鸡传染性法氏囊病超强毒DF-1细胞适应株及其应用

摘要

本发明提供鸡传染性法氏囊病超强毒DF-1细胞适应株及其应用。所述鸡传染性法氏囊病超强毒DF-1细胞适应株命名为IBDV-LY23株，保藏编号为CGMCC？No.11594。该毒株可在DF-1细胞上连续传代培养，TCID

说明书

技术领域

本发明涉及动物病毒学领域，具体地说，涉及鸡传染性法氏囊病超强毒DF-1细胞适应株及其应用。

背景技术

鸡传染性法氏囊病(InfectiousBursalDisease,IBD)，是由法氏囊病毒(IBDV)引起的鸡的一种高度接触性传染病。法氏囊病病毒属于双RNA病毒科，禽双RNA病毒属。法氏囊病毒有两个血清型，Ⅰ型法氏囊病毒对鸡有致病力，Ⅱ型病毒对鸡无致病力。该病于1979年传入我国并开始大面积流行，随着法氏囊疫苗的应用，该病得到了一定程度的控制，但根据流行病学调查结果显示，近些年来该病呈现出新的流行特点：发病日龄明显变宽，最早有3日龄发病的报道，最长可延长到200日龄的产蛋鸡，而且高日龄鸡群患传染性法氏囊病有形成区域性爆发的报道；发病率和病死率都有所提高，而且发病鸡群多为免疫鸡群，这一特点说明，I型病毒存在变异株和超强毒株(vvIBDV)，能突破传统疫苗的保护。鸡血液中传统疫苗株高滴度的抗体并不能完全抵抗vvIBDV的攻击。临床症状与经典毒株相同，病变更严重，可使法氏囊、胸腺、脾脏和骨髓严重损伤；IBDV的感染力有所增强，传播途径增多，IBDV在体内及外环境中存活时间延长，对外界各种理化变化的抵抗能力有所增强，致使本病的传播途径增多，可通过消化道和呼吸道及其他各种形式接触感染；继发或并发感染严重，由于法氏囊是中枢免疫器官，因此感染传染性法氏囊病后能造成机体不同程度的免疫抑制，使鸡群生长发育产生不同程度的受阻；此外由于环境卫生差，饲养管理混乱，饲料营养价值不全，会造成大肠杆菌、支原体、球虫病等严重继发或并发，给诊断和治疗增加了难度，使死亡率增加。针对这种情况，分离最新的法氏囊超强毒流行毒株，筛选、培育出免疫原性好、且可以适应细胞系繁殖的种毒，应用于规模化生产，研制生产实际需要的IBD疫苗产品对于该病的预防和控制具有极其重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供鸡传染性法氏囊病超强毒DF-1细胞适应株(即鸡传染性法氏囊病病毒IBDV-LY23株)及其应用。

为了实现本发明目的，本发明人从山东临沂地区发生疑似IBD疫情的鸡场采集出现典型症状和病理变化的病鸡法氏囊、脾脏组织，经标准化方法处理后，分离得到CK/SD/LY/2014株。对该分离株进行了致病性试验，克隆其主要保护性抗原基因VP2，并进行了序列分析和比较。结果表明，该分离株VP2基因具有222A、242I、279D、256I、284A、294I和299S等超强毒株特征性氨基酸，与疫苗株B87、D78核苷酸酸同源性为94.9％、95.1％，与欧洲标准超强毒UK661株核苷酸同源性为97.6％，氨基酸同源性为99.6％。其对SPF鸡胚半数致死量(ELD₅₀)为10^7.17/0.2ml，以10⁴ELD₅₀/只的剂量接种4周龄SPF鸡，死亡率达90％。从而证实传染性法氏囊病病毒CK/SD/LY/2014为一株符合欧洲超强毒标准和特点的国内超强毒株。

该CK/SD/LY/2014株经鸡胚盲传5代后，又经鸡成纤维细胞DF-1连续传代15代，结果表明病毒在细胞上稳定地大量增殖，病毒对10日龄SPF鸡胚的ELD₅₀为10^6.38/0.2ml，细胞半数感染量(TCID₅₀)为10^8.5TCID₅₀/ml。进而筛选得到本发明的鸡传染性法氏囊病超强毒DF-1细胞适应株，命名为IBDV-LY23株，分类命名为：鸡传染性法氏囊病病毒，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCCNo.11594，保藏日期2015年11月19日。

