一种从甘蔗叶片上分离赤腐病菌的简易方法

摘要

本发明公开了一种从甘蔗叶片上分离赤腐病菌的简易方法，操作步骤：(1)取有甘蔗赤腐病症状的甘蔗叶片，用自来水将甘蔗叶片表面的尘土清洗干净，晾干；(2)将晾干后的甘蔗叶片放入密封容器中再置于温度为25～30℃环境中放置5～7天；(3)挑取放置5～7天后甘蔗叶片赤腐病发病部位长出的白色菌丝，接入培养基中培养；(4)将培养所得菌落边缘菌丝转入新的培养基中25～28℃培养，重复操作1～2次，即得纯化的赤腐病病原菌。本发明方法降低了赤腐病病原真菌分离过程中的能耗和劳动强度，简易、高效地获得目标病原真菌；尤其对于分离大量样本病原真菌，更有效、及时的实现了分离赤腐病病原真菌，大大缩短工作时间，提高了工作效率。

说明书

技术领域

本发明涉及一种病菌的分离方法，特别涉及一种从甘蔗叶片上分离赤腐 病菌的简易方法。

背景技术

赤腐病是甘蔗生产上的一种重要真菌性病害。病原菌主要通过孢子借风 雨、雾、露、昆虫及流水传播，病菌主要由伤口侵入。甘蔗赤腐病可常年发 病，螟虫及飞虱为害重的易发病，冬春甘蔗栽培季节土壤过湿或偏酸，甘蔗 萌芽生长受抑时发病重。甘蔗赤腐病菌常产生变种，形成很多形态小种和生 理小种。因此，明确不同蔗区的生理小种以及优势种，对选育赤腐病抗病甘 蔗品种以及科学防控该病害具有重要的意义。而病原的大量收集是研究该病 害最重要的基础之一。

在我国，甘蔗赤腐病主要发生在叶片中脉上，其病原菌是半知菌亚门镰 孢炭疽菌(ColletotrichumfalcatumWent)。目前关于甘蔗赤腐病菌的分离多采 用传统组织分离方法。常规分离方法对病害组织表面消毒要求严格，分离过 程需全程在无菌条件下进行。常规分离方法的缺陷在于：1)操作过程严格要 求无菌条件，需要准备消毒酒精、无菌水、剪刀、镊子等相关器材；2)较为 耗时，正常情况下，分离一个样本至少需要10～20分钟，对于田间大量采集 样本分离病原十分困难；3)甘蔗叶脉部分高度木质化，无菌条件下对样本组 织的分离切割较为困难；4)植物组织放置在培养基中培养病原菌的过程中容 易受到植物组织中内生细菌的污染而致使病原菌分离失败或降低病原菌分离 的效率。《一种小麦纹枯病菌的分离方法》专利申请公开了对小麦纹枯病菌的 分离方法，该方法需要用到75％酒精对植物组织进行消毒，然后用无菌水洗 涤植物组织表面的酒精；处理3～4个植物组织样本后需更新酒精、无菌水、 装酒精和无菌水的器皿、无菌的镊子、解剖刀以及剪刀等。对于大量分离样 本的病原真菌，需要消耗大量的酒精，同时还需提前准备无菌水和大量无菌 的器皿。无菌水的准备从高温(121℃)灭菌到冷却到可使用的室温至少需要 4个小时。耗时较长，且成本相对较高。《一种分离植物病原真菌的方法》专 利申请，公开了一种对植物病原真菌的分离方法，但是该方法是直接将植物 组织放置在培养基中培养，植物组织中的内生细菌同时也可以在培养基中生 长，且细菌的生长速度通常较真菌的生长速度快，可造成目标病原菌的分离 失败，或分离出来的目标病原真菌容易与细菌混合生长，增加后面的纯化目 标病原真菌的次数，降低分离效率。因此，开发一种分离甘蔗赤腐病菌的简 易方法成为提高病原收集效率的迫切需要。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理 解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术 人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从甘蔗叶片上分离赤腐病菌的简易方法， 从而克服现有技术中对操作环境严格、对病菌分离耗时长、且成本较高的缺 点。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：

一种从甘蔗叶片上分离赤腐病菌的简易方法，包含以下操作步骤：

(1)取有甘蔗赤腐病症状的甘蔗叶片，用自来水将甘蔗叶片表面的尘土 清洗干净，晾干；

(2)将步骤(1)中晾干后的甘蔗叶片放入密封容器中再置于温度为 25～30℃环境中放置5～7天；

(3)挑取步骤(2)中放置5～7天后甘蔗叶片赤腐病发病部位长出的白 色菌丝，接入培养基中25～28℃培养2～3天；

(4)将步骤(3)中培养所得菌落边缘菌丝转入新的培养基中25～28℃培 养2～3天，重复操作1～2次，即得纯化的赤腐病病原菌。

优选的是，步骤(2)中所述甘蔗叶片从发病部位经剪切成片段或从甘蔗 叶片发病部位处折叠后放入温度为25～30℃环境中。

优选的是，所述的密封容器为自封袋或塑料马甲袋。

优选的是，其中所述的每个自封袋或塑料马甲袋只放置一个甘蔗叶片样 本。

优选的是，步骤(3)、步骤(4)中所述培养基为PDA平板培养基，即 马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基。

