用于培养铁皮石斛褐斑病菌的含有特异糖源的培养基

摘要

本发明提供一种用于培养铁皮石斛褐斑病菌的含有特异糖源的培养基，该培养基由下列成分组成：氮源化合物3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，糖源物质30g，琼脂20g，添加水至1000mL，其中所述的糖源物质为麦芽糖、蔗糖、菊糖、核糖、果糖、乳糖、鼠李糖、山梨醇或纤维乙糖。使用本发明的培养基和培养方法可以大量获得该病菌的孢子。

说明书

技术领域

本发明属于微生物领域，特别的，属于采用培养方法来培养铁皮石斛褐斑病菌的培养方法。

背景技术

铁皮石斛(DendrobiumSw.)又名黑节草、云南铁皮，是兰科(Orchidaceae)多年生附生草本植物，是一种珍贵的中药材。早在《神农本草经》中就有记载，具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳、明目强身、镇痛消炎的功效。同时现代研究表明，石斛药材除具有本草记载的等功效外，还具有抗肿瘤、抗辐射、抗血小板凝集及增强机体免疫力等功效。近年来石斛药材的需求量不断增加，而栽培技术的不断创新使得人工种植石斛的面积不断增大，然而随着集中种植面积的增加，出现的问题也不断增多，石斛种植出现多种不同的病害，例如铁皮石斛褐斑病。石斛叶片染病后病斑初呈淡褐色至黑褐色的小点，后小点渐渐扩大为约5～6mm的病斑。这不仅影响石斛的品质，也影响石斛的产量，具统计褐斑病导致产量损失5％-10％。防止褐斑病的发生和扩增有助于提高石斛生产的产量和品质，确保石斛产业健康有序的发展。为了研究如何防治铁皮石斛的褐斑病，就需要首先培养褐斑病来进行一些方面的研究，例如研究该病菌的生物学特性，药效试验等筛选出合适的药物进行防治。但是，这种病菌难以培养，而且产量低，为此，需要提供如何高效率的培养褐斑病病菌进行相关方面的研究。

发明内容

为了解决以上问题，本发明提供一种培养铁皮石斛褐斑病菌的方法，该方法包括：提供草莓煎汁培养基，其中该草莓煎汁培养基的组成为：草莓茎叶200g，蔗糖20g，琼脂20g，添加水至1000ml。

优选的，草莓茎叶200g经过如下过程进行制备：在煎锅中放入1000mL蒸馏水和200g草莓茎叶，煮沸5min后，过滤去除茎叶，加入20g蔗糖，定容至1000mL。

优选的，培养的PH值为7.

优选的，培养的温度为25-30摄氏度。

优选的，所述的铁皮石斛褐斑病菌为多喙茎点霉(Phomamultirostrata(Mathuretal.)Dorenboseh&Boerema)。

另一方面，本发明提供草莓煎汁培养基在制作培养铁皮石斛褐斑病菌培养基中的用途，其中所述的草莓煎汁培养基由下列组分组成：草莓茎叶200g，蔗糖20g，琼脂20g。

优选的，优选的，草莓茎叶200g经过如下过程进行制备：在煎锅中放入1000mL蒸馏水和200g草莓茎叶，煮沸5min，过滤去除茎叶，加入20g蔗糖，定容至1000mL。

优选的，培养的PH值为7。

优选的，培养的温度为25-30摄氏度。

优选的，所述的铁皮石斛褐斑病菌为多喙茎点霉(Phomamultirostrata(Mathuretal.)Dorenboseh&Boerema)。

另一方面，本发明提供一种培养铁皮石斛褐斑病菌的方法，该方法包括提供一种培养基，该培养的组成如下：氮源化合物3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，糖源物质30g，琼脂20g，添加水至1000mL，其中所述的糖源物质为麦芽糖、蔗糖、菊糖、核糖、果糖、乳糖、鼠李糖、山梨醇或纤维乙糖。

优选的，糖源物质为纤维乙糖。

优选的，所述的氮源化合物为L-脯氨酸、L-缬氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸或硝酸钾。

