李痘病毒主要株系杂交探针及基因芯片的制备方法及检测

摘要

本发明公开了一种李痘病毒主要株系杂交探针及基因芯片的制备方法，所述探针包括：PPV-D；PPV-M；PPV-EA；PPV-Rec；PPV-W；PPV-C。一种基因芯片的制备方法，其特征在于包括以下步骤：制备基因芯片点样；PCR扩增与样品标记；芯片预处理；芯片的杂交；芯片的清洗；芯片的扫描分析；数据处理与结果判定。本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种用于检测李痘病毒主要株系杂交探针；本发明还涉及一种包括上述探针的基因芯片的制备方法。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于李痘病毒主要株系杂交探针，本发明还涉 及一种包括该探针的基因芯片的制备方法，本发明还涉及一种采 用上述基因芯片检测李痘病毒的方法，属于生物技术领域。

背景技术

李痘病毒Plumpoxvirus,PPV是我国2007年颁布的进境植物 检疫性有害生物，是核果类果树危险性最大的病毒之一，属于马铃薯 Y病毒科Potyviridae中的马铃薯Y病毒属Potyvirus，其自然寄主 主要是李属的木本植物，侵染李、杏、桃、樱桃等核果类果树后，使 叶片和果实均受到严重危害，未成熟果实大量脱落，造成果实品质下 降，产量降低。病毒远距离扩散则主要靠感染病毒的植物繁殖材料的 调运。根据病毒的来源和侵染植物的不同，该病毒的目前主要株系有 6个，它们分别为PPV-D,PPV-M，PPV-C,PPV-EA,PPV-W,PPV-Rec， 其中D株系和M株系是目前最主要的流行株系。

广东地处我国的南方开放地区,地理环境优越,每年经过广东辖 区口岸的进出境种子、苗木等容易携带该病毒的材料数量众多,由于 进出境批次多,数量庞大,急需研究出即能保证检测速度快、灵敏度要 高、而且检测通量高的方法,由于苗木带毒率低，只有加大样品的抽 样量才能避免漏检和保证检测率，而对于大量样品的检测，就必须有 检测高通量的仪器设备和方法，本课题就是针对这一病毒检测的要 求，利用基因芯片技术来研究李痘病毒主要不同株系的检测方法，以 便最大限度的提高该病毒的检出率和防止漏检，对保证我国农业生产 可持续健康的发展具有非常重要的意义。

目前无论国外国内，植物病毒的检测方法主要有如下4种：一 是传统的生物学方法，其特点是周期长，准确度低，检测病毒数量少， 劳动强度大，；二是电子显微镜方法，但它只能观察病毒粒体形态， 不能鉴定病毒种类，而且操作复杂，价格十分昂贵；三是酶联免疫吸 附分析法，是目前应用最广的病毒检测方法，但其检测时间长，操作 步骤多，而且需要专用仪器和购买昂贵的特异性抗血清；四是PCR方 法虽然灵敏度非常高且快速，但更需要专用仪器和专业人员，而且检 测通量非常有限。

由于植物病毒的特殊性，即一般种子和苗木带毒率是非常低的， 加上进出境量通常非常之多，如果抽样量过少，则漏检的机率就一定 非常之大，把关作用就会大大消弱；为了最大限度的提高检测率，避 免漏检，就必须加大抽样量，这样就会导致样品众多，不仅会加大检 测的工作量，而且会极大的影响检测速度，推迟通关速度，进而影响 进出境贸易的正常进行，因此急需具有高通量检测的仪器设备和方 法，而基因芯片技术正好适合这一要求。

基因芯片genechip的最早是80年代中期提出的，其本质上仍 然是核酸分子杂交方法，具体系指将大量，通常每平方厘米点阵密度 高于400，探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交， 通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和 序列信息。基因芯片技术由于同时将大量探针固定于支持物上，所以 可以一次性对样品大量序列进行检测和分析，从而解决了传统核酸印 迹杂交SouthernBlotting和NorthernBlotting等技术操作繁杂、 自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足；而且，通过设 计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的 应用价值，如基因表达谱测定、实变检测、多态性分析、基因组文库 作图及杂交测序等。

目前基因芯片技术已经在许多方面得到了广泛的应用，但是在 李痘病毒主要不同株系检测鉴定方面还未见诸报道。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种用于 检测李痘病毒主要株系杂交探针；

本发明还涉及一种包括上述探针的基因芯片的制备方法。

为了达到上述目的，本发明采用以下方案：

一种李痘病毒主要株系杂交探针，其特征在于包括：

PPV-D：5’-CAACAAAACCAGTTTCACAGGTGCCAGGACCTCAACTGCAA-3’

