瘤细胞系COMM-1及其建立方法。

首先，本发明提供了一种中国人口腔黑色素瘤细胞系COMM-1，所述中国人口腔黑 色素瘤细胞系COMM-1保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCC： C201586，其保藏日期为2015年6月8日，保藏地址为武汉大学。

进一步本发明提供了一种中国人口腔黑色素瘤细胞系COMM-1的建立方法，包括如 下具体步骤：

a)采用组织块贴壁法进行口腔黑色素瘤细胞的原代培养；

b)当细胞密度达到约80％时进行传代培养，传代比例为1:3；

c)将传代稳定的细胞经RT-PCR检测mRNA表达的状况。

进一步地，所述步骤c)中，检测的mRNA黑色素瘤细胞系、神经脊来源细胞肿瘤抗原 mRNA。

进一步地，所述步骤c)中，检测的mRNA为Melan-A、TYR、MITF。

所述的中国人口腔黑色素瘤细胞系COMM-1的建立方法，步骤a)的具体方法为：

1)1％I型胶原包被培养皿培37℃培养箱静止30min，冷1×PBS洗皿两次，待用；

2)配置培养液，放于37℃恒温水浴锅中温育10分钟；

3)在超净台中取出黑色素瘤组织，先去除表面脂肪和上皮组织，75％酒精消毒不 超过10秒，在1×PBS中浸泡，放到培养液中；

4)将组织剪成小碎块，均匀分种入培养皿中，加入适量培养液，使组织一半浸于培 养液中；

5)置于37℃，5％CO2的培养箱中培养；

6)第二天补充适量培养液至稍稍浸没组织块；

7)视细胞生长情况进行适当换液。

所述的中国人口腔黑色素瘤细胞系COMM-1的建立方法，步骤b)的具体方法为：

1)弃培养液，用1×PBS洗一次，加入胰蛋白酶消化；

2)加入血清终止消化；

3)吹打细胞，置于离心管中，加入适量的培养液吹打；

4)离心1000rpm，5分钟；

5)弃上清，加入适量培养液吹打散；

6)将细胞悬液加入新的培养皿中，得到所述中国人口腔黑色素瘤细胞系COMM-1。

本发明的内容还包括所述的中国人口腔黑色素瘤细胞系COMM-1在研究治疗人口 腔黑色素瘤的药物中的用途。

本发明的内容还包括所述的中国人口腔黑色素瘤细胞系COMM-1在制备人口腔黑 色素瘤的药物中的用途。

本发明的内容还包括所述的中国人口腔黑色素瘤细胞系COMM-1在筛选人口腔黑 色素瘤的药物中的用途。

本发明的有益效果为：本发明建立了中国人口腔黑色素瘤细胞系COMM-1，并用该 细胞系实现了肿瘤干细胞的富集，为研究人中国人口腔黑色素瘤的特性及其治疗药物提供 了物质基础。

为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。

附图说明

图1、COMM-1组织HE染色

图2、光镜下观察原代细胞和COMM-1传代细胞系的细胞形态。

图3、透射电镜下观察COMM-1细胞的超微结构图。

图4、琼脂糖凝胶检测COMM-1的MAGE1、S100B、MITF的mRNA的表达情况。

图5、COMM-1细胞染色体核型显微图(a)和染色体个数统计图(b)。

图6、COMM-1细胞的生长曲线

图7、COMM-1细胞的克隆形成

图8、黑色素瘤细胞COMM-1中肿瘤干细胞的富集

图9、肿瘤干细胞干性基因检测

本发明中的一种中国人口腔黑色素瘤细胞系COMM-1保藏于中国典型培养物保藏 中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCC：C201586，其保藏日期为2015年6月8日，保藏地址为武汉大 学。

具体实施方式

【实施例1】口腔黑色素瘤细胞系COMM-1的建立以及特性鉴定

材料说明：

1临床标本

本实验所用的口腔组织取自中山大学附属光华口腔医院手术切除标本。

2主要溶液以及配方

2.1细胞培养

1)10×PBSBuffer:NaCl80g，KCl2g，Na2HPO411.55g，KH2PO42g，加入约800ml 的超纯水，磁力搅拌器充分搅拌溶解，调节pH值至7.4，定容至1L，高温高压灭菌后，室温保 存。

2)胎牛血清(FBS)：购自Hyclone公司，4℃保存，和培养基配成适当比例。

3)10×Trypsin-EDTA(TE):称取1.25gtrypsin，1.00gEDTA溶解于250ml的1× PBS中，过滤除菌，-20℃保存。使用前用1×PBSbuffer稀释成适当浓度消化细胞。