将本发明的鸡传染性法氏囊病超强毒DF-1细胞适应株IBDV-LY23以同步接毒的方式进行批量培养，收获病毒，将其灭活后制备成疫苗，免疫鸡体后经检测具有良好的免疫原性，对超强毒IBD/SD/LY/2014的致死性攻击，具有100％的保护率。与国内外部分同类疫苗进行的比较研究中，本超强毒灭活苗抗体阳性率、抗体滴度及对超强毒的保护率，在参与比较的疫苗中，均居于首位。

本发明还提供所述鸡传染性法氏囊病超强毒DF-1细胞适应株在制备鸡传染性法氏囊病疫苗中的应用。

前述的应用，将IBDV-LY23株的灭活病毒液与佐剂按一定比例混合即得鸡传染性法氏囊病疫苗。

其中，所述IBDV-LY23株优选用β-丙内酯灭活。所述佐剂为MONTANIDEISA71VG。

进一步地，前述应用具体为：将IBDV-LY23株用β-丙内酯灭活，将灭活病毒液与MONTANIDEISA71VG按照重量比3:7混合，经乳化得到所述疫苗。

本发明还提供一种预防鸡传染性法氏囊病的疫苗组合物，所述疫苗组合物的有效成分包含灭活后的鸡传染性法氏囊病超强毒DF-1细胞适应株。

本发明提供的鸡传染性法氏囊病超强毒DF-1细胞适应株IBDV-LY23可在DF-1细胞上连续传代培养，TCID₅₀达到10^8.5/mL，将其灭活后制备成疫苗，免疫鸡体后经检测具有良好的免疫原性，对超强毒IBD/SD/LY/2014的致死性攻击，具有100％的保护率，同时安全性高、效力稳定、持续期长。可将本发明的毒株IBDV-LY23作为疫苗株预防鸡传染性法氏囊病，对预防、控制鸡传染性法氏囊超强毒流行具有重要的价值。

附图说明

图1为本发明实施例2中CK/SD/LY/2014株VP2基因的RT-PCR检测结果；其中，M为Trans2KplusMarkerS：1为VP2基因的RT-PCR产物。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1传染性法氏囊病毒CK/SD/LY/2014株分离与鉴定

2014年8月，山东临沂地区某鸡场发生疑似IBD疫情，无菌采集出现典型症状和病理变化的病鸡法氏囊、脾脏组织，剪碎研磨，称重量后分别按照1:3的重量比加入灭菌的PBS，4℃、6000r/min离心10min，4℃、8000r/min离心10min，取上清液转入另一无菌1.5ml离心管中，加入双抗(终浓度为青霉素2000IU/ml，链霉素2mg/ml)，37℃作用1h，经尿囊膜接种10日龄SPF鸡胚各5枚，0.2mL/枚。弃去24h内死亡的鸡胚，以后每隔6h观察1次，收取死亡鸡胚，至144小时取出所有鸡胚尿囊膜及胚体，组织捣碎，用含青链霉素的无菌PBS做2倍稀释，记为E1代，留样检测，病毒分离物置于-70℃保存。

琼脂扩散试验(AGP)：

将上述E1代病毒离心取上清液与IBD标准阳性血清进行琼脂扩散试验，并设标准抗原与标准阳性血清对照孔，在37℃温箱中放置24h后观察结果。约36h，E1代病毒上清液与标准阳性血清孔之间出现了乳白色清晰沉淀线，与阳性对照组相同，而阴性对照组无沉淀，结果表明IBDV阳性。将其命名为CK/SD/LY/2014株。