PPV-M：5’-CGGTAAGACCAGTTCCTCCAATTTCAGGGACCAAACCGCGG-3’

PPV-EA：5’-CCACTAGGACAGTGCCTCACACAACAACTACTACACCTCCT-3’

PPV-Rec：5’-CGATAAGACCAGTTTCTCCAATTTCAGGGGCCACACCGCAG-3’

PPV-W：5’-GCGTGAAGCCAACTACATCAGCAACAATTAACCCAACGTCT-3’

PPV-C：5’-ATGTGAGACCGATTGCACCAGTAGTGACAAGTCCATTCTCG-3’。

一种基因芯片的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

A、制备基因芯片点样：

取5ul纯化探针，加点样液5ul混匀，探针浓度为10μm；加到 点样仪，将寡核苷酸探针点在醛基玻片上，并通过探针5’末端的氨 基基团进行共价固定；

其中所述探针包括：

PPV-D：5’-CAACAAAACCAGTTTCACAGGTGCCAGGACCTCAACTGCAA-3’

PPV-M：5’-CGGTAAGACCAGTTCCTCCAATTTCAGGGACCAAACCGCGG-3’

PPV-EA：5’-CCACTAGGACAGTGCCTCACACAACAACTACTACACCTCCT-3’

PPV-Rec：5’-CGATAAGACCAGTTTCTCCAATTTCAGGGGCCACACCGCAG-3’

PPV-W：5’-GCGTGAAGCCAACTACATCAGCAACAATTAACCCAACGTCT-3’

PPV-C：5’-ATGTGAGACCGATTGCACCAGTAGTGACAAGTCCATTCTCG-3’；

B、PCR扩增与样品标记:

B1、感病植物总RNA提取；

称取0.1g感病植物组织样品，然后按照Trizol试剂盒方法提 取样品总RNA；

B2、反转录；

在装有去离子水9.5μL的0.2mLPCR管中，加入B1中提取的样 品总RNA2μL，Oligo(dT)150.5μL，dNTPs1uL，混合均匀，70℃ 水浴5min后立即置于冰上2min，3000rpm离心30秒后加入5×cDNA 第一链合成缓冲液4μL，0.1mol/LDTT1μL，RNase抑制剂1μL，M-MLV 反转录酶1μL，40℃水浴60min；

B3、PCR扩增

在0.2mLPCR管中，加入10×PCR扩增缓冲液2.5μL，dNTPs1μL， Cy3标记的PPV-chip-P11μmol/L，Cy3标记的PPV-chip-P21 μmol/L，反转录合成反应液2μL，加水至25μL，Taq聚合酶0.5μL； 94℃3分钟；94℃40s，55℃40s，72℃1min，循环35次；72℃ 10min；4℃保存；

C、芯片预处理:

点样仪中干燥好芯片于65℃烘箱中固定1h，将芯片点有DNA的 一面在60℃水浴锅上水合10s，芯片距水面距离2-3cm，在空气中室 温自然干燥后，再进行一次水合，之后将点有探针的一面朝上，放在 紫外交联仪中250mJ交联，后再将芯片放在42℃预热的0.5％SDS中 洗涤10min，再用42℃预热的蒸馏水清洗4min，最后用无水乙醇清 洗2min，2000rpm离心5min去除芯片表面的液体后，密封，室温保 存备用；

D、芯片的杂交:

制备好芯片放置在杂交盒中，将标记样品与杂交液的混合物混 匀后，3000rpm，离心30s，于95℃沸水中变性处理3min，冰浴骤冷 1min，然后用移液器将杂交混合液分别加注到杂交芯片的盖片上的小 孔中，使预杂交液覆盖于点样区，然后盖紧杂交盒的盖，放入42℃ 的水浴中，杂交2h，使样品与探针充分混合；

E、芯片的清洗:

杂交结束后，在暗室内取出芯片，杂交面朝上放于清洗盒中，放 在水平摇床上用42℃预热洗液1清洗4min，以便洗去没有与探针特 异性结合的样品；然后迅速地用镊子将芯片转移到盛放有洗液2的清 洗盒中，杂交面朝上，放在水平摇床上用42℃预热洗液1清洗4min， 清洗结束后，1500rpm，1min离心干燥，除去玻璃表面上的液体；

F、芯片的扫描分析

步骤E清洗完毕4小时内进行扫描，利用基因芯片激光共聚焦扫 描仪扫读芯片信息；

G、数据处理与结果判定

扫描后图像将通过判读软件自动进行分析，通过比较分析信号中 位值和信号平均值的输出数据，以其中最能反应本试验芯片杂交图像 信息的参数值进行结果分析，当芯片上呈现绿色信号且HEX质控信号 呈现绿色信号时即可判定阳性反应，对于反应强烈的可以直接从扫描 图片上荧光的反应判断检测结果。