4)F12(DF)培养基：溶解于1L的超纯水中，调节PH值到7.2，利用蠕动泵和0.22μm滤 膜过滤除菌。4℃保存。2×DF分量加倍，水量不变。DF(-)表示不加入Ampicillin和 Kanamycin。

5)鼠尾Ⅰ型胶原：原代培养时，用1×PBS稀释成1％的浓度，每个六厘米的皿上加入 1.5mL覆盖皿底，37℃静止包被30分钟。

6)软琼脂：softagar加超纯水，高温高压灭菌配成0.66％和1.33％。

7)秋水仙素：40μg/mL母液，最终使用浓度为0.2μg/mL。

8)黑色素瘤原代培养液：DF+10％FBS。

2.2核酸电泳

1)50×TAE电泳Buffer(pH8.5)：在1L的玻璃瓶中加入242gTris，18.6g Na2EDTA·2H2O，然后加入约800ml的二级水，充分搅拌溶解，再加入57.1ml的醋酸，充分搅 拌，加二级水定容至1L，室温保存。使用时以1:50稀释。

2)溴化乙锭(EB)：储存液浓度为10mg/ml，工作浓度为0.5μg/ml。

3)1％琼脂糖电泳凝胶：称取1g琼脂糖(agarose)，加入100ml1×TAEbuffer，加 热煮沸至琼脂糖完全溶解，冷至50℃左右，加入5μlEB储存液，使终浓度为0.5μg/ml，摇匀 后灌制凝胶平板。

3方法与结果：

3.1人口腔癌黑色素组织HE染色

1)10％福尔马林或4％PFA固定口腔组织过夜；

2)自动脱水仪上进行脱水：70％乙醇2小时，80％乙醇2小时，95％乙醇30分钟， 95％乙醇30分钟，无水乙醇30分钟，无水乙醇2小时，无水乙醇+TO(1:1)30分钟，TO30分钟， TO2小时，TO+石蜡(1:1)30分钟，石蜡3小时，石蜡2小时。共12桶，16小时；

3)包埋机上用石蜡进行包埋，在切片机上进行切片；

4)组织60℃脱腊，二甲苯5分钟，无水乙醇1分钟，90％乙醇1分钟，80％乙醇1分钟， 70％乙醇1分钟，蒸馏水洗4分钟；

5)苏木素液染色1-2分钟，自来水冲洗10分钟，水溶性伊红染色2-3分钟；

6)脱水，透明和封片：把切片加入70％乙醇30秒，80％乙醇30秒，90％乙醇1分钟， 无水乙醇1分钟，二甲苯5分钟，最后用中性树脂封片。

结果分析：如图1所示，COMM-1组织HE染色切片可见黑色素瘤，肿瘤细胞呈多种形 态，如圆形、多角形和梭形，几种细胞混存；核大小不一，染色质丰富，核仁大而深染，核分裂 相易见，黑色素颗粒可存在与肿瘤细胞及间质内，部分细胞充满黑色素颗粒，为较严重病 变。

3.2人口腔黑色素瘤细胞系COMM-1的建立及形态学观察

3.2.1细胞原代培养及传代培养

采用组织块贴壁法培养剪碎的小块组织，第5天细胞从组织块爬出，生长过程可见 较多成纤维细胞的生长，本研究采用梯度消化和刮除法去除成纤维细胞，多次传代后，待成 纤维细胞比例逐渐下降，黑色素瘤细胞增殖加快，成为比较纯的细胞系，命名为COMM-1细 胞。至今，COMM-1细胞已经传代50次以上，细胞状态稳定。

结果分析：如图2所示，光镜下可见COMM-1细胞呈多种形态，从多角形、梭形到圆 形，细胞大小不一，多数细胞核浆比例大，核仁多而清晰，有丝分裂多。细胞长满培养皿是 聚团叠层生长，形成大小不一的克隆。贴壁性差，5天铺满培养皿，传代比例为1:3。

3.2.2COMM-1细胞超微结构

1)接种细胞于6cm培养皿内，细胞长满后用1xTE消化分散细胞；

2)FBS终止消化，加入完全培养基，900r/min离心5min；

3)细胞团经2.5％戊二醛锇酸固定，包埋，超薄切片，染色，在电镜下观察。

结果分析：如图3所示，透射电镜观察COMM-1细胞形态可见细胞有丰富的小触角突 起，细胞高尔基体正在向胞外分泌小泡，这与细胞代谢旺盛有关。细胞内可观察到高尔基 体、核糖体、内质网和自噬体，细胞核呈异型性，有单核、双核，核仁大小不一，形状不规则， 高尔基体周围分布有膜包绕的黑色素颗粒，线粒体众多。细胞间连接不紧密，松散分布。

