二穗短柄草功能着丝粒抗原多肽及应用

摘要

本发明提供一种二穗短柄草功能着丝粒组蛋白CENH3及应用。首先利用生物信息学序列比对的方法预测得到二穗短柄草CENH3蛋白基因的核苷酸序列，根据该序列编码的氨基酸序列N端的一段特异序列合成一条多肽，用该多肽常规免疫新西兰大白兔，制备抗血清，经过抗原亲和纯化得到CENH3蛋白的抗体。该CENH3抗体可用于免疫染色实验，进行着丝粒的物理定位，亦可用于染色质免疫沉淀（Chromatin？Immunoprecipitation,？ChIP）实验，获得二穗短柄草功能着丝粒功能DNA序列，开展着丝粒基因组遗传图谱与物理图谱的定位，为着丝粒形成与功能行使机制的研究及其人工染色体的构建提供重要的工具和信息。

说明书

技术领域

本发明涉及生物信息学与分子细胞遗传学领域，具体涉及二穗短柄草功能着丝粒 抗原多肽及应用。

背景技术

着丝粒是高等真核生物染色体上重要的功能元件，在细胞有丝分裂和减数分裂过 程中负责染色体的均等分离，从而起到确保遗传物质稳定传递的重要作用。但是由于着丝 粒区域富含重复序列，难以进行测序组装，因此研究相对困难。

随着研究的不断深入，科学家们指出真核生物着丝粒行使功能的区域普遍存在着 一种组蛋白H3的变体，即CENH3，这是一种DNA的包装蛋白，对染色体着丝粒的定位、功能和 遗传起决定性作用，因此将真正意义的着丝粒定义为与着丝粒特异组蛋白结合的染色质区 域，即功能着丝粒区。目前，免疫荧光技术和染色质免疫共沉淀技术是利用CENH3抗体研究 功能着丝粒最好的方法，因此，CENH3基因的鉴定及其特异识别抗体的制备也成为功能着丝 粒研究不可或缺的工具。

但是，CENH3组蛋白与H3组蛋白的氨基酸序列具有高度的同源性，只有在氨基末端 的序列发生变异，所以制备特异识别CENH3组蛋白但又不识别正常H3的抗体相对困难；同 时，CENH3在进化上呈现物种特异性，不同物种具有较大的差异，抗体无法在不同物种间通 用。这些问题一直困扰着相关研究的科学家，也成为物种功能着丝粒定位、DNA序列发掘等 深入研究的屏障。

二穗短柄草是广泛使用的禾本科模式植物，由于特异组蛋白CENH3的抗体制备相 对困难，在二穗短柄草功能着丝粒方面的研究相对落后，因此获得二穗短柄草功能着丝粒 组蛋白CENH3的基因序列，及制备其特异抗体的多肽序列，通过其特异抗体对二穗短柄草开 展功能着丝粒的研究，对于二穗短柄草遗传图谱和物理图谱的构建，以及人工染色体的构 建都有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供二穗短柄草功能着丝粒抗原多肽及应用，获得二穗短柄草 CENH3蛋白的基因序列和由该基因表达得到的氨基酸序列以及得到CENH3蛋白的特异抗体， 然后将该抗体用于免疫荧光实验或染色质免疫共沉淀实验，开展二穗短柄草着丝粒方面的 研究，确定二穗短柄草染色体上功能着丝粒的位置和大小以及序列信息，使得其物理图谱 信息更加全面，同时还能在二穗短柄草基因组的组装方面提供着丝粒方面的信息。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

二穗短柄草功能着丝粒抗原多肽，其氨基酸序列为MARTKRPAIRKSKPQPKKQL。

所述抗原多肽是根据二穗短柄草CENH3蛋白氨基酸序列N端的一段特异序列合成 的一条多肽，二穗短柄草CENH3蛋白氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；编码所述二穗短柄草 功能着丝粒组蛋白CENH3的基因，其核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。

所述的二穗短柄草功能着丝粒抗原多肽用于抗体制备。

首先利用生物信息学序列比对的方法预测得到二穗短柄草CENH3蛋白基因的核苷 酸序列，然后根据该序列编码的氨基酸序列N端的一段特异序列合成一条多肽，再用该多肽 常规免疫新西兰大白兔，制备抗血清，最后经过抗原亲和纯化得到CENH3蛋白的抗体。

1、通过生物信息学软件进行序列比对分析，得到二穗短柄草CENH3蛋白对应的基 因核苷酸序列；

2、根据上述核苷酸序列得到二穗短柄草相应CENH3蛋白的氨基酸序列；

3、根据CENH3蛋白与H3蛋白之间的差异，选取CENH3蛋白氨基酸N端的一段特异序列人 工合成一条多肽，以此多肽作为抗原；

4、将抗原常规免疫2只新西兰大白兔；

5、制备抗血清，获得抗体；

6、经过免疫荧光检测和染色质免疫沉淀所获得的DNA原位杂交实验（ChIP-FISH）检 测，结果显示该抗体特异结合二穗短柄草染色体着丝粒部位，证实该抗体为二穗短柄草功 能着丝粒组蛋白CENH3的抗体。

有益效果

本发明获得的二穗短柄草功能着丝粒组蛋白CENH3的基因序列和由该基因表达得到的 氨基酸序列以及得到CENH3蛋白的特异抗体，经过免疫荧光实验和染色质免疫沉淀所获得 的DNA原位杂交实验（ChIP-FISH），发现只在着丝粒的位置出现了明亮且清晰的信号，表明 本发明所得到的CENH3蛋白的抗体真实且可靠，可以进行后续的使用。