如上所述的一种基因芯片的制备方法，其特征在于步骤D中配制 10uL杂交液包括100％甲酰胺5uL，10％SDS0.2uL,20XSSC1.5uL,PCR 样品标记物3.3uL。

如上所述的一种基因芯片的制备方法，其特征在于步骤F中利用 基因芯片激光共聚焦扫描仪扫读芯片信息的具体步骤：先打开扫描软 件,然后开仓，将芯片插入机器内，关仓，使用绿色荧光通道，先使 用4伪彩进行预扫一次，以便选择扫描区域，再进行精扫，扫描参数 为扫描分辩率为10μm，激发光源波长532nm，接收的荧光信号中心 波长570nm，检测灵敏度小于一个荧光分子/um2，激光功率值Laser Power100％，光电倍增管效率值PMTGain600。

如上所述的一种基因芯片的制备方法，其特征在于步骤B3中所 述PPV-chip-P1的序列：

5’-CCCATTTTCACRCCAGCARC-3’Tm＝61.8；其中R表示碱基 G或者A；

即PPV-chip-P1的序列有四种情况：

1、PPV-chip-P1-1：5’-CCCATTTTCACGCCAGCAGC-3’；

2、PPV-chip-P1-2：5’-CCCATTTTCACGCCAGCAAC-3’

3、PPV-chip-P1-3：5’-CCCATTTTCACACCAGCAGC-3’

4、PPV-chip-P1-4：5’-CCCATTTTCACACCAGCAAC-3’

所述PPV-chip-P2的序列为：

5’-TCGCATGATCCAACAATGGC-3’Tm＝59.8。

如上所述的一种基因芯片的制备方法，其特征在于步骤A中所述 点样的具体做法：按阵列排布的方式点样，点与点的中心距离为 740μm，点的直径为500μm，样品包括探针、定位基因阳性对照、 DMSO阴性对照及三蒸水空白对照，每个样品点20个重复点，每块玻 片点两个重复阵列。

一种采用如上所述的基因芯片检测李痘病毒的方法，其特征在于 包括以下步骤：

对检测样品进行PCR扩增，得到标记有荧光染料的待检测样品的 基因组DNA，然后同基因芯片进行杂交，荧光标记的DNA分子与基因 芯片上相匹配的DNA序列发生杂交反应，使得芯片上的点呈现出荧光 信号；根据探针在芯片上的特定位置排布，通过机器扫描和软件分析 推断出相应被测样品的相关信息，鉴定出被测样品病毒株系的种类。

本发明中采用的材料

1.1材料

1.1.1毒株来源

D(Dideron)株系:Tey(X16415)、PENN2(AF401296)、Fan (AY912056)、Rankovic(M21847)、Skiernevice(S73776)；

M(Marcus)株系:SK68(M92280)、PS(AJ243957)、06(S57405)、 S57404(1768bp)

EA(ElAmar)株系：X56258,AM157175

C(Cheery)株系：Y09851、AY184478、X97398

W(Winona)株系：AY912055

Rec(RecombinantsbetweenDandM)株系：AY028309

以上株系均购自美国GADIA公司，其标准序列来自NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov。

用通用引物对六个株系分别进行PCR扩增，以检测通用引物的实 用性和特异性。

本发明主要内容是首先根据李痘病毒的6个主要株系即D、M、 EA、C、W和Rec株系的基因序列比较，找出它们各自的核酸特殊序 列，然后根据各自的特殊核酸序列设计出检测它们的特异性核酸探 针；并在各自探针两侧设计通用的PCR引物，在引物合成过程中对其 5’端进行荧光标记或在PCR过程中加入荧光标记的dCTP；然后将两 种不同的特异性同时点样在同一张芯片上制成微阵列芯片。对检测样 品进行PCR扩增，即可得到标记有荧光染料的待检测样品的基因组 DNA，然后同含有待检测样品特异探针的微阵列芯片进行杂交，荧光 标记的DNA分子与芯片上相匹配的DNA序列发生杂交反应，使得芯 片上的点呈现出荧光信号。根据探针在芯片上的特定位置排布，通过 机器扫描和软件分析就可以推断出相应被测样品的相关信息，鉴定出 被测样品病毒株系的种类。本项目预期达到的最终目标是研制出一次 同时能够高通量检测李痘病毒主要株系的基因芯片和检测方法。

