用于从阿魏酸快速和高产率产生香草醛的恶臭假单胞菌KT2440的基因工程化

摘要

本发明涉及基于基因工程假单胞菌菌株从阿魏酸产生香草醛的改进的生物催化方法，以及涉及所述假单胞菌菌株。

说明书

本发明涉及基于基因工程假单胞菌菌株从阿魏酸产生香草醛酸的改进的生物催化方法，以及涉及所述假单胞菌菌株。

技术背景

香草醛(4-羟基-3-甲氧基苯甲醛)，香草兰香料的感官化合物，是全世界数量上最广泛使用的调味剂之一。其需求量长久以来超过植物源香草兰(Vanillaplanifolia)的供应量。目前，大部分香草醛从愈创木酚(源自化石原料)和木质素(来自木浆业的废料中的组分)化学地合成(RamachandraRao和Ravishankar，2000)。然而，对这种“等同天然的”香草醛(大多用于食物和饮料工业中)的需求转向“天然”香草醛，原因在于消费者的健康和营养意识不断上升。因此，生物技术生产“天然”香草醛变得越来越重要(综述见Krings和Berger，1998；Priefert等人，2001)。

已经尝试通过体外培养的香草兰细胞产生香草醛(Davidonis和Knorr，1991)。还使用基因修饰的酵母株实施从头合成(Hansen等人，2009)。然而，主要重点放在使用分离的酶或不同原核微生物作为完整细胞生物催化剂的生物转化方面(Havkin-Frenkel和Belanger，2008；Berger，2009)。

除了木质素和酚类芪如丁香酚外，阿魏酸生物转化成香草醛是研究最充分的产生“天然”香草醛的方法(综述见Rosazza等人，1995；Priefert等人，2001)。前体阿魏酸(3-(4-羟基-3-甲氧基-苯基)丙-2-烯酸)(一种羟基肉桂酸)，是高度丰富的物质，原因在于它是许多植物细胞壁的组分(Ishikawa等人，1963；Escott-Watson和Marais，1992；Ishii，1997；Oosterveld等人，2000)。已经评价了用于从阿魏酸产生香草醛的许多不同微生物，包括大肠杆菌(E.coli)、假单胞菌属(Pseudomonasssp.)、红球菌属(Rhodococcusssp.)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、黑曲霉(Aspergillusniger)、朱红秘孔菌(Pycnoporouscinnabarinus)、拟无枝酸菌属(Amycolatopsisssp.)和链霉菌属(Streptomycesssp.)的重组菌株(Lesage-Meessen等人，1996；Okeke和Venturi，1999；Muheim和Lerch，1999；Achterholt等人，2000；Overhage等人，2003；Peng等人，2003；Plaggenborg等人，2006；Yoon等人，2007；Barghini等人，2007；Hua等人，2007；DiGioia等人，2010；Tilay等人，2010；Fleige等人，2013)。然而，在大多数情况下，香草醛产率低并且生物转化反应缓慢。低产率可以大多归因于香草醛的高度毒性(Krings和Berger，1998)。用吸附剂树脂增强香草醛的产生改进了香草醛水平直至19.2gl^-1，但是约43％的摩尔产率相当低(Hua等人，2007)。其他缺点是异源基因表达低效和质粒不稳定。重点还关注防止香草醛进一步降解成香草醇或香草酸(Stentelaire等人，1997；Bonnin等人，1999；Oddou等人，1999；Civolani等人，2000；Overhage等人，2000)。

