具有广谱拮抗土传病原菌功能的芽孢杆菌M29及其应用

摘要

本发明公开了一株具有广谱拮抗土传病原菌功能的芽孢杆菌M29及其应用。该芽孢杆菌M29，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC？NO.11557，保藏日期为2015年10月29日。同时，该菌产生的挥发性物质也能有效拮抗木霉、烟曲霉、黄瓜枯萎、棉花枯萎、甜瓜枯萎、草莓根腐、桃溃疡、大丽轮枝、水稻纹枯等病原真菌。该菌株产挥发性质可不接触抑制真菌，在水果蔬菜保鲜领域有重要的应用价值。其具有易保存，可大量生产，防效好，环境安全性好等优点，具有良好的商业应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种微生物，具体地说涉及具有广谱拮抗土传病原菌功能的芽孢 杆菌M29及其应用。

背景技术

植物病害的生物防治是指通过除人以外的一种或多种生物来降低病原物数 量或减弱病原的致病活力，从而减少病原物所致病害的发生。蚯蚓粪中具有丰富 的有益微生物，能够有效拮抗土传病原真菌。据报道拮抗微生物可通过与病原菌 的抗生作用、竞争作用、重寄生作用及诱导植物产生系统抗性等机理来抑制病原 菌，达到防治植物病害的目的。此外，拮抗微生物对环境安全，不会像化学农药 那样造成环境污染以及对人畜的毒害，同时拮抗微生物不易使病原菌产生耐药 性，有些还具有促进植物生长的作用，且实际生产工艺简单，因此利用拮抗微生 物防治病害的研究正越来越受到国内外科研机构的重视。目前，人们已经分离到 多种对各种不同植物病害有不同程度防治效果的拮抗微生物，其中有些己经进入 实际应用阶段，产生了相当的社会效益和环境效益。

微生物在生长过程中能够产生一系列小分子挥发性化合物抑制植物病原菌 的生长。据报道，这些化合物主要有醛类、酮类、醇类和硫化物等。目前已报道 的能够产生挥发性物质的微生物主要有芽孢杆菌、假单胞杆菌、链霉菌等。这些 挥发性物质不仅能够抑制植物病原菌的生长，有些还具有诱导抗性和促生长的作 用。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供具有广谱拮抗土传病原菌功 能的芽孢杆菌M29。

本发明的另一目的是提供该芽孢杆菌的应用。

本发明的又一目的是提供该芽孢杆菌产生的挥发性物质的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一株具有广谱拮抗土传病原菌功能的芽孢杆菌M29，保藏于中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.11557，保藏日期为2015 年10月29日。

所述芽孢杆菌M29菌落在LB平板上，培养初期菌落饱满透明，积累大量粘 液，牢固地附着在培养基上，培养后期呈裂叶状，边缘毛发状，培养3d后菌落 呈褶皱垒起的山丘状。可产生近中生的椭圆状芽孢，孢囊稍膨大，细胞形态和排 列呈杆状，单生，无荚膜，可运动。

所述芽孢杆菌M29的生理生化特性是：革兰氏阳性，严格好氧，化能异养， M.R试验阴性，VP实验阳性，淀粉水解阳性，明胶水解阴性，柠檬酸盐利用阳 性，硝酸盐还原阳性。

本发明所述的芽孢杆菌M29培养时使用的主要氮源包括但不限于蛋白胨、酵 母粉、硝酸钾、硝酸铵、硫酸铵、尿素、丙氨酸；使用的主要碳源包括但不限于 蔗糖、木糖、甘露醇、麦芽糖、乳糖、果糖、葡萄糖；使用的无机组分包括但不 限于氯化钾、氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸三钙、二水氯化钙、七水 合硫酸镁、七水和硫酸亚铁。本发明的拮抗菌发酵可在25～37℃，pH4～10，氯 化钠浓度在1％-10％的环境下进行。

所述的芽孢杆菌M29在制备拮抗灰霉、木霉、烟曲霉、黄瓜枯萎菌、棉花枯 萎菌、甜瓜枯萎菌、草莓根腐菌、桃溃疡菌、大丽轮枝菌和/或水稻纹枯菌的生 防菌剂中的应用。

所述的芽孢杆菌M29产生的挥发性物质在拮抗木霉、烟曲霉、黄瓜枯萎菌、 棉花枯萎菌、甜瓜枯萎菌、草莓根腐菌、桃溃疡菌、大丽轮枝菌和/或水稻纹枯 菌中的应用。

所述的芽孢杆菌M29产生的挥发性物质在果蔬保鲜中的应用。

有益效果：

本发明提供了一株对能够有效拮抗灰霉、木霉、烟曲霉、黄瓜枯萎菌、棉花 枯萎菌、甜瓜枯萎菌、草莓根腐菌、桃溃疡菌、大丽轮枝菌、水稻纹枯菌等多种 病原菌。该菌产生的挥发性物质也能有效拮抗木霉、烟曲霉、黄瓜枯萎、棉花枯 萎、甜瓜枯萎、草莓根腐、桃溃疡、大丽轮枝、水稻纹枯等病原真菌。该菌株产 挥发性质可不接触抑制真菌，在水果蔬菜保鲜领域有重要的应用价值。其具有易 保存，可大量生产，防效好，环境安全性好等优点，具有良好的商业应用前景。