综上所述，本发明的有益效果：

一、本发明中李痘病毒各主要株系的通用引物能够一次性扩增6 个株系中的任何一个株系，而不需要做多重PCR，标记的扩增片段即 可同芯片进行杂交，不但可以检测出李痘病毒，而且还能够明确是该 病毒的哪个株系，检测结果直观明了，易于判定。

二、本发明基因芯片特异性好，能够正确区分6个株系，而且与 其它植物病毒没有交叉反应。

三、本发明基因芯片的灵敏度高，可达到5pg/μLDNA模板浓度。

附图说明

图1为本发明中PPV不同株系PCR扩增电泳图；其中，M：100bp marker，1.PPVstrainD；2.PPVstrainM；3.PPVstrainEA；4.PPV strainC；5.PPVstrainW；6.PPVstrainRec；7.CK—；图2为本 发明PPVD株系检测结果；图3为本发明PPVM株系检测结果； 图4为本发明PPVC株系检测结果；图5为本发明PPVEA株系检 测结果；图6为本发明PPVW株系检测结果；图7为本发明PPVRec 株系检测结果；图8为芯片灵敏度试验结果，其中A:20pg/μL；B: 10pg/μL；C:5pg/μL；D:2.5pg/μL；图9为李坏死环斑病毒PNRSV 标记PCR扩增；M：100bp分子量标准；1.PNRSV及PPV二重PCR扩 增产物2.PPVPCR扩增产物；3.PNRSVPCR扩增产物，675bp；图 10为应用芯片对植物病毒李坏死环斑病毒的验证检测。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明做进一步描述：

实施例1

一种李痘病毒主要株系杂交探针，包括：

PPV-D：5’-CAACAAAACCAGTTTCACAGGTGCCAGGACCTCAACTGCAA-3’

PPV-M：5’-CGGTAAGACCAGTTCCTCCAATTTCAGGGACCAAACCGCGG-3’

PPV-EA：5’-CCACTAGGACAGTGCCTCACACAACAACTACTACACCTCCT-3’

PPV-Rec：5’-CGATAAGACCAGTTTCTCCAATTTCAGGGGCCACACCGCAG-3’

PPV-W：5’-GCGTGAAGCCAACTACATCAGCAACAATTAACCCAACGTCT-3’

PPV-C：5’-ATGTGAGACCGATTGCACCAGTAGTGACAAGTCCATTCTCG-3’。

实施例2

一种基因芯片的制备方法，包括以下步骤：

A、制备基因芯片点样：

取5ul纯化探针，加点样液5ul混匀，探针浓度为10μm；加到 点样仪，将寡核苷酸探针点在醛基玻片上，并通过探针5’末端的氨 基基团进行共价固定；

其中所述探针包括：

PPV-D：5’-CAACAAAACCAGTTTCACAGGTGCCAGGACCTCAACTGCAA-3’

PPV-M：5’-CGGTAAGACCAGTTCCTCCAATTTCAGGGACCAAACCGCGG-3’

PPV-EA：5’-CCACTAGGACAGTGCCTCACACAACAACTACTACACCTCCT-3’

PPV-Rec：5’-CGATAAGACCAGTTTCTCCAATTTCAGGGGCCACACCGCAG-3’

PPV-W：5’-GCGTGAAGCCAACTACATCAGCAACAATTAACCCAACGTCT-3’

PPV-C：5’-ATGTGAGACCGATTGCACCAGTAGTGACAAGTCCATTCTCG-3’；

B、PCR扩增与样品标记:

B1、感病植物总RNA提取；

称取0.1g感病植物组织样品，然后按照Trizol试剂盒方法提 取样品总RNA；

B2、反转录；

在装有去离子水9.5μL的0.2mLPCR管中，加入B1中提取的样 品总RNA2μL，Oligo(dT)150.5μL，dNTPs1uL，混合均匀，70℃ 水浴5min后立即置于冰上2min，3000rpm离心30秒后加入5×cDNA 第一链合成缓冲液4μL，0.1mol/LDTT1μL，RNase抑制剂1μL，M-MLV 反转录酶1μL，40℃水浴60min；

B3、PCR扩增

在0.2mLPCR管中，加入10×PCR扩增缓冲液2.5μL，dNTPs1μL， Cy3标记的PPV-chip-P11μmol/L，Cy3标记的PPV-chip-P21 μmol/L，反转录合成反应液2μL，加水至25μL，Taq聚合酶0.5μL； 94℃3分钟；94℃40s，55℃40s，72℃1min，循环35次；72℃ 10min；4℃保存；所述PPV-chip-P1的序列：

5’-CCCATTTTCACRCCAGCARC-3’Tm＝61.8；其中R表示碱基 G或者A；

所述PPV-chip-P2的序列为：

5’-TCGCATGATCCAACAATGGC-3’Tm＝59.8。

C、芯片预处理:

点样仪中干燥好芯片于65℃烘箱中固定1h，将芯片点有DNA的 一面在60℃水浴锅上水合10s，芯片距水面距离2-3cm，在空气中室 温自然干燥后，再进行一次水合，之后将点有探针的一面朝上，放在 紫外交联仪中250mJ交联，后再将芯片放在42℃预热的0.5％SDS中 洗涤10min，再用42℃预热的蒸馏水清洗4min，最后用无水乙醇清 洗2min，2000rpm离心5min去除芯片表面的液体后，密封，室温保 存备用；

D、芯片的杂交:

制备好芯片放置在杂交盒中，将标记样品与杂交液的混合物混 匀后，3000rpm，离心30s，于95℃沸水中变性处理3min，冰浴骤冷 1min，然后用移液器将杂交混合液分别加注到杂交芯片的盖片上的小 孔中，使预杂交液覆盖于点样区，然后盖紧杂交盒的盖，放入42℃ 的水浴中，杂交2h，使样品与探针充分混合；

E、芯片的清洗:

杂交结束后，在暗室内取出芯片，杂交面朝上放于清洗盒中，放 在水平摇床上用42℃预热洗液1清洗4min，以便洗去没有与探针特 异性结合的样品；然后迅速地用镊子将芯片转移到盛放有洗液2的清 洗盒中，杂交面朝上，放在水平摇床上用42℃预热洗液1清洗4min， 清洗结束后，1500rpm，1min离心干燥，除去玻璃表面上的液体；

F、芯片的扫描分析

步骤E清洗完毕4小时内进行扫描，利用基因芯片激光共聚焦扫 描仪扫读芯片信息；

G、数据处理与结果判定

扫描后图像将通过判读软件自动进行分析，通过比较分析信号中 位值和信号平均值的输出数据，以其中最能反应本试验芯片杂交图像 信息的参数值进行结果分析，当芯片上呈现绿色信号且HEX质控信号 呈现绿色信号时即可判定阳性反应，对于反应强烈的可以直接从扫描 图片上荧光的反应判断检测结果。

实施例3

一种基因芯片的制备方法，包括以下步骤：

A、制备基因芯片点样：

取5ul纯化探针，加点样液5ul混匀，探针浓度为10μm；加到 点样仪，将寡核苷酸探针点在醛基玻片上，并通过探针5’末端的氨 基基团进行共价固定；

其中所述探针包括：

PPV-D：5’-CAACAAAACCAGTTTCACAGGTGCCAGGACCTCAACTGCAA-3’

PPV-M：5’-CGGTAAGACCAGTTCCTCCAATTTCAGGGACCAAACCGCGG-3’

PPV-EA：5’-CCACTAGGACAGTGCCTCACACAACAACTACTACACCTCCT-3’

PPV-Rec：5’-CGATAAGACCAGTTTCTCCAATTTCAGGGGCCACACCGCAG-3’

PPV-W：5’-GCGTGAAGCCAACTACATCAGCAACAATTAACCCAACGTCT-3’

PPV-C：5’-ATGTGAGACCGATTGCACCAGTAGTGACAAGTCCATTCTCG-3’；

所述点样的具体做法：采用点样机按阵列排布的方式点样，点与 点的中心距离为740μm，点的直径为500μm，样品包括探针、定位 基因阳性对照、DMSO阴性对照及三蒸水空白对照，每个样品点20个 重复点，每块玻片点两个重复阵列。

B、PCR扩增与样品标记:

B1、感病植物总RNA提取；

称取0.1g感病植物组织样品，然后按照Trizol试剂盒方法提 取样品总RNA；

B2、反转录；

在装有去离子水9.5μL的0.2mLPCR管中，加入B1中提取的样 品总RNA2μL，Oligo(dT)150.5μL，dNTPs1uL，混合均匀，70℃ 水浴5min后立即置于冰上2min，3000rpm离心30秒后加入5×cDNA 第一链合成缓冲液4μL，0.1mol/LDTT1μL，RNase抑制剂1μL，M-MLV 反转录酶1μL，40℃水浴60min；

B3、PCR扩增

在0.2mLPCR管中，加入10×PCR扩增缓冲液2.5μL，dNTPs1μL， Cy3标记的PPV-chip-P11μmol/L，Cy3标记的PPV-chip-P21 μmol/L，反转录合成反应液2μL，加水至25μL，Taq聚合酶0.5μL； 94℃3分钟；94℃40s，55℃40s，72℃1min，循环35次；72℃ 10min；4℃保存；所述PPV-chip-P1的序列：