实施例2传染性法氏囊病毒CK/SD/LY/2014株生物学特性测定

鸡胚接种试验：

用绒毛尿囊膜(CAM)接种法将上述E1代病毒上清液按每胚0.2mL接种于10枚9～10日龄SPF鸡胚，设等剂量的无菌PBS液为阴性对照组。置37℃孵化箱继续孵化，每12h照蛋检查1次，弃掉24h内死亡胚，记录鸡胚死亡和病变情况，接种观察至144h后，收取所有存活鸡胚并观察病变。鸡胚在接种后48～72h内死亡，死亡胚尿囊膜增厚，腹部肿胀，剖检可见，鸡胚肝脏黄色变性，并伴有斑驳状坏死，与IBDV所致病变相符。

RT-PCR检测：

利用核酸抽提试剂盒提取IBDV核酸，按照Promega公司AMV反转录酶产品说明书进行RT-PCR检测和VP2基因扩增。经过RT-PCR扩增，电泳后出现1条约1300bp大小的条带，符合预期大小(图1)。对分离毒株VP2基因核苷酸序列及相对应的氨基酸序列进行分析，结果表明该分离株VP2基因具有222A、242I、279D、256I、284A、294I和299S等超强毒株特征性氨基酸，与疫苗株B87、D78核苷酸酸同源性为94.9％、95.1％，与欧洲标准超强毒UK661株核苷酸同源性为97.6％，氨基酸同源性为99.6％。

CK/SD/LY/2014株VP2第212位氨基酸发生突变(D→N)，IBDV流行株在VP2上的212位氨基酸的变异(D→N)是近年来国内IBDV新分离株的显著特点。

致病力测定：

鸡胚半数致死量(ELD₅₀)的测定：

将E1代病毒上清液，经绒毛尿囊膜(CAM)途径接种10日龄SPF鸡胚，按10倍递进稀释，取10^-4～10^-10共7个稀释度，每个稀释度接种5枚鸡胚，接种剂量为0.2mL/枚，在37℃孵化箱继续孵化，弃掉24h内死亡的鸡胚。以后每日照胚12h照蛋1次，观察至168h，详细记录各组鸡胚死亡情况及胚体病变，根据Reed-Muech计算尿囊膜悬液中病毒的ELD₅₀为10^7.17/0.2mL(表1)。

表1CK/SD/LY/2014株病毒滴度测定

鸡体回归试验：

将30只4周龄SPF鸡随机分成两组，一组20只，经口接种E1代病毒上清液，每只0.2mL(10⁴ELD₅₀)，另一组10只，相同途径接种等量的灭菌PBS做为正常对照组。接种后每天观察各组鸡临床表现，对病死鸡进行剖检，并记录死亡数量及病理变化。

接种后2d鸡开始发病，鸡群发病率达到100％，病鸡羽毛蓬松，采食减少，扎堆，精神萎靡。接种后3d开始陆续死亡，其死亡高峰在接种后3d～4d，死亡率达到91.67％。剖检可见法氏囊肿胀，内有干酪样物质或血块，多数法氏囊呈“紫葡萄状”，腿部、胸部肌肉有出血，肾脏肿胀且有尿酸盐沉积。对照组均正常(表2)。

表2CK/SD/LY/2014分离株对4周龄SPF鸡的致病性试验

实施例3细胞适应株的筛选及鉴定

将E1代CK/SD/LY/2014病毒液用鸡胚盲传至E5代。将DF-1细胞按照3×10⁵/孔的剂量铺于6孔板，将E5代病毒液用DMEM进行10倍梯度稀释至10^-4～10^-8。将长至单层的DF-1细胞用不含血清的DMEM冲洗2遍，然后将稀释好的病毒液接种于DF-1细胞，每个稀释度接种3孔，0.3mL/孔，37℃吸附1.5h，倾弃剩余病毒液。之后加铺约3mm厚的第一层营养琼脂,置CO₂培养箱，37℃，5％CO₂条件下倒置培养48h后(待细胞出现病变时)加铺第二层含0.01％中性红的营养琼脂，37℃，5％CO₂条件下避光倒置培养。待蚀斑形成后用滴头吸出，连同琼脂糖一起放入0.5mL的无血清DMEM中，反复冻融3次，使病毒充分释放。如此反复将病毒株经3次纯化后，挑取5个蚀斑，分别接种于单层DF-1细胞进行病毒扩繁。测定扩繁病毒的病毒含量，选择病毒含量最高的蚀斑毒作为基础种毒F1代，通过DF-1细胞连续传至F15代，命名为IBDV-LY23。