本发明有利于开展二穗短柄草着丝粒方面的研究，可以在后续的研究中通过二穗 短柄草染色质免疫沉淀所获得的DNA原位杂交技术（ChIP-FISH）和染色质免疫沉淀技术相 结合的测序技术（ChIP-seq），获得二穗短柄草功能着丝粒的位置大小以及序列信息，构建 和完善二穗短柄草遗传图谱和物理图谱，从而进一步探讨二穗短柄草着丝粒形成与功能行 使的机制。

附图说明

图1：二穗短柄草CENH3蛋白抗体的免疫荧光实验-A：二穗短柄草细胞有丝分裂中 期染色体，B：荧光信号，C:合成图。

图2：二穗短柄草CENH3蛋白抗体的染色质免疫沉淀所获得的DNA原位杂交实验 （Chip-FISH）-A：二穗短柄草细胞有丝分裂中期染色体，B：荧光信号，C:合成图。从图中可 以看到，本发明获得的抗体产生的荧光信号均在二穗短柄草染色体的着丝粒区域，验证了 CENH3抗体的可用性。

具体实施方式

实施例1：二穗短柄草功能着丝粒组蛋白CENH3序列的获得

根据已知的H3蛋白的序列信息和H3蛋白与CENH3蛋白之间的关系，它们在组蛋白折叠 域有高度的同源性，但在N端有明显的差异，使用BLAST同源性搜索，以二穗短柄草的H3蛋白 序列作为查询序列，在EST数据库中进行同源性搜索比对，找到了二穗短柄草的CENH3蛋白 的全长CDNA，由此得到了二穗短柄草的CENH3蛋白的基因序列以及CENH3的蛋白序列。

实施例2：抗原的选择

根据获得的二穗短柄草功能着丝粒CENH3的蛋白序列，通过生物信息学软件比对CENH3 蛋白序列与H3蛋白序列，得到二穗短柄草CENH3蛋白氨基酸N端的特异序列 （MARTKRPAIRKSKPQPKKQL），采用这一段序列人工合成多肽，经过HPLC和质谱鉴定，该多肽的 纯度在85%以上，并且含量为10-14mg。

实施例3：抗体的制备与评价

1、以上述获得的多肽为抗原。

2、载体偶联，将合成的多肽偶联到蛋白载体上。

3、动物免疫，抗血清制备。免疫2只新西兰大白兔，首先要预采血，然后在第0天用 完全福氏佐剂+抗原，600~800ug/只，进行初次免疫，在第21天用不完全福氏佐剂+抗原， 400~500ug/只，进行第一次加强免疫，在第35天用不完全福氏佐剂+抗原，400~500ug/只， 进行第二次加强免疫，在第42天进行血清检测，所需要的抗血清ELISA效价为1：20000，若效 价达到要求，在第49天采全血，分离抗血清，如达不到要求，在第49天用不完全福氏佐剂+抗 原，200ug/只，进行第三次加强免疫，在第56天进行血清检测，若效价达到要求，第63天采 全血，分离抗血清。

4、抗原亲和纯化，每抗体纯化一只兔子30ml抗血清。得到的抗体经SDS-PAGE检测 纯度在90%以上。

为了进一步确定该抗体能够特异的识别二穗短柄草的CENH3蛋白，我们进行了该 抗体蛋白的免疫荧光实验和染色质免疫共沉淀所获得的DNA原位杂交实验（ChIP-FISH）， 结果显示，在二穗短柄草根尖细胞内，每条染色体的着丝粒区都出现了明亮且清晰的信号， 其中中期染色体共有10对信号（见附图），从而证实了该抗体确实能够特异地识别CENH3蛋 白，也证实了本发明的抗原多肽确实能够产生特异的抗体，在后续的研究中，可以通过免疫 染色实验，进行二穗短柄草染色体着丝粒的定位和大小的确定，同时构建和完善二穗短柄 草的遗传图谱和物理图谱。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与 修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCELISTING

<110>福建农林大学

<120>二穗短柄草功能着丝粒抗原多肽及应用

<130>3

<160>3

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>477

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

atggcccgcacgaagcgcccggccatcaggaagtcgaagccgcagcccaagaagcaactc60

cagttcgagcgcacaggcggcgcgagcacctcggcgtcggcgaccccggggagacgtgga120

ggccggaccccggcgcgagcggcgggtcaagcggcacccgcacaacagaagccgaagaag180

ccacacagattccgggcaggcacggtggcgctgcgggagatcaggaagtaccagaaatcc240

cctgagctgctcatcccattcgcacccttcgtccgtctgattaaggagatcagtaatttc300

tactcacctgagatctcgcgctggactcctcaagctctcgttgctttgcaagaggctgca360

gaataccacttggtaaacatatttgaaaaggcaaattactgtgccatccatgcgaagcgt420

gttaccatgatgcaaaaggacatacagcttgcgaggcgtatcagtgggcacaggggg477

<210>2

<211>159

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

MetAlaArgThrLysArgProAlaIleArgLysSerLysProGlnPro

151015

LysLysGlnLeuGlnPheGluArgThrGlyGlyAlaSerThrSerAla

202530

SerAlaThrProGlyArgArgGlyGlyArgThrProAlaArgAlaAla

354045

GlyGlnAlaAlaProAlaGlnGlnLysProLysLysProHisArgPhe

505560

ArgAlaGlyThrValAlaLeuArgGluIleArgLysTyrGlnLysSer

65707580

ProGluLeuLeuIleProPheAlaProPheValArgLeuIleLysGlu

859095

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100105110

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<212>PRT

<213>人工序列

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151015

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20