本发明方法可以一次性同时处理几十个到几百个样品。

虽然甘蔗赤腐病菌主要侵染甘蔗叶片中脉下表皮组织，病斑后期引起中 脉表层组织破裂，在适当的环境下病原菌才有可能从叶脉组织中生长出来， 但发明人发现，发病的叶脉部位经过剪断或者折断后，在本发明方法操作条 件下，剪切口或折伤处较容易长出病原菌菌丝体，经过多次的纯化，可获得 用于植物病理学研究的病原菌。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明方法降低了赤腐病病原真菌分离过程中的能耗，简易、高效地获 得目标病原真菌；尤其对于分离大量样本病原真菌，更有效、及时的实现了 分离赤腐病病原真菌，大大缩短了工作时间，提高了工作效率、降低了工作 强度，同时降低目标病原菌与其他微生物混合生长的几率，减少了纯化病原 菌的次数，也提高了后期纯化目标病原真菌的纯化效率。

附图说明

图1是感染赤腐病的甘蔗叶片。

图2是从甘蔗叶片发病部位长出的病原菌菌丝。

具体实施方式

下面结合具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并 不受具体实施方式的限制。甘蔗叶片样品来自广西农业科学院甘蔗研究所繁 殖场。

实施例1

一种从甘蔗叶片上分离赤腐病菌的简易方法，操作步骤为：

(1)取明显有甘蔗赤腐病症状的甘蔗叶片，用自来水将甘蔗叶片表面的 尘土清洗干净，晾干；

(2)将步骤(1)中晾干后的甘蔗叶片从发病部位剪切成适当大小片段， 放入洁净的自封袋中，密封，每个自封袋放置一个样本甘蔗叶片，避免病原 交叉感染，然后将自封袋放在温度为25℃环境中放置7天，放置期间甘蔗叶 片由于呼吸产生的水分以及温度造成甘蔗叶片保持在一个高温高湿的条件 下，侵染甘蔗叶片的病原菌通过吸收叶片组织的营养，迅速从发病部位的剪 切口产生大量的白色菌丝体；

(3)用洁净的解剖刀挑取步骤(2)中甘蔗叶片赤腐病发病部位长出的 白色菌丝，接入PDA平板培养基中25℃下培养3天；

(4)将步骤(3)中培养所得菌落边缘菌丝转入新的PDA平板培养基中 28℃培养2天，重复操作1次，即得纯化的赤腐病病原菌。

实施例2

一种从甘蔗叶片上分离赤腐病菌的简易方法，操作步骤为：

(1)取明显有甘蔗赤腐病症状的甘蔗叶片，用自来水将甘蔗叶片表面的 尘土清洗干净，晾干；

(2)将步骤(1)中晾干后的甘蔗叶片从发病部位折叠成适当大小片段， 放入洁净塑料马甲袋中，将塑料马甲袋口绑紧并密封，每个塑料马甲袋放置 一个样本甘蔗叶片，避免病原交叉感染，然后将塑料马甲袋放在温度为30℃ 环境中放置5天，放置期间甘蔗叶片由于呼吸产生的水分以及温度造成甘蔗 叶片保持在一个高温高湿的条件下，侵染甘蔗叶片的病原菌通过吸收叶片组 织的营养，迅速从发病部位的折叠口产生大量的白色菌丝体；

(3)用洁净的解剖刀挑取步骤(2)中甘蔗叶片赤腐病发病部位长出的 白色菌丝，接入PDA平板培养基中28℃下培养2天；

(4)将步骤(3)中培养所得菌落边缘菌丝转入新的PDA平板培养基中 25℃培养3天，重复操作2次，即得纯化的赤腐病病原菌。

实施例3

一种从甘蔗叶片上分离赤腐病菌的简易方法，操作步骤为：

(1)取明显有甘蔗赤腐病症状的甘蔗叶片，用自来水将甘蔗叶片表面的 尘土清洗干净，晾干；

(2)将步骤(1)中晾干后的甘蔗叶片从发病部位剪切成适当大小片段， 放入洁净的自封袋中，密封，每个自封袋放置一个样本甘蔗叶片，避免病原 交叉感染，然后将自封袋放在温度为28℃环境中放置6天，放置期间甘蔗叶 片由于呼吸产生的水分以及温度造成甘蔗叶片保持在一个高温高湿的条件 下，侵染甘蔗叶片的病原菌通过吸收叶片组织的营养，迅速从发病部位的剪 切口产生大量的白色菌丝体；

(3)用洁净的解剖刀挑取步骤(2)中甘蔗叶片赤腐病发病部位长出的 白色菌丝，接入PDA平板培养基中26℃下培养3天；

(4)将步骤(3)中培养所得菌落边缘菌丝转入新的PDA平板培养基中 26℃培养2天，重复操作1次，即得纯化的赤腐病病原菌。

本发明的优点是：1)减少酒精、灭菌水等耗材的使用；2)降低劳动强 度，减少了操作的步骤；3)降低目标病原菌与其他微生物混合生长的几率， 减少了纯化病原菌的次数。综合以上几点，本发明相比现有技术尤其适合野 外大量样本病原菌的分离。

一般方法大量采集的甘蔗叶片样本不能及时分离病原菌，室温下，一周 左右叶片表面的微生物容易滋生，造成叶片污染腐烂，大大降低目标病原真 菌的分离效果。如果放置在冰箱或相应低温条件下，可适当延长样本的新鲜 度，但需要具备足够的冰箱或者冷藏空间。本发明方法直接对采集到的甘蔗 叶片经自来水冲洗，大大降低了甘蔗叶片表面的微生物。在具有高温高湿环 境中放置的过程中，只有目标病原真菌为叶片上的优势菌，放置几天之后， 从发病部位生长出来的菌丝相对纯度较高，也减少了分离过程中被细菌污染 的几率。因此，本发明方法同时也提高了后期纯化目标病原真菌的纯化效率。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。 这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述 教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在 于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实 现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。 本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。