无菌检验：

将F15代病毒液用硫乙醇酸盐培养基(TG)及酪胨琼脂(GA)(按照《中国兽药典》附录方法)检测，结果显示无菌落生长，说明所述病毒液中不含细菌。

将F15代病毒液用葡萄糖蛋白胨培养基(GP)(按照《中国兽药典》附录方法)检测，结果显示无菌落生长，说明所述病毒液中不含霉菌及腐生菌。

特异性测定：

将收获的F15代病毒液用无菌PBS稀释至10⁴ELD₅₀/0.1ml，与等量的抗鸡法氏囊特异性血清混合，在37℃中和60分钟后，接种长满单层DF-1细胞的六孔板，0.2mL/孔，同时设定接毒对照组10⁴ELD₅₀/0.1ml，0.1mL/孔，阴性对照组无菌PBS，0.1mL/孔。接种后37℃培养168小时，每天观察细胞病变情况。中和组、阴性对照组无细胞病变，接毒组所有孔全部出现典型病变，说明该毒株为鸡传染性法氏囊病病毒，具有特异性，命名为鸡传染性法氏囊病病毒IBDV-LY23株。

鸡胚半数致死量(ELD₅₀)的测定：

将F15代病毒上清液，经绒毛尿囊膜(CAM)途径接种10日龄SPF鸡胚，按10倍递进稀释，取10^-4～10^-10共7个稀释度，每个稀释度接种5枚鸡胚，选取每胚0.2mL，在37℃孵化箱继续孵化，弃掉24h内死亡的鸡胚。以后每日照胚12h照蛋1次，观察至168h，详细记录各组鸡胚死亡情况及胚体病变，最后根据Reed-Muech计算每0.2mL尿囊膜悬液中病毒的ELD₅₀。根据鸡胚死亡情况，利用Reed-Muech法计算出每0.2mL尿囊膜悬液中病毒的ELD₅₀达10^6.38(表3)。

表3鸡胚半数致死量(ELD₅₀)测定

IBDV-LY23株细胞半数感染量(TCID₅₀)测定：

将F15代病毒液倍比稀释，取10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9共5个稀释度，分别接种96孔细胞板上的单层DF-1细胞，由最高稀释度开始接种，每个稀释度接种8孔，置37℃孵育144小时后，逐孔观察细胞病变，以接种细胞出现典型病变判为感染，按照Reed-Muench方法计算病毒含量。结果显示F15代种毒病毒含量为10^8.5TCID₅₀/mL。

外源病毒检测：

将收获的F15代病毒液用无菌PBS稀释至10⁴ELD₅₀/0.1ml，与等量的抗鸡法氏囊特异性血清混合，在37℃中和60分钟后。取10日龄SPF鸡20只，以滴鼻、点眼的途径进行接种，每只鸡接种0.2mL，21天后，按上述方法和剂量重复接种1次。第1次接种后42日采血分离血清，分别使用血凝抑制(HI)、琼扩(AGP)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、中和试验(VN)、免疫荧光(IFA)等方法，检测血清中鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)、鸡马立克病毒(MDV)、鸡新城疫病毒(NDV)、禽网状内皮组织增殖症病毒(REV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、禽流感病毒(AIV)、禽白血病病毒(ILV)、鸡传染性喉气管炎病毒(LTV)、禽脑脊髓炎病毒(AEV)、鸡痘病毒(POX)的抗体阳性率。血清中除检测到传染性法氏囊病毒抗体外，无其它病毒抗体，证明种毒纯净，无其它外源病毒的污染。使用SPF鸡进行实验，结果可靠。

表4外源病毒血清学检验结果

对SPF鸡的毒力测定：

将15只4周龄SPF鸡随机分成两组，一组10只，经口接种E1代病毒上清液，每只0.2mL(10⁴EID₅₀)，另一组5只，相同途径接种等量的灭菌PBS做为正常对照组。接种后每天观察各组鸡临床表现，对病死鸡进行剖检，并记录死亡数量及病理变化。