优选的，所述的氮源化合物为L-脯氨酸、L-丝氨酸和L-色氨酸。

一种培养基在用于制备培养铁皮石斛褐斑病菌培养基中的用途，其中，所述的培养基的组成如下：氮源(氨基酸)化合物3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，糖源物质30g，琼脂20g，其中所述的糖源物质为麦芽糖、蔗糖、菊糖、核糖、果糖、乳糖、鼠李糖、山梨醇或纤维乙糖。

优选的，糖源物质为纤维乙糖。

优选的，所述的氨基酸化合物为L-脯氨酸、L-缬氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸。

优选的，所述的氨基酸化合物为L-脯氨酸、L-丝氨酸和L-色氨酸。

优选的，所述的铁皮石斛褐斑病菌为多喙茎点霉(Phomamultirostrata(Mathuretal.)Dorenboseh&Boerema)。

有效效果

通过本发明的特异培养基和培养方法，可以获得优质、大量的褐斑病菌，为研究褐斑病菌提供了有益的材料，特别是可以提供大量的孢子。

具体实施例子

1材料与方法

1.1铁皮石斛褐斑病病样采集及病原菌的分离

田间铁皮石斛褐斑病病样采集于浙江省乐清县雁荡山镇的乐清铁枫堂铁皮石斛基地、乐清同丰铁皮石斛基地、乐清灵岩铁皮石斛基地；采样后将标样放入保鲜袋带回实验室置于5℃冰箱，待用。切取铁皮石斛褐斑病镜检并用PSA培养基分别于进行常规组织分离和划线分离。1.2致病性测定

分别采用分离自铁皮石斛褐斑病病样分离物的菌丝和分生孢子液(稀释成1×10⁶个/mL)，对石斛进行嫩枝活体伤口和无伤接种，在25℃的XT5401-CD275TJH智能生物人工气候箱内，RH98％以上，12小时光照12小时黑暗接种后培养，以健康的枝条为对照，重复3次，每天定时观察记录发病情况，分析致病性。

1.3病原菌的培养性状

病原菌接种于PSA上于25℃培养7d，记录菌落形态，颜色；测量100个分生孢子的大小，重复3次，记录平均值。

1.3.1不同培养基对铁皮石斛褐斑病病原菌菌丝生长及分生孢子产生的影响。

病原菌于25℃用下表中的培养基培养，每处理重复6次,5d后测量菌落直径，菌丝干重、分生孢子器的产生情况、及其菌落色泽等。

表1：不同培养基的配方

*煎汁培养基的准备过程：在煎锅中放入1000mL蒸馏水和200g相应的物品，煮沸5min后，过滤留滤液，加入20g蔗糖，定容至1000mL。

1.3.2，针对最优选的培养基(草莓煎汁培养基)，我们确定不同pH值对铁皮石斛褐斑病菌菌丝生长及分生孢子的影响将直径4.0mm的菌丝块移于pH值4-12的不同pH值的草莓煎汁培养基上(pH值采用pHS-9V酸度计测量配制)，置于25℃培养，每处理重复6次,6d后测量菌落干重，计算分生孢子数量。

1.3.3不同温度对铁皮石斛褐斑病菌菌丝生长及分生孢子的影响将直径4.0mm的菌丝块移于草莓煎汁培养基平板上，置于5℃,10℃,15℃,20℃,25℃,30℃,35℃不同温度下培养，每处理重复6次,6d后测量菌落直径和分生孢子数量。

1.3.4不同碳源对铁皮石斛褐斑病菌菌丝生长及分生孢子的影响。

经过我们的大量研究，发现，当以草莓煎汁培养基来研究最佳碳源和氮源对该病菌培养的影响的时候，发现不同的碳源对培养的性状(菌落干重和产孢情况)并没有实质的差异，也就是说不同的碳源或氮源似乎起到同样的作用，没有实质的改善和影响，同样，在其他类似的培养基上，例如树皮煎汁培养基，甘蔗煎汁培养基，荷叶煎汁培养基，燕麦培养基(OMA培养基)获得与草莓煎汁培养基类似的结果(具体数据略)。