来自假单胞菌属(Pseudomonas)的细菌显示宽大的代谢通用性，因为它们可以利用广泛类型的芳族分子作为唯一碳源(Clarke，1982)。假单胞菌属物种菌株HR199、荧光假单胞菌(P.fluorescens)BF13和恶臭假单胞菌(P.putida)KT2440中的阿魏酸分解代谢通过如图1中所示的辅酶A-依赖性非β氧化途径发生(Narbad和Gasson，1998；Gasson等人，1998；Overhage等人，1999b；Plaggenborg等人，2003；Calisti等人，2008)。首先，通过阿魏酰辅酶A合成酶(EC6.2.1.34；由fcs编码)催化，阿魏酸活化成阿魏酰辅酶A。接着，通过烯酰辅酶A水合酶/醛缩酶(EC4.2.1.101；由ech编码)催化，将CoA硫酯水合并裂解成香草醛和乙酰-CoA。香草醛脱氢酶(EC1.2.1.67；由vdh编码)使香草醛氧化成香草酸，后者通过香草兰酸-O-脱甲基酶(EC1.14.13.82；由vanAB编码)进一步分解代谢成原儿茶酸。Overhage等人(1999b)还提出一条由PP_3355(aat)编码和可能由PP_3354编码的酶所催化的经4-羟基-3-甲氧苯基-β-酮丙酰-CoA和香草基-CoA的第二途径。

最近研究已经使用荧光假单胞菌的代谢工程化菌株用于从阿魏酸产生香草醛(DiGioia等人，2010)。通过缺失香草醛脱氢酶基因vdh和通过在低拷贝载体上过量表达结构基因fcs和ech，作者能够从10mM阿魏酸产生至多8.41mM香草醛，这是迄今用假单胞菌菌株产生的香草醛最高的最终滴度。

用于微生物产生香草醛的现有技术方案仍然具有以下一个或多个缺点：低阿魏酸转化率、低香草醛摩尔产率、明显副产物形成。

奠定本发明基础的问题因此是提供避免至少一个上文所述缺点的方法。

发明简述

通过以下方式解决了上文提到的问题：提供假单胞菌属细菌的基因工程菌株，所述基因工程菌株具有借助辅酶A依赖性非β氧化途径催化阿魏酸分解代谢成香草醛的能力。

在一个具体实施方案中，使用非致病性完全测序的恶臭假单胞菌菌株KT2440(ATCC47054)(Nelson等人，2002)，所述菌株是生物安全菌株恶臭假单胞菌mt-2的无质粒衍生物(Kojima等人，1967；Williams和Murray，1974；Nakazawa，2002)。通过基因修饰，可以建立一种使用无质粒静息恶臭假单胞菌突变体细胞，将阿魏酸生物转化成香草醛的高度高效方式。特别地，使用upp反选择系统(Graf和Altenbuchner，2011)对恶臭假单胞菌KT2440的遗传操作产生能够将阿魏酸快速转化成香草醛，同时摩尔产率高达86％、生产率高和仅少量副产物形成的细胞。

遗传优化所述非致病恶臭假单胞菌菌株KT2440以将阿魏酸以特别方式转化成香草醛。缺失香草醛脱氢酶基因(vdh)不足以防止香草醛降解。通过转座子诱变鉴定的钼酸盐转运蛋白额外失活产生不能够依赖香草醛作为唯一碳源生长的菌株。通过引入强tac启动子系统增强阿魏酰辅酶A合成酶(fcs)和烯酰辅酶A水合酶/醛缩酶(ech)的结构基因的染色体表达，进一步优化生物转化。进一步基因工程仅在3小时内就导致高达86％的高初始转化率和高摩尔香草醛产率，伴随很低的副产物水平。这代表了迄今用假单胞菌菌株获得的最高生产率和摩尔香草醛产率。连同其高阿魏酸耐受性，新开发的无质粒假单胞菌菌株代表了生物技术产生香草醛的有前景候选者。

附图简述

图1：提出在假单胞菌菌株中阿魏酸经香草醛分解代谢的途径。右侧显示从4-羟基-3-甲氧苯基-β-羟丙酰-CoA至香草酸的备选途径(由Overhage等人，1999b提出)。由虚线箭头指示香草醛还原成香草醇。问号代表未知酶催化的反应。

