一种提高长白落叶松体细胞胚发生和植株再生效率的过渡培养基及培养方法

摘要

一种提高长白落叶松体细胞胚发生和植株再生效率的过渡培养基及培养方法，涉及一种提高落叶松体细胞胚发生和植株再生效率的培养基及培养方法。是要解决现有长白落叶松体胚发生体系中高频的体胚发生需要使用昂贵的设备进行液体同步化培养、子叶胚发生频率普遍不高且所需周期长、体胚萌发率及植株再生率低的问题。该培养基包括以下组分：NH

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高落叶松体细胞胚发生和植株再生效率的培养基及培养方法。

背景技术

长白落叶松属于松科中的落叶松亚科落叶松属，具有分布广、抗逆性强及早期速生等优点，为北半球温带山区与寒带气候条件下重要的速生用材树种。长白落叶松有很高的生态价值与经济价值，但是长白落叶松生长周期长，扦插等无性繁殖存在生根率较低等问题，且长白落叶松具有杂合性高的特点，有性生殖产生的子代变异较大，很多优良性状难以维持，通过传统的育种方法并不能很好的满足许多遗传改良的需求，所以利用如细胞工程等现代生物技术手段，建立稳定且高效的长白落叶松体细胞胚胎发生体系对于长白落叶松的遗传育种具有重要而深远的意义。

对于建立植物体细胞胚胎发生体系而言，最关键的环节在于如何快速获得大量优质的体细胞胚胎。现阶段，关于体胚发生阶段，长白落叶松的体细胞胚胎发生存在许多问题，主要是胚性愈伤组织质量差、高频的体胚发生需使用昂贵的设备进行液体同步化培养、胚性愈伤体胚发生能力差、体胚发生所需周期长、早期原胚的子叶及根原基发育不正常。通常落叶松胚性愈伤组织体细胞胚的发生量不超30个/g，且发生需要80天以上。即便是较好的体系，子叶胚的发生也需40-60天；体胚的萌发率不超过70％；植株再生率也在30％以下。

发明内容

本发明是要解决现有长白落叶松体细胞胚胎发生体系中高频的体胚发生需要使用昂贵的设备进行液体同步化培养、子叶胚发生频率普遍不高且所需周期长、体胚萌发率及植株再生率低的问题，提供一种提高长白落叶松体细胞胚发生和植株再生效率的过渡培养基及培养方法。

本发明提高长白落叶松体细胞胚发生和植株再生效率的过渡培养基，包括以下组分：

其中蔗糖的优选浓度为60g/L，肌醇的优选浓度为10g/L，Gln的优选浓度为0.5g/L，水解酪蛋白的优选浓度为0.25g/L。

为保证愈伤组织的正常生长代谢，培养基中还应含有2mg/LCly，1mg/LVB1，0.5mg/LVB5及0.5mg/LVB6。

利用上述培养基进行培养的方法为：将长白落叶松胚性愈伤组织接种于上述培养基中，于22-25℃、暗培养条件下培养7-21d，其中优选培养时间为14天。

本发明的有益效果：

本发明通过在体胚诱导前对胚性愈伤组织进行的过渡培养，提高了长白落叶松高质量体胚发生量，缩短了体胚发生时间，从而改善了长白落叶松体胚发生效率，在此基础上显著提高了体胚萌发率及生根率。通过过渡培养，仅15天即可获得子叶期的体胚，其发生数量最多可以达330个/g，体细胞胚的萌发率约为100％，生根率可达50％。

附图说明

图1为长白落叶松胚性愈伤组织；

图2为长白落叶松体细胞胚胎发生；

图3为长白落叶松体细胞胚胎的萌发；

图4为长白落叶松体细胞胚胎的生根；

图5为长白落叶松体细胞胚胎的植株再生。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式提高长白落叶松体细胞胚发生和植株再生效率的过渡培养基，包括以下组分：

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述蔗糖的浓度为30-60g/L。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：所述肌醇的浓度为1-10g/L。其它与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：所述Gln的浓度为0.5-1g/L。其它与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：所述水解酪蛋白的浓度为0.25-0.5g/L。其它与具体实施方式一至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：所述培养基中还含有2mg/LCly，1mg/LVB1，0.5mg/LVB5和0.5mg/LVB6。其它与具体实施方式一至五之一相同。

具体实施方式七：本实施方式利用提高长白落叶松体细胞胚发生和植株再生效率的过渡培养基进行培养的方法为：

将长白落叶松胚性愈伤组织接种于提高长白落叶松体细胞胚发生和植株再生效率的过渡培养基中，于22-25℃、暗培养条件下培养1-28d。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式七不同的是：暗培养条件下培养时间为7-21d。其它与具体实施方式七相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式七不同的是：暗培养条件下培养时间为14d。其它与具体实施方式七相同。