3.2.3COMM-1细胞的标志性分子的鉴定

3.2.3.1COMM-1细胞RNA的提取

1)取对数生长期细胞，弃培养液，在培养皿中加入1mlTrizol，用移液器吹打至细 胞裂解完全，将液体吸至1.5ml无酶离心管中；

2)室温放置5分钟使核酸蛋白复合物完全分离，4℃，12000xg离心10分钟，取上 清；

3)每使用1mlTrizol加氯仿0.2ml，剧烈振摇15s，室温静置3min使之分层，4℃，12 000xg离心15分钟；

4)将≤50％的上层水相小心转移至另一个1.5ml无酶干净离心管中；

5)每使用1mlTrizol加0.5ml异丙醇，轻轻混匀，室温静置10分钟，4℃，12000xg 离心10分钟；

6)弃上清，沿壁加入无酶75％乙醇1ml，轻轻混匀；

7)4℃，7500xg离心5分钟，弃上清，将1.5ml离心管倒置，以100μl的微量移液器吸 净剩余的乙醇，晾干，沉淀溶于20～40μl的无RNase水中；

8)取1μl，用紫外分光光度计(Nanodrop)测定A260nm和A280nm，RNA浓度(μg/ml)＝ A260nm×40×稀释倍数；纯度以A260/A280比值表示，达1.8-2.0方能用于实验，－80℃保存 备用。

3.2.3.2RT-PCR逆转录反应(按TOYOBOReverTraAce-α-试剂盒说明书操作)

1)在PCR反应管中按顺序加入：

总RNA1μl(600ng)

10pmol/LOigo(dT)5μl

RNaseFreeH2O6μl

2)65℃作用5min后冰浴1min，置冰上加入：

3)设置PCR仪，42℃、60min，99℃、5min，4℃、hold，置-20℃保存备用。

3.2.3.3PCR(按TOYOBOKOD-Plus-试剂盒说明书操作)

1)在PCR管中按顺序加入：

2)在PCR管中依次加入

不同引物按照各种退火温度、循环数、延伸时间等设置。

结果分析：采用琼脂糖凝胶检测COMM-1中MAGE1、S100B、MITF的mRNA表达情况，结 果如图4所示。RT-PCR检测COMM-1扩增出MAGE1目的片段418bp，S100B目的片段203bp。

3.2.4COMM-1的DNA指纹鉴定

短串联重复序列(shorttandemrepeat,STR)又称微卫星DNA(microsatellite DNA)，是一类广泛存在人类基因组中的DNA多态性基因座。它由2-6碱基对构成核心序列，呈 串联重复排列。STR基因位点长度一般在100-300bp之间，因个体间DNA片段长度或DNA序列 差异而成高度多态性，在基因传递过程中遵循孟德尔共显性方式遗传，可以用于证明本研 究培养的细胞是否由其患者来院。取患者手术切除组织和培养14代的COMM-1细胞送至中山 大学法医鉴定中心提取DNA，进行分析鉴定，结果

如表1所示。

表1COMM-1组织和细胞STR分型结果

COMM-1组织 COMM-1细胞

D19S433 13,14.2 13,14.2 D5S818 11,12 11,12 D21S11 29,32.2 29,32.2 6 -->D18S51 13 13 D6S1043 13 13 D3S1358 17 17 D13S317 8,11 8,11 D7S820 8,11 8,11 D16S539 9 9 CSF1P0 10,11 10,11 Penta D 9 9 Amel X X Vwa 16 16 D8S1179 10,15 10,15 TPOX 8,11 8,11 Penta E 12,21 12,21 TH01 7,10 7,10 D12S391 21 21 D2S1338 19,24 19,24 FGA 18,21 18,21

结果分析：对COMM-1组织块和细胞分别分析了20个位点，包括一个性染色体位点 和19个非性染色体位点，所有短串联重复序列均完全一致，可判断该组织和细胞为同一来 源。

3.2.5染色体核型分析

1)处于对数生长期COMM-1换入含秋水仙素(0.2μg/mL)的培养液，培养2小时；

2)弃掉上清，1×PBS洗皿一次，弃掉1×PBS，胰蛋白酶消化细胞；

3)FBS终止消化之后，1000rpm离心5分钟，去上清；

4)加入预热37℃的KCL溶液(0.075M)处理30分钟(不同细胞时间不同)；

5)加入1mL固定液(甲醇:醋酸＝3:1，现配现用)，吹散打匀，1000rpm离心5分钟， 弃掉上清，加入新鲜固定液，吹散，作用20-30分钟，再1000rpm离心5分钟，弃上清，加入 0.5mL固定液，制成细胞悬液；