图2：本发明中所用的恶臭假单胞菌突变株中烯酰辅酶A水合酶/醛缩酶(ech)、阿魏酰辅酶A合成酶(fcs)和香草醛脱氢酶(vdh)、β-酮硫解酶(aat)和酰基-CoA脱氢酶(PP_3354)的结构基因的组织架构。描绘了包含lac操纵基因(P_tac)和lac阻遏蛋白基因(lacI^q)的tac启动子区的整合位点。

图3：恶臭假单胞菌突变菌株GN23、GN235、GN275和GN276在具有不同碳源的M9极限培养基中的生长。如通过箭头所示，菌株以0.05OD₆₀₀接种。通过测量OD₆₀₀记录生长。提供在30℃时24小时后的OD₆₀₀以显示菌株分别以葡萄糖、阿魏酸、香草酸和香草醛作为唯一碳源生长的能力。

图4：阿魏酸至香草醛的生物转化测定法。用恶臭假单胞菌菌株(a)GN23、(b)GN235、(c)GN276、(d)GN299、(e)GN347、(f)GN440、(g)GN441和(h)GN442的5x10⁹个静息细胞ml^-1启动阿魏酸生物转化成香草醛之前，将代谢基因ech和fcs用5mMIPTG诱导6小时。通过HPLC测量阿魏酸(黑色圆圈)、香草醛(白色圆圈)、香草醇(黑色三角形)和香草酸(白色三角形)的浓度并且对转化时间作图。本图显示至少三个独立重复的测定法的均值。标准差小于10％。

图5：诱导物IPTG的量对阿魏酸生物转化成香草醛的影响。用5x10⁹个静息细胞ml^-1启动阿魏酸生物转化成香草醛之前，将细胞恶臭假单胞菌GN299用(a)1mMIPGT和(b)5mMIPTG诱导6小时。通过HPLC测量阿魏酸(黑色圆圈)、香草醛(白色圆圈)、香草醇(黑色三角形)和香草酸(白色三角形)的浓度并且对转化时间作图。本图显示至少三个独立重复的测定法的均值。标准差小于10％。

图6：(a)诱导时间和(b)恶臭假单胞菌GN299静息细胞的数量对阿魏酸生物转化成香草醛的影响。(a)用5x10⁹个静息细胞ml^-1启动阿魏酸生物转化成香草醛之前，将细胞用5mMIPTG诱导2小时、4小时和6小时。(b)用变动数量的静息细胞(5x、10x和20x10⁹个细胞ml^-1)启动阿魏酸生物转化成香草醛之前，将细胞用5mMIPTG诱导6小时。通过HPLC测量并且在生物转化测定法开始(0小时)和结束(18小时)显示阿魏酸(黑色条形)、香草醛(白色条形)、香草醇(深灰色条形)和香草酸(浅灰色条形)的浓度。本图显示至少三个独立重复的测定法的均值。标准差由误差线表示。

图7：(a)阿魏酸浓度和(b)香草醛浓度对生物转化的影响。用恶臭假单胞菌GN299的5x10⁹个静息细胞ml^-1启动阿魏酸生物转化成香草醛之前，将代谢基因ech和fcs用5mMIPTG诱导6小时。(a)渐增浓度的阿魏酸(10、20、30和40mM)用于向香草醛转化。(b)渐增浓度的香草醛(0、10、15、20和30mM)在生物转化测定法开始随10mM阿魏酸一起添加。通过HPLC测量并且在生物转化测定法开始(0小时)和结束(18小时)时显示阿魏酸(黑色条形)、香草醛(白色条形)、香草醇(深灰色条形)和香草酸(浅灰色条形)的浓度。本图显示至少三个独立测定法的均值。标准差由误差线表示。

图8：M9极限培养基中恶臭假单胞菌突变株GN299对不同(a)阿魏酸浓度和(b)香草醛浓度的耐受性。在含有0.4％葡萄糖和渐增浓度的(a)阿魏酸和(b)香草醛的M9极限培养基素中以0.1OD₆₀₀接种后，通过测量OD₆₀₀记录生长。提供在30℃时24小时后的OD₆₀₀以分别显示GN299对阿魏酸和香草醛的不同浓度的耐受性。本图显示至少三个独立测定法的均值。标准差由误差线表示。