5’-CCCATTTTCACRCCAGCARC-3’Tm＝61.8；其中R表示碱基 G或者A；

所述PPV-chip-P2的序列为：

5’-TCGCATGATCCAACAATGGC-3’Tm＝59.8。

C、芯片预处理:

点样仪中干燥好芯片于65℃烘箱中固定1h，将芯片点有DNA的 一面在60℃水浴锅上水合10s，芯片距水面距离2-3cm，在空气中室 温自然干燥后，再进行一次水合，之后将点有探针的一面朝上，放在 紫外交联仪中250mJ交联，后再将芯片放在42℃预热的0.5％SDS中 洗涤10min，再用42℃预热的蒸馏水清洗4min，最后用无水乙醇清 洗2min，2000rpm离心5min去除芯片表面的液体后，密封，室温保 存备用；

D、芯片的杂交:

制备好芯片放置在杂交盒中，将标记样品与杂交液的混合物混匀 后，3000rpm，离心30s，于95℃沸水中变性处理3min，冰浴骤冷1min， 然后用移液器将杂交混合液分别加注到杂交芯片的盖片上的小孔中， 使预杂交液覆盖于点样区，然后盖紧杂交盒的盖，放入42℃的水浴 中，杂交2h，使样品与探针充分混合；其中配制10uL杂交液包括100％ 甲酰胺5uL，10％SDS0.2uL,20XSSC1.5uL,PCR样品标记物3.3uL。

E、芯片的清洗:

杂交结束后，在暗室内取出芯片，杂交面朝上放于清洗盒中，放 在水平摇床上用42℃预热洗液1清洗4min，以便洗去没有与探针特 异性结合的样品；然后迅速地用镊子将芯片转移到盛放有洗液2的清 洗盒中，杂交面朝上，放在水平摇床上用42℃预热洗液1清洗4min， 清洗结束后，1500rpm，1min离心干燥，除去玻璃表面上的液体；

F、芯片的扫描分析

步骤E清洗完毕4小时内进行扫描，利用基因芯片激光共聚焦扫 描仪扫读芯片信息；具体做法：先打开扫描软件,然后开仓，将芯片 插入机器内，关仓，使用绿色荧光通道，先使用4伪彩进行预扫一次， 以便选择扫描区域，再进行精扫，扫描参数为扫描分辩率为10μm， 激发光源波长532nm，接收的荧光信号中心波长570nm，检测灵敏度 小于一个荧光分子/um2，激光功率值LaserPower100％，光电倍增 管效率值PMTGain600。

G、数据处理与结果判定

扫描后图像将通过判读软件自动进行分析，通过比较分析信号中 位值和信号平均值的输出数据，以其中最能反应本试验芯片杂交图像 信息的参数值进行结果分析，当芯片上呈现绿色信号且HEX质控信号 呈现绿色信号时即可判定阳性反应，对于反应强烈的可以直接从扫描 图片上荧光的反应判断检测结果。

实施例4

一种基因芯片的制备方法，包括以下步骤：

A、制备基因芯片点样：

取5ul纯化探针，加点样液5ul混匀，探针浓度为10μm；加到 点样仪，将寡核苷酸探针点在醛基玻片上，并通过探针5’末端的氨 基基团进行共价固定；

其中所述探针包括：

PPV-D：5’-CAACAAAACCAGTTTCACAGGTGCCAGGACCTCAACTGCAA-3’

PPV-M：5’-CGGTAAGACCAGTTCCTCCAATTTCAGGGACCAAACCGCGG-3’

PPV-EA：5’-CCACTAGGACAGTGCCTCACACAACAACTACTACACCTCCT-3’

PPV-Rec：5’-CGATAAGACCAGTTTCTCCAATTTCAGGGGCCACACCGCAG-3’

PPV-W：5’-GCGTGAAGCCAACTACATCAGCAACAATTAACCCAACGTCT-3’

PPV-C：5’-ATGTGAGACCGATTGCACCAGTAGTGACAAGTCCATTCTCG-3’；

所述点样的具体做法：采用点样机按阵列排布的方式点样，点与 点的中心距离为740μm，点的直径为500μm，样品包括探针、定位 基因阳性对照、DMSO阴性对照及三蒸水空白对照，每个样品点20个 重复点，每块玻片点两个重复阵列。

B、PCR扩增与样品标记:

B1、感病植物总RNA提取；

称取0.1g感病植物组织样品，然后按照Trizol试剂盒方法提 取样品总RNA；

B2、反转录；

在装有去离子水9.5μL的0.2mLPCR管中，加入B1中提取的样 品总RNA2μL，Oligo(dT)150.5μL，dNTPs1uL，混合均匀，70℃ 水浴5min后立即置于冰上2min，3000rpm离心30秒后加入5×cDNA 第一链合成缓冲液4μL，0.1mol/LDTT1μL，RNase抑制剂1μL，M-MLV 反转录酶1μL，40℃水浴60min；