6)将细胞悬液在载玻片上方40cm处滴下玻片(泡在30％乙醇液中，4℃冰箱预冷)， 立即吹散，酒精灯烤干；

7)Gimsa原液:1×PBS＝1:9染色20分钟，自来水冲干净。结果如图6所示。

结果分析：如图5a、5b所示，染色体显示异常，其数目在41到84条均有分布，从40到 84设定10个区间，结果显示46到48条染色体最多，近似于二倍体。染色体的非整倍性是肿瘤 遗传不稳定性的表现，除了染色体数目不一外，染色体结构也出现删除、倒置、重复和易位 等异常情况，这些会导致基因的一些重组，丢失不利于肿瘤发展的基因。

3.3COMM-1细胞的生物学特性

3.3.1细胞计数法检测COMM-1细胞的细胞生长曲线和倍增时间

1)取对数生长期的COMM-1细胞，以10000个/ml/孔的细胞浓度接种于24孔板；

2)每24h计数一次，1％胰酶消化后进行细胞计数，连续计数6天；

3)以每天细胞密度均值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制细胞生长曲线。结果如 图7所示。

4)按下述公式计算倍增时间。

TD＝tlog2/(logNt-logN0)

(TD：倍增时间；t:培养时间：Nt:培养t小时后的细胞数；N0:接种后的细胞数)

结果分析：本实验检测了COMM-1细胞的生长曲线如图7所示，在DF+10％FBS的培养 条件下，细胞在前四天增殖缓慢，第五天开始快速增殖，COMM-1细胞的倍增时间是104.43小 时。

3.3.2COMM-1克隆形成能力的检测

1)消化对数生长期的细胞，计数，重悬；

2)取300、500个细胞于六孔板中，加入培养液DF+10％FBS；

3)一周后加液；

5)10天后，用结晶紫染色，拍照，计数克隆数；

结果分析：如图7所示，实验采用平板克隆形成的培养方法，分别在六孔板中种植 300和500个细胞，10天后计数直径大于200微米的克隆，A375由于是传代次数较多的细胞 系，细胞株比较稳定，克隆形成能力强，300和500个细胞在六孔板的克隆形成率分别为59％ 和43.27％，而COMM-1则为8％和8.06％。

3.4COMM-1中肿瘤干细胞的富集及特性鉴定

3.4.1无血清悬浮培养富集COMM-1细胞系中的肿瘤干细胞

1)消化对数生长期的贴壁细胞，计数；

2)重悬细胞并按照3.5×105/6cm皿的比例接种，加入4mlDF+8F培养液，连续观 察；

3)待球囊细胞长至第七天，吹打球囊，40微米滤网过滤收取球囊，400rpm，10min离 心，弃废液；

4)加入TE置于37℃水浴锅消化5min，Ti终止反应；

5)400g，10min离心收细胞；

6)计数，接种细胞于培养皿中。

结果分析：如图8所示，在贴壁的细胞中加入无血清细胞培养液DF+8F，起初细胞生 长变慢，第二天大约有5-10％细胞不再贴壁，形成类似球形悬浮细胞；第四天可见有些细胞 形成致密的细胞簇，形态变圆；第六天细胞不断增殖，已经形成直径大于200微米的克隆，大 小比较均匀，细胞较致密，边缘较整齐，折光性较强，但随着培养时间变长，球囊细胞仍然保 持贴壁状态，当细胞不再增殖时进行球囊传代，连续观察发现第二代球囊细胞呈悬浮生长， 失去贴壁性状，球囊形态比第一代更致密，形态比较稳定。

3.4.2COMM-1球囊干细胞标志物检测

1)待球囊细胞长至第七天，吹打球囊，40微米滤网过滤收取球囊，400rpm，10min离 心，弃废液；

2)加入TE置于37℃水浴锅消化5min，Ti终止反应；

3)400g，10min离心收细胞

4)提取RNA进行RT-PCR检测；

结果分析：用RT-PCR的方法对COMM-1球囊细胞和贴壁细胞进行干细胞标志物 Oct4、ABCB5、CD20、CD271、KDM5B、ABCG2的mRNA检测，如图9所示，COMM-1球囊干细胞基因 KDM5B、ABCB5、Oct4的mRNA表达水平高于贴壁细胞，说明用特殊的无血清培养液处理一定密 度的贴壁COMM-1细胞，可以富集到具有黑色素瘤干细胞特性的细胞侧群。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定 本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在 不脱离本发明构思的前提下，其架构形式能够灵活多变，可以派生系列产品。只是做出若干 简单推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定的专利保护范围。