云杉矮槲寄生害的LAMP检测方法

摘要

本发明涉及云杉矮槲寄生害(Arceuthobium？sichuanense)的分子检测，属于生物技术领域。本发明基于云杉矮槲寄生与其寄主云杉的clpP基因序列差异，通过比对云杉矮槲寄生与其寄主云杉的序列差异性，设计了一组特异性引物(4条)。同时本发明提供了一组检测云杉矮槲寄生害的LAMP引物组序列，还进一步提供了检测云杉矮槲寄生害的检测方法。本发明的引物特异性好，检测方法快速简便，准确性高，为云杉矮槲寄生害的早期诊断及病害防控提供了有效的技术保障。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一组LAMP引物，能够快速检测出寄主体内是否有潜伏侵染的云杉矮槲寄生。

背景技术

天然云杉林在我国西部生态脆弱地区具有无可替代的生态价值，发挥着保持水土和涵养水源等重要生态功能，是我国西部乃至全国生态环境安全的重要保护屏障。云杉矮槲寄生害是目前我国云杉林毁灭性灾害之一，造成三江源地区云杉天然林和次生林的严重病害，在经济和生态环境上带来巨大的损失。仅2003年，在青海省门源县仙米林场就因云杉矮槲寄生害被迫砍伐1.1万立方米的云杉。到2007年，整个青海省的发生面积已达到1.3万公顷。预防与控制云杉矮槲寄生害已成为我国西部乃至全国生态环境安全的重要议题。

云杉矮槲寄生(Arceuthobiumsichuanense)是檀香目、桑寄生科、油杉寄生属的多年生寄生性种子植物，主要分布于我国青海、四川、西藏和甘肃等省(自治区)。云杉矮槲寄生通过种子进行传播，种子萌发产生胚根进行侵染。胚根侵入寄主枝条后，寄生于云杉属树木的枝干上，依靠其内寄生系统与寄主建立寄生关系，建立位于寄主组织内部的内寄生系统。云杉矮槲寄生的内寄生系统可以在寄主体内扩展，从而进行系统侵染，并吸取寄主营养和水分，造成寄主生长畸形，形成丛枝、膨大等症状。侵染严重时，可以直接导致寄主死亡。然而，由于云杉矮槲寄生从侵入寄主到显现症状需要5～8年的潜伏期，因此造成在病害防治过程中不能及时发现病害，延误了云杉矮槲寄生害的有效防治。

随着PCR等分子生物学技术的发展和推广，越来越多的分子检测技术运用到植物病害诊断的过程中。利用PCR检测方法对云杉矮槲寄生的检测已有研究，例如申请号为201410153628.5的发明专利申请公开了一种云杉矮槲寄生的PCR检测引物及其应用和PCR检测方法，该发明涉及一对基于ITS2片段的云杉矮槲寄生PCR快速检测引物，所述引物包括如下基因序列：dwF3：5‘-ACAAACTCATTTTCCCACCACA-3’；dwR3：5‘-ACATTCAAGAAACCTGACACCC-3’。虽然该发明的引物具有检测周期短、操作简单、结果可靠及灵敏度高等优点，可以有效地监测和早期预警云杉矮槲寄生的侵染动态，指导制定科学的病害管理策略，对及时采取有效措施防治云杉矮槲寄生害具有重要意义，但是，基于PCR的检测技术都需要PCR仪等昂贵设备，难以用于基层和现场检测。

环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是针对靶基因上的六个区域设计四条引物，利用链置换型DNA聚合酶在恒温条件下进行扩增反应，可在15-60分钟内实现10⁹-10¹⁰倍的扩增，反应能产生大量的扩增产物即焦磷酸镁白色沉淀，可以通过肉眼观察白色沉淀的有无来判断靶基因是否存在。

LAMP能在等温(60-65℃)条件下，短时间(通常是一小时内)内进行核酸扩增，是一种“简便、快速、精确、低价”的基因扩增方法。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。环介导等温扩增法是一种全新的核酸扩增方法，具有操作简单、快速、特异性强、产物易检测等特点。LAMP技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，不需要PCR仪和昂贵的试剂，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，仅通过肉眼观察即可判断检测结果，检测成本远低于荧光定量PCR，在病原物检测及病害诊断领域具有广泛的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种云杉矮槲寄生害的环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)快速检测方法。运用环介导等温扩增技术检测云杉矮槲寄生害的方法，能够提高检测效率和检测的准确度，本发明针对云杉矮槲寄生质体基因clpP片段中6个区域设计1组引物(含4条特异性引物)，具有特异性高，快速简便等优点。检测时间只需45～60分钟。此外，该方法操作简便，不需要复杂设备，可用于室外及基层单位的现场检测，能够在云杉矮槲寄生侵入寄主云杉的早期进行诊断，提前预防，为有效预防与控制云杉矮槲寄生病害提供科学依据。为治理云杉矮槲寄生病害的最佳防治时机的把握具有重要意义。