B3、PCR扩增

在0.2mLPCR管中，加入10×PCR扩增缓冲液2.5μL，dNTPs1μL， Cy3标记的PPV-chip-P11μmol/L，Cy3标记的PPV-chip-P21 μmol/L，反转录合成反应液2μL，加水至25μL，Taq聚合酶0.5μL； 94℃3分钟；94℃40s，55℃40s，72℃1min，循环35次；72℃ 10min；4℃保存；所述PPV-chip-P1的序列：

5’-CCCATTTTCACRCCAGCARC-3’Tm＝61.8；其中R表示碱基 G或者A；

所述PPV-chip-P2的序列为：

5’-TCGCATGATCCAACAATGGC-3’Tm＝59.8。

C、芯片预处理:

点样仪中干燥好芯片于65℃烘箱中固定1h，将芯片点有DNA的 一面在60℃水浴锅上水合10s，芯片距水面距离2-3cm，在空气中室 温自然干燥后，再进行一次水合，之后将点有探针的一面朝上，放在 紫外交联仪中250mJ交联，后再将芯片放在42℃预热的0.5％SDS中 洗涤10min，再用42℃预热的蒸馏水清洗4min，最后用无水乙醇清 洗2min，2000rpm离心5min去除芯片表面的液体后，密封，室温保 存备用；

D、芯片的杂交:

制备好芯片放置在杂交盒中，将标记样品与杂交液的混合物混匀 后，3000rpm，离心30s，于95℃沸水中变性处理3min，冰浴骤冷1min， 然后用移液器将杂交混合液分别加注到杂交芯片的盖片上的小孔中， 使预杂交液覆盖于点样区，然后盖紧杂交盒的盖，放入42℃的水浴 中，杂交2h，使样品与探针充分混合；其中配制10uL杂交液包括100％ 甲酰胺5uL，10％SDS0.2uL,20XSSC1.5uL,PCR样品标记物3.3uL。

E、芯片的清洗:

杂交结束后，在暗室内取出芯片，杂交面朝上放于清洗盒中，放 在水平摇床上用42℃预热洗液1清洗4min，以便洗去没有与探针特 异性结合的样品；然后迅速地用镊子将芯片转移到盛放有洗液2的清 洗盒中，杂交面朝上，放在水平摇床上用42℃预热洗液1清洗4min， 清洗结束后，1500rpm，1min离心干燥，除去玻璃表面上的液体；

F、芯片的扫描分析

步骤E清洗完毕4小时内进行扫描，利用基因芯片激光共聚焦扫 描仪LuxScan^TM10K扫读芯片信息；具体做法：先打开LUXSCAN3.0扫 描软件,然后开仓，将芯片插入机器内，关仓，使用绿色荧光通道， 先使用4伪彩进行预扫一次，以便选择扫描区域，再进行精扫，扫描 参数为扫描分辩率为10μm，激发光源波长532nm，接收的荧光信号 中心波长570nm，检测灵敏度小于一个荧光分子/um2，激光功率值 LaserPower100％，光电倍增管效率值PMTGain600。

G、数据处理与结果判定

扫描后图像将通过判读软件CapitalBio自动进行分析，通过比 较分析信号中位值和信号平均值的输出数据，以其中最能反应本试验 芯片杂交图像信息的参数值进行结果分析，当芯片上呈现绿色信号且 HEX质控信号呈现绿色信号时即可判定阳性反应，对于反应强烈的可 以直接从扫描图片上荧光的反应判断检测结果。

实施例5

采用基因芯片检测李痘病毒的方法，包括以下步骤：

对检测样品进行PCR扩增，得到标记有荧光染料的待检测样品的 基因组DNA，然后同基因芯片进行杂交，荧光标记的DNA分子与基因 芯片上相匹配的DNA序列发生杂交反应，使得芯片上的点呈现出荧光 信号；根据探针在芯片上的特定位置排布，通过机器扫描和软件分析 推断出相应被测样品的相关信息，鉴定出被测样品病毒株系的种类。

为了证明本发明基因芯片的特异性和灵敏性，本发明做了以下试 验：

一、基因芯片的特异性试验

将PPV不同的株系PCR标记扩增的PCR产物分别与制备好的芯片 进行杂交，以检测芯片的特异性。

二、基因芯片的灵敏性试验

灵敏度实验是指基因芯片所能检测的最低DNA浓度，取决于目的 基因制备时PCR扩增的灵敏度。本试验将D株系的的标记PCR扩增后 的DNA稀释成以下浓度：20pg/μL、10pg/μL、5pg/μL及2.5pg/μL， 再与杂交液混匀后与检测芯片进行杂交，经荧光扫描仪扫读信号，验 证检测芯片的灵敏度。