接种后2d鸡开始发病，鸡群发病率达到100％，病鸡羽毛蓬松，采食减少，扎堆，精神萎靡。接种后3d开始陆续死亡，其死亡高峰在接种后3d～4d，死亡率达到90.00％。剖检可见法氏囊肿胀，内有干酪样物质或血块，多数法氏囊呈“紫葡萄状”，腿部、胸部肌肉有出血，肾脏肿胀且有尿酸盐沉积。对照组均正常(表5)。

表5CK/SD/LY/2014分离株对4周龄SPF鸡的致病性试验

实施例4灭活疫苗的制备

病毒液效价TCID₅₀≥10⁵/mL可用于配制疫苗。经终浓度为1:2000的β-丙内酯4℃作用24h，37℃作用2h，获得灭活病毒液。将灭活病毒液与MONTANIDEISA71VG按照重量比为3:7混合，经乳化得到IBDV-LY23株疫苗。疫苗无菌检验按2010版《中国兽药典》进行。

安全检验：21日龄SPF鸡20只，10只各颈背部皮下注射疫苗1mL，另10只作对照，相同条件饲养，观察15日后进行剖检。疫苗接种部位组织、法氏囊和各脏器均无眼观病理变化。

最小免疫剂量测定：

用IBDV-LY23株疫苗分别以0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL/只接种21日龄SPF鸡各10只，另5只接种灭菌PBS作为阴性对照。免疫后7、14、21、28天分别采集血清，检测抗体。免疫后28天以10⁴EID₅₀超强毒IBD/SD/LY/2014进行攻毒，以攻毒保护率确定最小免疫剂量。结果显示免疫后7～14天产生抗体，免疫剂量为0.3mL、0.4mL、0.5mL免疫后14天抗体阳性率达100％，免疫后28天攻毒保护率达100％，对照组鸡只攻毒后全部死亡。因此，该灭活疫苗的最小免疫剂量为0.3mL/只(表6)。

表6不同接种剂量的攻毒保护试验

同类疫苗免疫效果比较试验：

取21日龄SPF鸡70只，分为4组，A、B、C组为免疫组，A、B组分别为农业部已批准的传染性法氏囊灭活疫苗株VNJ0Z、HQ免疫组，C组为IBDV-LY23株灭活疫苗免疫组、每组20只，D组10只。A、B组按照产品说明书进行免疫，C组每只鸡颈背部皮下免疫0.5ml，D组每只鸡颈背部皮下免疫0.5ml无菌PBS。免疫后7、14、21天，采血分离血清，测定鸡传染性法氏囊病病毒抗体，免疫后21天后用超强毒IBD/SD/LY/2014(含10⁴ELD₅₀/只)病毒液经口攻毒，连续观察72小时，记录发病和死亡情况，72小时后全部扑杀，检查法氏囊病变。结果显示，IBDV-LY23株灭活疫苗组，抗体滴度均高于同类疫苗组，并且能很好的抵御超强毒流行株的攻击(表7)。

表7同类疫苗免疫效果比较试验

免疫持续期测定：

取21日龄SPF鸡150只，120只接种IBDV-LY23株灭活疫苗，0.5mL/只，30只为阴性对照，接种0.5mL灭菌PBS。免疫后14、28、42、56、70、98天分别采血分离血清，测定鸡传染性法氏囊病病毒抗体，采血后取10只用超强毒IBD/SD/LY/2014(含10⁴ELD₅₀/只)病毒液经口攻毒，测定保护率。结果表明，免疫后14天抗体阳性率达85.00％，超强毒攻毒保护率达10/10，28天以后，抗体阳性率达93.30％，攻毒保护率达10/10，免疫后42天抗体阳性率达96.67％，攻毒保护率达10/10，可持续至70天，免疫后98天，抗体滴度、阳性率和保护率有所下降，对照组鸡只全部发病，均出现典型法氏囊感染症状。结果显示，IBDV-LY23株灭活疫苗抗体持续期长，可以提供有效的保护，能够抵御IBD/SD/LY/2014超强毒的攻击(表8)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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