为验证本发明的有益效果进行以下试验：

实施例1：

本实施例提高长白落叶松体细胞胚发生和植株再生效率的过渡培养基的配方如下：

将由未成熟合子胚在含有2,4-D、BA等的BM培养基诱导出的长白落叶松胚性愈伤组织(图1)，接种于含有30-90g/L蔗糖的本实施例的培养基中过渡培养14d后，再经体胚诱导，每克胚性愈伤组织可形成的体细胞胚胎(图2)数量及形成体胚的萌发率、植株再生率如下表所示：

表1.蔗糖浓度对体胚发生数量、体胚萌发率及植株再生率的影响

蔗糖浓度体胚发生数量体胚萌发率植株再生率30g/L77.75±4.83个/g95.88％20.75％60g/L80.40±5.07个/g100％45.00％90g/L74.41±5.32个/g72.33％25.00％

从上表我们可以看出，该培养基中添加60g/L蔗糖时，每克愈伤组织可以诱导出的体细胞胚胎数最多，并且体胚的萌发率及植株再生率也最大可分别达到100％与45.00％。

*注：上述体胚萌发率指接入无激素WPM培养基中，萌发的体胚(图3)即子叶变绿且伸长的体胚在全部接种的体胚中所占的比例；植株再生率指接入WPM培养基中，生根的体胚(图4)即胚根端生长出红色胚根的体胚在全部接种的体胚中所占的比例。

实施例2：

将实施例1中所述的胚性愈伤组织接种于含有1-15g/L肌醇，其他条件同实施例1的培养基中，胚性愈伤组织经过诱导后，每克胚性愈伤组织可形成的体细胞胚胎数及形成体胚的萌发率、植株再生率如下表所示：

表2.肌醇浓度对体胚发生数量、体胚萌发率及植株再生率的影响

肌醇浓度体胚发生数体胚萌发率植株再生率1g/L69.15±4.83个/g90.57％34.57％10g/L74.67±5.07个/g90.78％31.44％15g/L88.77±5.32个/g85.22％25.11％

从上表我们可以看出，在特定范围内，胚性愈伤组织形成的体细胞胚胎的数量随该培养基中肌醇的添加而增加，在添加15g/L肌醇时，每克愈伤组织可以诱导出的体细胞胚胎最多；但是体胚的萌发率及植株再生率与培养基中添加的肌醇量呈反比，即体胚萌发率及植株再生率随培养过程中的肌醇含量增加而降低。

实施例3：

将实施例1中所述的胚性愈伤组织接种于含有0-1g/L谷氨酰胺，0-0.5g/L水解酪蛋白，60g/L蔗糖，10g/L肌醇，其他条件同实施例1的培养基中培养，其培养基中谷氨酰胺与水解酪蛋白的组合如下表所示：单位g/L

表3.不同浓度的谷氨酰胺与水解酪蛋白的组合方案

组合1组合2组合3组合4组合5组合6组合7组合8组合9Gln0000.50.50.5111CH00.250.500.250.500.250.5

上述9种培养基过渡培养14d的胚性愈伤组织经过体胚诱导后，统计经0-1g/L的Gln培养的每克胚性愈伤组织可形成的体细胞胚胎数量及形成体胚的萌发率、植株再生率，其结果如下表所示：

表4.谷氨酰胺浓度对体胚发生数量、体胚萌发率及植株再生率的影响

Gln浓度体胚发生数体胚萌发率植株再生率0g/L72.16±30.22个/g74.11％11.01％0.5g/L67.53±29.31个/g94.44％14.78％1g/L52.20±9.99个/g75.00％19.00％

由上表可见，体胚发生数随培养基中的Gln的浓度增加而降低，即在不添加Gln时可以获得最多的体胚，但是体胚萌发率随Gln浓度的增加，却表现出先升高后降低的趋势，胚性愈伤经添加0.5g/L的培养基培养后经体胚发生诱导出的体胚的萌发率最高，可达94.44％。而植株再生率与培养基中Gln的添加量呈正相关，即植株再生率随培养基中Gln浓度的升高而升高，在Gln添加量为1g/L时，植株再生率最高，可达19.00％。

上述9种培养基过渡培养14d的胚性愈伤组织经过体胚诱导后，统计经0-0.5g/L的水解酪蛋白(CH)培养的每克胚性愈伤组织可形成的体细胞胚胎数量及形成体胚的萌发率、植株再生率，其结果如下表所示：