三、应用芯片对植物病毒的验证检测

用同样是果树上非常重要的病毒同时也是我国重要的进境检疫 性病毒即李坏死环斑病毒Prunusnecroticringspotvirus,PNRSV 做验证试验材料，采用与李痘病毒样品处理相同的方法，提取其总 RNA，设计其PCR扩增引物并进行5’端标记：PNRSV1： 5’-gatggtttgccgaatttgcaatc-3’,下游引物PNRSV2： 5’-ctagatctcaagcaggtcct-3’，然后做反转录RT，再用荧光标记 的特异性引物做PCR扩增,反应条件：94℃变性3min,然后94℃ 40s,60℃40s,72℃1min,35个循环，然后72℃延伸10min，最后再 与李痘病毒的芯片进行杂交。

四、结果与分析

1、探针的设计与合成：

根据序列比对，设计出各株系特异性探针长度都是41bp，序列 分别如下：5’—3’；探针浓度的测定值如表1所示，其A260:A280 比值都超过1.8，纯度符合实验要求。

PPV-D：5’-CAACAAAACCAGTTTCACAGGTGCCAGGACCTCAACTGCAA-3’

PPV-M：5’-CGGTAAGACCAGTTCCTCCAATTTCAGGGACCAAACCGCGG-3’

PPV-EA：5’-CCACTAGGACAGTGCCTCACACAACAACTACTACACCTCCT-3’

PPV-Rec：5’-CGATAAGACCAGTTTCTCCAATTTCAGGGGCCACACCGCAG-3’

PPV-W：5’-GCGTGAAGCCAACTACATCAGCAACAATTAACCCAACGTCT-3’

PPV-C：5’-ATGTGAGACCGATTGCACCAGTAGTGACAAGTCCATTCTCG-3’。

表1探针浓度的测定

通过对检测靶基因即PCR产物的同源性分析，能够评价一个基因 是否适合用于检测某一种病毒，同时也为杂交反应提供理论依据，是 一个重要的指标。Girke等指出基因序列同源性大于70％～80％可产生 交叉杂交；也有研究指出靶标和探针序列同源性大于等于70％时，即 使在高严谨条件下也会发生交叉杂交现象，使实验失去特异性，而一 致性小于75％的序列间很少或没有交叉杂交。探针的选择是构建检测 芯片最核心的内容之。作为检测探针，必须根据探针在属或种内保守 性及特异性的两大原则来设计，本实验设计的各个探针与同株系PCR 产物即靶标之间的同源性达到95％以上，而与非同株系的靶标之间的 同源性只有39-61％，这样就确保了检测靶基因间不会产生交叉杂交 现象，保证了实验的检测特异性。同源性分析结果表明，本实验所选 用的6个DNA序列片段适合用作构建检测李痘病毒6个主要株系的基 因芯片的探针。

2、用通用PCR扩增引物扩增PPV的6个株系

电泳结果显示用通用PCR引物能扩增出个株系的特异性DNA片 段，如图1，为制备标记靶基因奠定了基础。

3芯片的特异性杂交试验

将PPV不同的株系PCR标记扩增的PCR产物分别与制备好的芯片 进行杂交，结果显示每个株系的探针只与其相同株系的PCR扩增产物 杂交，并显示出强烈的荧光信号，而与其他株系的PCR标记扩增产物 没有任何反应，荧光暗淡。此杂交结果表明，检测芯片具有良好的特 异性，且杂交信号强度好，扫描图像上杂交斑点明显，检测结果目视 即可判定，有利于应用该芯片对植物样品中该病毒进行检测，如图 2-7。

4、芯片的灵敏性试验

将D株系的的标记PCR扩增后的DNA稀释成不同的浓度后杂交表 明在模板DNA浓度在5～20pg/μL范围内，都有明显的杂交信号，杂 交斑点明显；模板DNA浓度为2.5pg/μL时，无杂交信号，SNR为0.40， 信号值小于100，肉眼看不到杂交斑点，表明检测芯片的检测灵敏度 可达到5pg/μL。如图8所示。

5应用芯片对植物病毒的验证检测

首先对李坏死环斑病毒用标记引物做RT-PCR扩增，结果如下图 9.用李坏死环斑病毒扩增标记物与芯片杂交，结果显示除了阳性质控 出现强烈荧光外，没有探针与该病毒的扩增物杂交上，如图10.进一 步表明该芯片具有一定的特异性。