附图说明

图1M29在显微镜目镜10×，油镜100×下的形态

图2M29菌株对灰霉的拮抗效果。

图3M29菌株对黄瓜枯萎的拮抗效果。

图4M29菌株对草莓根腐的拮抗效果。

图5M29菌株对棉花枯萎的拮抗效果。

图6M29菌株对桃溃疡的拮抗效果。

图7M29菌株对大丽轮枝的拮抗效果。

图8M29菌株对木霉的拮抗效果。

图9M29菌株对甜瓜枯萎的拮抗效果。

图10M29菌株对烟曲霉的拮抗效果。

图11M29菌株对水稻纹枯的拮抗效果。

图12M29菌株产挥发性物质对黄瓜枯萎的拮抗效果。

图13M29菌株产挥发性物质对草莓根腐的拮抗效果。

图14M29菌株产挥发性物质对棉花枯萎的拮抗效果。

图15M29菌株产挥发性物质对桃溃疡的拮抗效果。

图16M29菌株产挥发性物质对大丽轮枝的拮抗效果。

图17M29菌株产挥发性物质对木霉的拮抗效果。

图18M29菌株产挥发性物质对甜瓜枯萎的拮抗效果。

图19M29菌株产挥发性物质对烟曲霉的拮抗效果。

(注：烟曲霉易产生孢子，对照里面初始实验条件和实验组一致，现在对照组产生了大量孢子，而实验组 明显受到抑制。说明本发明菌株产挥发性物质对烟曲霉抑制作用明显。)

图20M29菌株产挥发性物质对水稻纹枯的拮抗效果。

生物材料保藏信息

M29，分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis，保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3 号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNO.11557，保藏日期为2015年 10月29日。

具体实施方式

实施例1

该菌株从南京市江浦汤泉农场的蚯蚓粪中筛选而得。

首先准备以下三种培养基。

LB固体培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂30g，蒸馏水 1000ml，pH7.0-7.2，121℃灭菌，20min。

LB液体培养基：不加琼脂，其它条件同上。

PDA培养基：葡萄糖20.0g，琼脂20.0g，马铃薯粉6.0g，蒸馏水1000ml， pH5.4-5.8，115℃灭菌，30mine。

YPD培养基：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母粉10g，琼脂30g，蒸馏水1000ml， pH7.0-7.2，115℃灭菌，30mine。

将蚯蚓粪称取l0g置于盛有100ml灭菌水的250ml的三角瓶中，在摇床中， 30℃，150r·min^-1振荡20min，静置10min，得到悬浮液。该悬浮液中含有若干 种菌，采用梯度稀释法稀释后涂于LB培养基，将平板倒置，于30℃，恒温箱中 培养24h后，挑取不同类型典型单个菌落，经平板纯化后，4℃保存在LB斜面待 用。

下面再通过平板对峙实验验证该菌的拮抗作用。

初筛：分别将木霉，灰霉，烟曲霉，大丽轮枝菌，棉花枯萎菌，甜瓜枯萎菌， 桃溃疡菌，草霉根腐菌用打孔器打孔后转接于PDA平板中央，黄瓜枯萎菌，水稻 纹枯菌用打孔器打孔后转接于YPD培养基中央，然后将分离纯化后的细菌挑取单 菌落点接在真菌的四角，置于30℃培养箱培养，灰霉置于25℃培养箱，培养3-5d， 根据抑菌效果选出效果好的细菌。

复筛：将初筛得到的效果好的细菌按照上述实验方法重复，筛选出了一株对 十种真菌病原菌均有拮抗作用且效果明显的菌株(图2～图11)；由图可见筛选得 到的菌株M29对病原真菌有强烈的抑制作用，不但抑制菌丝的生长，还抑制菌核 的生长。

如图1所示，该菌株在油镜100×，目镜10×的显微镜条件下的形态特征。

将上述方法筛选分离出的菌株，经南京思普金专业测序公司测序，根据 16SrDNA的测序结果，在http：//www.ncbi.nlm.nih.gov在线查询分析，利用 Blast软件在GenBank中与其它的16SrDNA序列进行同源性比较，确定其为 芽孢杆菌，然后通过Biolog结果以及生理生化特征确定为枯草芽孢杆菌。将该 菌株送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为 CGMCCNO.11557，保藏日期为2015年10月29日。