为实现本发明的上述目的，本发明应用LAMP方法对云杉矮槲寄生的分子检测方法进行研究，通过对云杉矮槲寄生质体基因clpP片段进行扩增和分析，根据云杉矮槲寄生的clpP基因的序列设计特异性引物，从而建立一种对云杉矮槲寄生稳定、高效、准确、简便的检测方法，本发明的检测方法检测成本低，可以根据对反应液的颜色变化判定是否有云杉矮槲寄生的存在。

本发明一方面提供一种云杉矮槲寄生的LAMP检测引物，LAMP检测引物能对云杉矮槲寄生中的质体基因clpP片段进行扩增，生成云杉矮槲寄生特异性扩增片段。

其中，所述云杉矮槲寄生的LAMP检测引物的核苷酸序列为SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3和SEQIDNo.4。

特别是，所述SEQIDNo.1的核苷酸序列为5’-CAAGGGGCTGATAGTGAA-3’；所述SEQIDNo.2的核苷酸序列为5’-GGATAAAAGATCCCATTGAGG-3’；所述SEQIDNo.3的核苷酸序列为5’-TCCGCCAGGAGAGTTTATAAAAAAAGAATCAACTTATTAGTCTGATGGT-3’；所述SEQIDNo.4的核苷酸序列为5’-GGTCATCCCAGGAGTCGCTACTAAGCCTATACATATAGTCTGTAC-3’。

尤其是，所述SEQIDNo.1的核苷酸序列的引物为上游外部引物；所述SEQIDNo.2的核苷酸序列的引物为下游外部引物；所述SEQIDNo.3的核苷酸序列的引物为上游内部引物；所述SEQIDNo.4的核苷酸序列的引物为下游内部引物。

本发明通过分析云杉矮槲寄生的质体基因clpP的基因序列，设计特异性引物，能够快速、准确地对云杉矮槲寄生进行定性检测，检测结果可靠。本发明的引物可以通过利用本领域技术人员的公知的化学合成方法进行的DNA合成技术得到。本发明人在对相应的植物的clpP基因序列进行测定和比较的基础上，根据云杉矮槲寄生clpP基因序列上的特异碱基位点设计了引物，因此仅对云杉矮槲寄生有扩增信号，而对其寄主材料没有目的扩增信号。

本发明另一方面提供一种云杉矮槲寄生LAMP检测方法，包括如下顺序进行的步骤：

1)提取待测样品中的DNA；

2)以步骤1)中提取的DNA为模板，进行LAMP扩增；

3)分析LAMP扩增产物。

其中，步骤2)中所述LAMP扩增过程中，LAMP反应体系以25μl计为：

特别是，步骤2)中所述LAMP扩增过程中的温度为60-65℃，优选为60-63℃，进一步优选为60℃。

尤其是，步骤2)中所述LAMP扩增的时间为45-90min，优选为45min。

特别是，还包括将温度升高至85℃并载温度为85℃的条件下保持10min，使得BstDNA聚合酶失活。

其中，步骤2)中所述LAMP扩增过程中，LAMP反应体系以25μl计为：

特别是，步骤3)中所述分析LAMP扩增产物为对LAMP扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳检测结果判定样品中是否含有云杉矮槲寄生，如果琼脂糖凝胶电泳检测到LAMP扩增产物，即在琼脂糖凝胶电泳检测到出现梯度条带，则表明待测样品中存在云杉矮槲寄生。

特别是，步骤3)中所述分析LAMP扩增产物为LAMP扩增反应体系的反应液进行显色反应。

尤其是，观察LAMP控制体系反应液的颜色变化，如果反应液颜色为天蓝色，则表示云杉矮槲寄生检测为阳性，表明样品感染云杉矮槲寄生；如果反应液颜色为蓝紫色，则表示云杉矮槲寄生检测为阴性，表明样品未感染云杉矮槲寄生。

本发明又一方面提供一种利用上述LAMP特异性检测引物在检测云杉矮槲寄生中的应用。

本发明再一方面提供一种LAMP检测云杉矮槲寄生的试剂盒，所述试剂盒包括引物SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3和SEQIDNo.4。