表5.水解酪蛋白浓度对体胚发生数量、体胚萌发率及植株再生率的影响

CH浓度体胚发生数体胚萌发率植株再生率0g/L60.29±30.85个/g68.75％4.13％0.25g/L62.04±13.08个/g92.75％21.75％0.5g/L69.56±30.66个/g83.33％17.56％

由上表可见，在特定浓度范围内，长白落叶松体胚发生数随该培养基中CH浓度增加而增加，当CH浓度为0.5g/L时，可获得的体胚量最多，为69.56±30.66个/g，而体胚的萌发率与植株再生率均是随处理的CH浓度升高而先升高后降低，即在该培养基CH浓度为0.25g/L时体胚的萌发、植株再生率达到最高，其分别为92.75％与21.75％。

实施例4：

将实施例1中所述的胚性愈伤组织接种于含或不含1mg/LABA、0.15mg/L2，4-D、0.05mg/LBA及0.05mg/LKT，60g/L蔗糖，10g/L肌醇，其他条件同实施例1的培养基中过渡培养14d的胚性愈伤组织经过诱导后，在其不同生长调节剂的组合的培养基中每克胚性愈伤组织可形成的体细胞胚胎数如下表所示：

表6.添加生长调节物对体胚发生数量的影响

ABA2，4-DBAKT体胚发生数1mg/L0.15mg/L0.05mg/L0.05mg/L25.63±4.26个/g-0.15mg/L0.05mg/L0.05mg/L37.27±11.6个/g1mg/L---11.03±2.91个/g----37.39±3.84个/g

由上表可见，胚性愈伤组织在添加1mg/LABA的培养基中培养，会明显降低其在体胚发生阶段体胚的诱导数量；培养基中添加2，4-D、BA及KT对胚性愈伤在体胚诱导中体胚的发生量几乎无影响，但添加2，4-D、BA及KT可以再一定限度上缓解ABA对胚性愈伤体胚发生时的抑制作用。

实施例5：

将实施例1中所述的胚性愈伤组织接种于含有60g/L蔗糖，10g/L肌醇，其他条件同实施例1的培养基中过渡培养0、1、7、14、21及28d，随后进行诱导，最后统计其每克胚性愈伤组织可形成的体细胞胚胎数及形成体胚的萌发率、植株再生率的结果如下表所示：

表7.培养时间对体胚发生数量、体胚萌发率及植株再生率的影响

培养时间体胚发生数体胚萌发率植株再生率0d32.33±8.39个/g62.67％11.00％1d51.0±17.78个/g83.33％33.33％7d68.0±18.68个/g100％33.33％14d88.00±1.73个/g100％50.00％21d35.67±1.53个/g100％16.67％28d34.5±23.17个/g100％16.67％

由上表可知，体胚的发生数量与植株再生率随胚性愈伤组织在该发明所述的培养基中培养时间的延长有明显变化，过渡培养1d的愈伤组织相对直接进行体胚发生的愈伤其体胚发生数与体胚的生根率明显增加；当过渡培养时间从1d延长至14d时体胚发生数与植株再生率持续增加，而当过渡培养时间从14d继续延长时，愈伤组织的体胚发生能力则明显下降，过渡培养21d后的愈伤其体胚发生数量及植株再生率几乎与未经过该培养基培养的愈伤相同。体胚萌发率相对稳定，并不随培养时间的延长而发生较明显的变化。

在后续的体胚发生阶段的培养过程中发现，未经本发明所述的培养基培养的愈伤形成体胚的周期均超过45d，而经过本发明所述的培养基培养的胚性愈伤形成体胚的时间随在该培养基中培养时间的延长而缩短，即经过7d培养的愈伤形成体细胞胚的周期缩短至20d左右；经过14d培养的愈伤形成体胚的周期则约为15d；而当愈伤经过21d的培养时，体胚的形成周期甚至可以缩短至10d以内，故本发明所提供的方法可缩短体细胞胚发生所需要的周期。

实施例6：

将实施例1中所述的胚性愈伤组织接种于含有60g/L蔗糖，10g/L肌醇，0.5g/L肌醇，0.25g/LCH，其他条件同实施例1的培养基中过渡培养14d，其体胚的发生量最高可达330个/g。虽然这个体胚发生频率与现有的最佳体系持平，但由于体胚发生所需的时间缩短了45％-65％，故在相同时间内本方法的体胚发生效率较现有最佳体系提高了近40％。而且经本方法获得的体胚萌发率也较已有体系提高了近30％，植株再生率也提高了20左右％。

综上所述，采用本发明所述培养基及其培养方法可在体胚诱导前对胚性愈伤组织的质量进行改善，缩短体胚发生周期，提高了高质量体胚发生量和植株再生率。此外，本发明所述的方法不需要经过液体同步化培养，省去了液体培养所需的设备成本。