相反，查氏培养基为基础培养基，再分别用甘露糖、葡萄糖、蔗糖、可溶淀粉、半乳糖、海藻糖、甘露醇、木糖、DEAE纤维素、乙醇、核糖、果糖、山梨糖、山梨醇、鼠李糖、菊糖、乳糖、麦芽糖、纤维素钠、纤维乙糖等20种不同碳源等量置换蔗糖(含量与蔗糖一样)，于25℃下培养，每处理重复6次，6d后测量菌落直径，观察菌落干重和产孢情况，获得了不同的结果，具体见结果分析。

1.3.5不同氮源对铁皮石斛褐斑病菌菌丝生长及分生孢子的影响。

以查氏培养基为基础培养基，分别用谷氨酸、谷氨酰氨、天门冬酰氨、天门冬氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、酪氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-精氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-丝氨酸、L-脯氨酸、L-蛋氨酸、L-缬氨酸、L-色氨酸、L-丙氨酸、酪蛋白水解物、尿素、硫酸铵、硝酸钾、亚硝酸钠等26种氮源等量置换硝酸钾或硝酸钠(质量与硝酸钾一样)，置于25℃培养，每处理重复6次，6d后测量菌落直径，观察菌落干重和产孢情况。

2.0结果与分析

2.1铁皮石斛褐斑病的症状

褐斑病仅侵染铁皮石斛的叶片。叶片染病后病斑初呈淡褐色至黑褐色的小点，后小点渐渐扩大，最大病斑约5～6mm。病斑圆形或椭圆形，淡褐色至黑褐色，有时病健交界处常有一圈褐色的晕圈。病斑中间凹陷。严重时，叶片上出现许多大小不一的病斑，一般新叶不染病。

2.2病原菌的分离和致病性测定

对几十个石斛褐斑病标样进行划线分离和常规组织分离，5d后，培养皿上长出少量细菌和不同的真菌，将这些细菌和真菌置于适宜的温湿度条件下对在相同铁皮石斛健康的枝叶进行柯赫法则检验，发现这些细菌大都为芽孢杆菌，均为非致病菌；其中重复分离到的一种真菌分离物为疑似病原物。将这种真菌分离物置于适宜的温湿度条件下在相同铁皮石斛健康的枝叶进行接种检验，这些真菌分离物均对石斛叶致病，发病病症与田间基本一致，通过分子生物方法鉴定为即为石斛褐斑病病原菌。

2.3病原菌分离物的形态及培养性状

病原菌在PSA上，菌丝成放射状生长，气生菌丝灰白色，短绒毛状，较发达。平铺于培养基上，初期菌落(尤其在其边缘)为淡淡的粉红色，随即转为灰色，再由灰色转为褐色，最后由褐色转为黑褐色，菌落也成为碳质，培养皿背面呈黑褐色放射条纹状，分生孢子团桔黄色。在寄主上，病原菌分生孢子盘生于寄主表皮下，分散或合生，成熟后突破表皮露出，不规则开裂，散生刚毛，刚毛褐色至暗褐色，具1-3个隔膜，直或微弯，向顶端渐尖且色淡；分生孢子梗无色，产孢细胞圆柱形，无色，分生孢子单胞，无色，长圆形或椭圆形，一端稍尖，(14～15)μm×(4.5～6)μm,有时含油球。菌丝或芽管顶端接触固体界面时产生附着胞,附着胞褐色,长棍棒形或呈不规则形,(9～10)μm×(5～6)μm。

2.5病原菌鉴定

根据对铁皮石斛褐斑病的病原菌分离物的形态学特征、培养性状和致病性测定的研究结果(具体实验数据略)，参阅专著(张忠义等,1986；陆家云,2001)及吴文平(1991)对漆斑菌属4个种的研究；确定铁皮石斛褐斑病是由半知菌亚门(Deuteromycotina)、球壳孢目(Sphaeropsidales)、球壳孢科(Sphaerioidaceae)、茎点霉属(Phoma)、多喙茎点霉(Phomamultirostrata(Mathuretal.)Dorenboseh&Boerema)引起的。