其中，所述SEQIDNo.1的核苷酸序列为5’-CAAGGGGCTGATAGTGAA-3’；所述SEQIDNo.2的核苷酸序列为5’-GGATAAAAGATCCCATTGAGG-3’；所述SEQIDNo.3的核苷酸序列为5’-TCCGCCAGGAGAGTTTATAAAAAAAGAATCAACTTATTAGTCTGATGGT-3’；所述SEQIDNo.4的核苷酸序列为5’-GGTCATCCCAGGAGTCGCTACTAAGCCTATACATATAGTCTGTAC-3’。

本发明基于云杉矮槲寄生的clpP基因片段序列差异，设计出可快速、准确检测云杉矮槲寄生的特异性引物，并在此基础上建立了LAMP检测体系，可从发病植物组织中快速、准确地检测出云杉矮槲寄生。根据该方法构建的检测试剂盒操作简便，特异性好，灵敏度高，不需要复杂设备，可用于室外及基层单位的现场检测，对云杉矮槲寄生疫情的早期预警、疫区的病原监测等方面具有重要意义。并且本发明的引物具有检测周期短、操作简单、结果可靠等优点，有助于对云杉矮槲寄生侵染的早期诊断，为病害的预防和控制提供参考。

附图说明

图1为应用本发明云杉矮槲寄生LAMP检测引物进行LAMP扩增后的电泳检测结果；其中：M：DL2000DNAmarker；1.云杉矮槲寄生；2：健康云杉；3.空白对照。

图2为应用本发明云杉矮槲寄生LAMP快速检测引物的LAMP扩增反应体系灵敏度检测结果：其中，M、DL2000DNAmarker；1、1.33×10^-1ng/μl；2、1.33×10^-2ng/μl；3、1.33×10^-3ng/μl；4、1.33×10^-4ng/μl；5、1.33×10^-5ng/μl；6、1.33×10^-6ng/μl；7、空白对照。

图3为云杉矮槲寄生害LAMP检测显色反应结果；其中：1.云杉矮槲寄生；2.健康云杉；3.空白对照。

图4为应用本发明云杉矮槲寄生LAMP快速检测引物进行LAMP扩增的显示反应结果：其中1、健康云杉；2、云杉矮槲寄生；3、可见寄生芽的青海云杉枝条；4、健康云杉枝条+云杉矮槲寄生；5、空白对照。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1引物设计

根据云杉矮槲寄生及其寄主云杉的质体基因clpP的核苷酸序列信息进行分析，选择云杉矮槲寄生特异性的区域设计多对LAMP特异性引物，引物长度一般为引物序列如下：

F3：5’-CAAGGGGCTGATAGTGAA-3’；

B3：5’-GGATAAAAGATCCCATTGAGG-3’；

FIP：5’-TCCGCCAGGAGAGTTTATAAAAAAAGAATCAACTTATTAGTCTGATGGT-3’；

BIP：5’-GGTCATCCCAGGAGTCGCTACTAAGCCTATACATATAGTCTGTAC-3’。

上述引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。

实施例2提取总DNA

1、将采集的云杉矮槲寄生、健康云杉1.0-3.0g，从超低温冰箱中取出后，立即置于预冷的研钵中，加入液氮进行快速研磨成粉末；

2、采用植物基因组提取试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)提取上述样品的基因组DNA，具体如下：

2-1、分别在2只2ml离心管中加入250μlRB1溶液、15μlRnaseA，取上述研磨好的2种粉末各0.1g，分别加入到相应的离心管中，充分混合均匀；

2-2、将离心管置于恒温水浴锅中，于55℃下水浴孵育15分钟；

2-3、将离心管进行离心处理，于4℃，12000rpm下离心5min，轻轻吸取上清于4只干净的离心管中，得到上清液；

2-4、分别向2只装有上清液离心管中加入100μl溶液PB1中，充分混匀后进行冰浴5分钟；然后进行离心处理，12000rpm离心5分钟，轻轻吸取上清于另外2只干净的离心管中，在分别加入375μl溶液BB1，充分混匀；

2-5、将步骤2-4获得的2种混合液分别全部加入到4个吸附柱中，12000rpm离心30秒，弃去流出液；

2-6、向2个吸附柱中分别加入溶液CB1(500μl)，12000rpm离心30秒，弃去流出液；

2-7、向2个吸附柱中分别加入溶液WB1(500μl)，12000rpm离心30秒，弃去流出液；

2-8、再向2个吸附柱中分别再次加入溶液WB1(500μl)，12000rpm离心30秒，弃去流出液；

2-9、12000rpm离心2分钟，彻底去除残留的WB1；

2-10、将2个吸附柱分别置于另外2只干净的离心管中，在2个吸附柱的中央分别加入100μl预热至60℃的ddH₂O，于室温下静置1分钟后，12000rpm离心1分钟，然后洗脱DNA，洗脱获得的DNA于-20℃保存，备用。