发明详述

A.一般定义

“去调节”应当以其最广意义理解(上调或下调、放大或衰减、增加或降低活性/功能)，并且包括通过本领域技术人员熟知的不同手段增加或下降或完全关闭或开启靶，例如酶(靶酶)活性或其他有代谢活性的蛋白质(靶蛋白)活性。

合适操作可以在蛋白质/酶水平进行，改变氨基酸序列或氨基酸残基；或可以在核酸水平进行，改变例如遗传信息或调节遗传元件。合适的方法包括例如增加或减少基因工程生物中基因和/或酶/蛋白质分子的拷贝数，或调整酶的另一个特征，影响其酶活性，或调整蛋白质的另一个特征，影响其生物活性(例如代谢活性)，这随后对讨论的代谢途径产生所需的影响。

合适的遗传操作还可以包括，但是不限于，改变或修饰与特定基因表达相关的调节序列或位点(例如通过移除或引入强启动子、诱导型启动子或多个启动子)、调整特定基因的染色体位置、改变与特定基因毗邻的核酸序列如核糖体结合位点或转录终止子、减少或增加特定基因的拷贝数、修饰参与特定基因转录和/或特定基因产物翻译的蛋白质(例如，调节蛋白、阻抑蛋白、增强子、转录激活物等)，或本领域常规的去调节特定基因表达的任何其他常规手段(包括但不限于使用反义核酸分子或其他方法以敲除或阻断靶蛋白的表达)。

更具体地，术语“去调节”、“去调节的”和“去调节作用”指改变或修饰微生物中的至少一个基因，其中相对于该改变或修饰不存在时的香草醛产量，所述改变或修饰导致微生物中香草醛产生效率增加。在一些实施方案中，被改变或修饰的基因编码生物合成途径中的酶或转运蛋白，从而改变或修饰微生物中生物合成酶的水平或活性或改变或修饰运输特异性或效率。在一些实施方案中，改变或修饰了编码生物合成途径中酶的至少一个基因，从而该酶的水平或活性相对于未改变基因或野生型基因存下的水平增强或增加。去调节作用还包括改变一个或多个基因的编码区以产生例如具有反馈抵抗性或具有更高或更低比活性的酶。另外，去调节进一步涵盖编码转录因子(例如，激活物、阻遏蛋白)的基因的遗传变异，所述转录因子调节编码酶或转运蛋白的基因的表达。更具体地，去调节可以导致“降低的”酶活性，其中所产生的酶活性小于如非去调节状态下所观察到的酶活性的100％，或被“关闭”，即可逆或不可逆关闭、不再存在或通过常规分析工具(如酶活性测定法)至少不再可检出。

上调的特定方式是放大靶基因，尤其通过实施增加基因活性的“向上”突变(例如通过使用强表达信号的基因放大)和/或增强或增加蛋白质的酶活性或代谢活性的点突变来放大。

下调的优选方式是衰减靶基因，尤其通过实施降低基因活性的“向下”突变(例如通过基因缺失或破坏、使用弱表达信号)和/或摧毁或降低蛋白质的酶活性或代谢活性的点突变来降低。

特别地，可以如此操作基因，从而将一个或多个核苷酸从宿主生物的染色体缺失。也可以通过引入导致基因产物活性降低的一个或多个基因突变，获得降低的基因产物活性。降低的活性可以是酶活性或其他代谢活性降低＞50％未突变或未改变的酶活性，或活性降低＞90％，或活性更优选地降低＞95％，或活性更优选地降低＞98％，或活性甚至更优选地降低＞99％或活性甚至更优选地降低＞99.9％。

也可以通过引入导致基因产物活性增加的一个或多个基因突变，获得增加的基因产物活性。增加的活性可以是酶活性或其他代谢活性增加例如1倍至1000倍未突变或未改变的酶活性，或活性增加2倍至100倍，或更优选地，活性增加5倍至50倍或10倍至20倍。