该菌为革兰氏阳性，严格好氧，化能异养，M.R试验阴性，VP实验阳性，淀 粉水解阳性，明胶水解阴性，柠檬酸盐利用阳性，硝酸盐还原阳性，具有广谱且 明显的抗菌性。

实施例2

好氧性试验

把灭过菌的LB培养基倒入3个已灭菌的试管中，大约在2/3处，在无菌操 作台上，用接种针挑取斜面培养的所述菌，穿刺接种到上述培养基中(必须穿 刺到管底)。30℃培养，分别在3天至7天观察结果。在琼脂柱表面上生长者 为好氧菌，如沿穿刺线生长者为厌氧菌或兼性厌氧菌。试验结果表现，菌落沿琼 脂柱表面生长，穿刺线内无菌落生长，为严格好氧。

过氧化氢酶的测定

在干净载玻片上滴1滴3％H₂O₂，取18～24h的LB斜面培养物1环，在H₂O₂中涂抹，若有气泡产生则为阳性，否则为阴性。试验结果为接触酶阳性。

甲基红试验(M.R试验)

a.培养基及试剂：蛋白胨5g，葡萄糖5g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，调 节pH7.0～7.2，分装试管，每管装4～5mL，121℃灭菌20min。试剂：甲基红 0.1g，95％酒精300mL，蒸馏水200mL。

b.菌种培养及结果观察接种菌株于上述培养液中，30℃培养l～2天。在 培养液中加入几滴甲基红试剂，如培养液呈现红色，为甲基红阳性，黄色为阴性 (甲基红变色范围4.4红色～6.0黄色)。

试验结果为M.R阴性。

乙酞甲基甲醇试验(VP试验)

a.培养基培养基同甲基红试验。

b.菌种培养及结果观察接种与培养同甲基红试验。做VP试验时，取培养 液(约2mL)和等量的40％NaOH相混合，加少量肌酸，充分振荡2～5min后， 如培养液出现红色，即为VP阳性。

试验结果为VP阳性。

淀粉水解试验

a.培养基及试剂在肉汤蛋白胨琼脂中添加0.2％的可溶性淀粉，分装三角 瓶，121℃灭菌20min备用。路哥氏碘液：碘片1g，碘化钾2g，先用少量(3～5mL) 蒸馏水溶解碘化钾，现加入碘片，待碘完全溶解后，加水稀释至300mL。

b.菌种培养及结果观察取菌种点接于平板上，30℃培养2～4天，形成菌落 后，在平板上滴加路哥氏碘液，以铺满菌落周围为度，平板呈蓝色，而菌落周围 如有无色透明圈出现，说明淀粉已被水解。透明圈的大小一般说明水解淀粉能力 的大小。

试验结果为淀粉水解阳性。

明胶水解试验

a.培养基及试剂蛋白胨5g，明胶120g，蒸馏水1000mL。调节pH7.2～7.4， 分装试管，培养基高度约为4～5cm，121℃灭菌20min。

b.菌种培养及结果观察用穿刺法接种在试管中央。在30℃温箱中培养一个 月，观察明胶是否液化。

试验结果为明胶水解阴性。

硝酸盐还原试验

a.培养基及试剂蛋白胨10g，KNO₃1g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.4。格里斯 氏(Gries)试剂：A液：对氨基苯磺酸0.5g，稀醋酸(10％左右)150mL；B液： 蔡胺0.1g，蒸馏水20mL，稀醋酸(10％左右)150mL。二苯胺试剂：二苯胺0.5g 溶于l00mL浓硫酸中，用20mL蒸馏水稀释。

b.菌种培养及结果观察将试验菌接种于硝酸盐液体培养基中，30℃培养1、 3、5天。在白色瓷盘小孔中倒入少许培养液，然后在其中分别滴1滴试剂A和B 液，当培养液变为粉红色、玫瑰红色、橙色或棕色等时，表示有亚硝酸盐存在， 为硝酸盐还原阳性，否则为阴性。

试验结果为硝酸盐还原阳性。

柠檬酸盐的利用

a.培养基及试剂柠檬酸钠2g，NaCl5g，MgSO₄·7H₂O0.2g，(NH₄)₂·HPO₄1g， 1％澳百里香酚蓝水溶液10mL，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH6.8-7.0，121℃灭 菌20min。

b.菌种培养及结果观察取幼龄菌种接种于斜面上，30℃培养3-7天，培养 基呈碱性(蓝色)者为阳性反应，不变者则为阴性。

柠檬酸盐利用的试验结果为阳性。

实施例3

通过平板倒扣实验验证该菌株产挥发性物质抑制病原真菌的生长。

将M29菌株划线在LB培养基上，另一边用直径0.6mm打孔器将木霉、烟 曲霉、桃溃疡菌、棉花枯萎菌、甜瓜枯萎菌、大丽轮枝菌、草霉根腐菌等病原真 菌打孔接在PDA培养基上，黄瓜枯萎菌、水稻纹枯菌等病原真菌接在YPD培养基 上，然后将两个平板倒扣起来，用封口膜密封，同时，设置对照组，只接病原真 菌，不接细菌。放在30℃培养箱里培养3-5d。结果表明，本发明菌株产生的挥 发性物质对病原真菌有强烈的抑制作用，不但抑制菌丝的生长，还抑制菌核的生 长。具体结果见图12-20。

以上所述仅是本发明的基本实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通 技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这 些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。