2.6不同培养基对石斛褐斑病菌菌丝生长的影响(具体结构见表2)

石斛褐斑病菌在PSA培养基、OMA培养基、查氏培养基、石斛煎汁培养基、树皮煎汁培养基、甘薯煎汁培养基、草莓煎汁培养基、荷叶煎汁培养基等8种不同培养基上(表1)，于25℃恒温下生长。测定结果表明该菌在所试验的培养基上均能生长，其中石斛褐斑病菌在甘薯煎汁培养基、荷叶煎汁培养基，OMA培养基，草莓煎汁培养基上生长最快，生长速度(逻辑斯蒂增长率)最高可达8.013、7.553、7.594，7.956。但该菌落在甘薯煎汁培养基和荷叶煎汁培养基上生长较稀薄，生物量干重明显比PSA培养基小，综合生长速度与生长量，该菌较适宜生长的培养基为PSA培养基、OMA培养基，树皮煎汁培养基，草莓煎汁培养基。

该菌在所试验的培养基上均能产生黑色的分生孢子器，其中以草莓煎汁培养基产生的分生孢子器数量最多，数量可达0.85×10⁴个/mL，与其他处理达到极显著差异(具体分析过程略)，其次为PSA、OMA培养基和树皮煎汁培养基(与其他处理达到显著差异)。因此OMA培养基、PSA培养基和草莓煎汁培养基为最适产孢培养基。因为产黑色的分生孢子器是有效繁殖该病原菌的一个最有效的途径，利于这些孢子的生长可以进行超级传染病菌和超级抗药性病菌的筛选，对于防治该病进行基础研究最有益处。

表2不同培养基对石斛褐斑病菌菌丝生长和分生孢子形成的影响

注：r(t＝7d)为菌落面积日均增长率,r(logit)为菌落面积的逻辑斯蒂值日均增长率；t(s＝50％)为根据r(logit)值估算出的菌落生长至皿面积一半所需时间(d)；培养温度25℃。

对于本发明的部分数据都进行了方差分析，各个处理之间的分析接哦股都标示在相应的处理上，其中，当各个上标的字母不相同的时候(单个字母)，表示他们之间存在显著差异，如果上标的字母为2个或两个以上，表示他们之间没有差异，但是单个字母的处理与2个字母的处理之间存在显著差异。本领域的一般人员看到这样的表示方法后容易明白他们的关系。2.7pH值对石斛褐斑病菌菌丝生长和分生孢子形成的影响(表3)

经测定石斛褐斑病菌在pH值3～12范围内均能生长，pH为5.0～11.0时菌落扩展速度较快，其菌落直径逻辑斯蒂增长率分别达0.391～0.502，其中以pH值为7.0生长最快，其菌落直径逻辑斯蒂增长率达0.587(表3)。病菌在pH值6.0～8.0时，可产生较多的分生孢子，其中以pH值为7.0产生分生孢子量最多，每皿的分生孢子数达0.90×10⁴。菌落生长的干重在pH值为3.0～12.0之间均为中等厚薄。说明该菌菌丝生长和产生分生孢子的最适pH值为7.0，该菌喜欢中性的生长环境。

表3不同pH值对石斛褐斑病菌菌丝生长和分生孢子形成的影响

注：r(t＝7d)为菌落面积日均增长率,r(logit)为菌落面积的逻辑斯蒂值日均增长率；t(s＝50％)为根据r(logit)值估算出的菌落生长至皿面积一半所需时间(d)；培养温度25℃。

2.8温度对石斛褐斑病菌菌丝生长和分生孢子形成的影响(表4)