术语“异源”或“外源”指如本文所述的蛋白质、核酸和相应序列，它们被引入如本文定义的遗传操作(工程化)的微生物中或由其产生(转录或翻译)并且所述微生物在所述操作之前不含有或不产生所述序列。特别地，所述微生物在所述操作之前可以不含有或不表达所述异源酶活性，或可以含有或表达具有可比活性或特异性的内源酶，所述内源酶由不同编码序列编码或由具有不同氨基酸序列的酶编码，并且所述内源酶可以转化与所述外源酶相同的底物或多种底物。

“微生物”指真核生物并且尤其指原核生物，并且更具体地指细菌。

“衍生自亲本微生物”的微生物指通过任何类型的操作或这类操作的组合修饰的微生物，所述操作选自化学技术、生物化学技术或微生物技术，尤其基因工程技术。在后一种情况下，它们称作“基因工程”微生物或“基因修饰”微生物。所述操作导致所述亲本微生物的生物学特征的至少一种变化。作为一个例子，可以将异源酶的编码序列引入所述生物或可以缺失亲本微生物的编码序列。借助所述变化，可以向所述亲本微生物增加至少一个特征、替代其中的至少一个特征或从中缺失至少一个特征。所述变化可以例如导致所述微生物的代谢特征如此改变，例如，所述微生物表达的酶的底物(所述亲本微生物过去根本无法利用或以不同效率利用所述底物)以特征性方式(例如，如果与亲本微生物相比，按不同的量、比例或以不同效率)代谢，和/或代谢终产物或中间产物由所述修饰的微生物以特征性方式(例如，如果与亲本微生物相比，按不同的量、比例或以不同效率)形成。

可以将微生物按物理或环境方式改变或“修饰”，以相对于起始微生物的基因产物的表达水平，按升高或更低的水平表达基因产物。例如，微生物可以用下述(化学或遗传)试剂处理或在下述(化学或遗传)试剂存在下培养，其中所述试剂已知或疑似增加或减少特定基因的转录和/或翻译和/或特定基因产物的翻译，从而增加或减少转录和/或翻译。备选地，可以在下述温度培养微生物，其中选择所述温度以增加或减少特定基因的转录和/或翻译和/或特定基因产物的翻译，从而增加或减少转录和/或翻译。

“基因修饰的”指按照上文意义通过本领域可获得的基因工程技术(例如转化、突变、同源重组)改变的微生物。

术语“能够利用”指本发明微生物将底物(例如阿魏酸)转化成至少一个在结构上和/或空间上不同的化学产物的能力。

“参与阿魏酸发酵转化成香草醛或与之相关的酶活性”意指影响阿魏酸转化成香草醛和/或副产物的酶的任何催化活性或调节活性，如可以通过如下文定义的任何参数集合确定。

不同产量参数(“产量”或YP/S；“比生产率产量”；或空间-时间-产量：(STY))是本领域熟知的并且例如由Song和Lee，2006所述那样测定。

“产量”和“YP/S”(各自以所产生产物的质量/所消耗物料的质量表述)在本文中作为同义词使用。

比生产率-产量描述每小时和每升发酵液每g生物质产生的产物(如香草醛)的量。称作WCW的细胞湿重的量描述了生物化学反应中有生物活性的微生物的量。该值作为g产物/gWCW/小时(即g/gWCW^-1h^-1)给出。

术语“发酵产生”或“发酵”指微生物(受所述微生物中所含或由其产生的酶活性辅助)在利用至少一种向温育添加的碳源的细胞培养物中产生化学化合物的能力。

术语“发酵液”理解为意指基于发酵过程并且尚未建立或已经建立(例如，如本文所述)的水溶液。

“重组宿主”可以是含有克隆载体或表达载体的任何原核细胞或真核细胞。本术语还在意在包括那些原核细胞或真核细胞，其中已经将所述细胞基因工程化以在宿主细胞的染色体或基因组中含有克隆的基因。