实施例3：云杉矮槲寄生LAMP扩增反应

LAMP扩增具体实施步骤如下：

1)在PCR管中加入下列试剂，使总反应体积为25μl：

其中，BstDNA聚合酶为纽英伦生物技术(北京)有限公司生产，dNTP

为北京全式金生物技术有限公司生产。

2)LAMP反应条件如下：

60℃45min

85℃10min

即按照上述体系混合均匀，于60℃条件下，温育45分钟；于85℃，10minBstDNA聚合酶失活。

3)LAMP结果分析

LAMP扩增体系反应45min后，反应体系采用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，其中以ddH₂O为空白对照。检测结果如图1所示，有扩张条带的为阳性，说明待测样品中含有云杉矮槲寄生，无扩增条带的为阴性，说明待测样品中没有云杉矮槲寄生。图中各代号表示为：M、DL2000DNAmarker；1、云杉矮槲寄生；2、健康云杉；3、空白对照。

检测结果表明：仅能从云杉矮槲寄生样品中扩增出特异性条带，不能从其寄主健康云杉中扩增出条带。说明本发明的引物可以作为检测云杉矮槲寄生的LAMP特异性引物。

实施例4：利用本发明引物快速检测感染云杉矮槲寄生方法的灵敏性

将实施例2中提取的云杉矮槲寄生DNA进行10倍梯度稀释，各取1μl作为模板进行LAMP扩增反应，反应体系及条件与实施例3所述LAMP反应体系和反应条件相同；检测方法与实施例3相同。

LAMP产物使用2.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图2，图中各代号表示为：M、DL2000DNAmarker；1、1.33×10^-1ng/μl；2、1.33×10^-2ng/μl；3、1.33×10^-3ng/μl；4、1.33×10^-4ng/μl；5、1.33×10^-5ng/μl；6、1.33×10^-6ng/μl；7、空白对照。

检测结果表明：本发明的引物检测临界值为：1.33×10^-2ng/μl，即0.0133ng云杉矮槲寄生的DNA即可被检测到。

实施例5云杉矮槲寄生LAMP显色扩增反应

LAMP扩增具体实施步骤如下：

PCR管中加入下列试剂，使总反应体积为25μl：

其中，BstDNA聚合酶为纽英伦生物技术(北京)有限公司生产，dNTP为北京全式金生物技术有限公司生产。

2)LAMP反应条件如下：

60℃45min

85℃10min

即按照上述体系混合均匀，于60℃条件下，温育45分钟；于85℃，10minBstDNA聚合酶失活。

3)LAMP结果分析

观察反应管中反应液的颜色变化，其中云杉矮槲寄生反应液为天蓝色，为阳性扩增，说明该样品检测云杉矮槲寄生结果为阳性，而健康云杉和阴性对照样品的LAMP扩增反应管内的反应液的颜色均为紫罗兰色，为阴性扩增，说明健康云杉和阴性对照样品检测云杉矮槲寄生结果为阴性(见图3)。

LAMP扩增产物的凝胶电泳检测结果与LAMP扩增反应体系的颜色反应结果相一致，表明本发明方法可以用于检测云杉矮槲寄生。

实施例6利用本发明引物快速检测感染云杉矮槲寄生方法的可靠性

按照实施例2的方法提取各待测样品(云杉矮槲寄生、健康云杉、可见寄生芽的云杉枝条、健康云杉枝条+云杉矮槲寄生、未见症状的疑似发病云杉枝条)的基因组DNA；

按照实施例5的方法，进行LAMP扩增，反应体系及条件与实施例5所述LAMP反应体系和反应条件相同；检测方法与实施例5相同。

观察反应管中LAMP扩增体系反应液的颜色变化，结果如图4，图中各代号表示为：1、健康云杉；2、云杉矮槲寄生；3、可见寄生芽的青海云杉枝条；4、健康云杉枝条+云杉矮槲寄生；5、空白对照。

检测结果表明：仅能从云杉矮槲寄生样品、可见寄生芽的云杉枝条、人工添加云杉矮槲寄生的样品以及未见寄生芽的疑似发病云杉枝条样品中扩增出体系的反应液的颜色为天蓝色；健康寄主健康云杉、阴性空白对照反应体系的反应液颜色为紫罗兰色，为阴性扩增。结果表明本发明的引物可以作为早期诊断寄主是否被云杉矮槲寄生感染的LAMP特异性引物。而且可以直接通过颜色变化进行判断，肉眼观察直接得出是否被云杉矮槲寄生侵害，不仅操作十分简单，而且对反应仪器要求低，反应检测简单，适合现场、基层快速检测。