经测定石斛褐斑病菌在10℃～35℃范围内均能生长，其中以15℃～30℃生长较为适宜，10℃以下或35℃以上，生长几乎停止。其中以25℃～30℃为最适，其菌落直径逻辑斯蒂增长率达0.81～0.84(表4)。在20℃～35℃均能形成的分生孢子，以25℃～30℃以形成的分生孢子量最多，每皿的生孢子数达0.85×10⁴～0.89×10⁴。在10℃～35℃范围内菌落干重中等以上，在20℃～30℃时菌落干重为厚。因此，石斛褐斑病菌在25℃～30℃范围内最适宜生长。

表4不同温度对石斛褐斑病菌菌丝生长和分生孢子形成的影响

温度>r(t＝7d)>r(logit)>t(S＝50％)>每皿孢子器数(×10⁴)>色泽>5℃>/>/>/>0>/>10℃>1.259>0.332>16.3>0>黑>15℃>2.526>0.43>12.58>0>黑>20℃>12.115>0.704>7.68>0.47^b黑>25℃>17.992>0.81>6.68>0.85^a黑>30℃>19.624>0.84>6.44>0.89^a黑>35℃>0.724>0.261>20.73>0.42^b黑>

注：r(t＝7d)为菌落面积日均增长率,r(logit)为菌落面积的逻辑斯蒂值日均增长率；t(s＝50％)为根据r(logit)值估算出的菌落生长至皿面积一半所需时间(d)；培养温度25℃。

2.9碳源对石斛褐斑病菌菌丝生长和分生孢子形成的影响

对20种碳源测定显示，石斛褐斑病菌在除DEAE纤维素外的其他碳源培养基上均能生长。生长速度快的有麦芽糖、蔗糖、菊糖、核糖、果糖、乳糖、鼠李糖、山梨醇、纤维乙糖等8种，但有部分菌落生长稀薄，结合菌落营养生长的干重，较适宜的培养基为蔗糖、甘露糖、核糖、果糖、乳糖、葡萄糖、纤维乙糖。

培养10天后，该菌在除DEAE纤维素外的19种碳源培养基上均能产生黑色的分生孢子器，根据分生孢子器产量，分生孢子器产量大的培养基有纤维乙糖、蔗糖、可溶淀粉、麦芽糖、乳糖、葡萄糖、鼠李糖等7种，其产孢量在1.19×10⁴～2.15×10⁴。特别是纤维乙糖的产孢数量显著超过了蔗糖。

综上所述，最适宜该菌生长的碳源为是蔗糖、可溶淀粉、麦芽糖、纤维乙糖、乳糖、葡萄糖、鼠李糖、山梨醇、果糖、菊糖等10种。其中当碳源为纤维乙糖时该菌能产生更多的分生孢子，最适宜繁殖。

表5不同碳源对石斛褐斑病菌菌丝生长和分生孢子形成的影响

注：r(t＝7d)为菌落面积日均增长率,r(logit)为菌落面积的逻辑斯蒂值日均增长率；t(s＝50％)为根据r(logit)值估算出的菌落生长至皿面积一半所需时间(d)；培养温度25℃。

2.10氮源对石斛褐斑病菌菌丝生长和分生孢子形成的影响

经27种有机氮和无机氮对石斛褐斑病菌菌丝生长及分生孢子形成的测定表明：该菌均能利用有机氮和无机氮生长及繁殖，其中以L-脯氨酸、L-缬氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、硝酸钾较适宜菌丝生长，其菌落直径逻辑斯蒂增长率达0.545～0.616(表6)。该菌在各种氮源上均能形成分生孢子，其中L-脯氨酸、L-丝氨酸、亚硝酸钠、酪蛋白水解物等适于分生孢子的产生，每皿的生孢子数达0.70×10⁴～0.86×10⁴。平均干重在0.65g以上。综合病原菌的营养生长和繁殖生长，因此，L-脯氨酸、L-丝氨酸和L-色氨酸是适宜该菌的氮源。

表6不同氮源对石斛褐斑病菌菌丝生长和分生孢子形成的影响

注：r(t＝7d)为菌落面积日均增长率,r(logit)为菌落面积的逻辑斯蒂值日均增长率；t(s＝50％)为根据r(logit)值估算出的菌落生长至皿面积一半所需时间(d)；培养温度25℃。