术语“重组微生物”包括微生物(例如，细菌、酵母、真菌等)或微生物菌株(例如，细菌、酵母细胞、真菌细胞等)，所述微生物或微生物菌株已经在遗传上改变、修饰或工程化(例如，基因工程化)，从而如与衍生所述微生物或微生物菌株的天然存在微生物或“亲本”微生物相比，它们显示出改变、修饰或不同的基因型和/或表型(例如，当基因修饰影响编码微生物的核酸序列时)。

参与形成本发明基础的香草醛生物合成途径的特定酶涵盖：

阿魏酰辅酶A合成酶(EC6.2.1.34；由fcs编码)。

烯酰辅酶A水合酶/醛缩酶(EC4.2.1.101；由ech编码)。

香草醛脱氢酶(EC1.2.1.67；由vdh编码)，

β-酮硫解酶(EC2.3.1.16，由aat编码)

酰基-CoA-水解酶(EC3.1.2.20，由PP_3354编码)

钼酸盐转运蛋白(由modABC编码)

B.具体实施方案

本发明尤其涉及以下实施方案：

1.用于从阿魏酸产生香草醛的生物催化方法，其中

a)在阿魏酸存在下培养具有将阿魏酸转化成香草醛的能力的基因工程化的假单胞菌属(Pseudomonas)细菌菌株；并且

b)任选地从培养基分离如此形成的香草醛；其中所述基因工程细菌菌株具有降低、削弱的以香草醛作为唯一碳源而生长的能力。优选地，对基因工程菌株未观察到以香草醛作为唯一碳源而生长。

2.根据实施方案1的方法，其中所述基因工程菌株含有至少以下基因修饰：

i)下调、尤其完全或定量抑制细胞摄取钼酸盐，这优选地导致所述降低的以香草醛生长的能力。

3.根据实施方案2的方法，其中所述基因工程菌株额外地含有至少以下基因修饰：

ii)下调香草醛脱氢酶活性，尤其相应的基因(vdh)，例如通过部分缺失或完全缺失相应遗传信息下调。

4.实施方案1至3中任一项的方法，其中通过下调周质钼酸盐结合蛋白(modA)下调细胞钼酸盐摄取，例如通过部分缺失或完全缺失相应遗传信息下调。

5.实施方案1和4中任一项的方法，其中通过缺失操纵子modABC下调细胞钼酸盐摄取。

6.根据前述实施方案中任一项的方法，其中上调至少一种以下酶活性，并且尤其上调以下酶的基因

iii)阿魏酰辅酶A合成酶和

iv)烯酰辅酶A水合酶。

可以例如通过以染色体方式增加这类基因的拷贝数或通过引入携带所述遗传信息的重组表达载体或通过修饰基因表达、尤其通过使用强启动子，完成上调。

7.根据实施方案6的方法，其中上调阿魏酰辅酶A合成酶(fcs)基因和烯酰辅酶A水合酶(ech)基因的染色体表达。

8.根据实施方案7的方法，其中阿魏酰辅酶A合成酶(fcs)基因和烯酰辅酶A水合酶(ech)基因的表达处于调节元件控制下，所述调节元件包含任选与lacI或lacI^q组合的强启动子、任选地诱导型启动子，尤其强tac启动子，尤其与lacI^q元件组合的强tac启动子。

9.根据前述实施方案中任一项的方法，其中额外地下调至少一种以下酶活性，尤其至少一种相应基因：

v)醛脱氢酶PP_2680和/或PP_0545vi)苯甲醛脱氢酶PP_1948

特别地，可以通过相应遗传信息的部分或完全染色体缺失完成下调。

10.根据前述实施方案中任一项的方法，其中额外地下调至少一种以下酶活性，尤其至少一种相应基因：

vii)β-酮硫解酶PP_3355(aat)

viii)酰基-CoA脱氢酶PP_3354。

特别地，可以通过相应遗传信息的部分或完全染色体缺失完成下调。

11.根据前述实施方案中任一项的方法，其中待基因工程化的微生物菌株是恶臭假单胞菌菌株。

12.根据前述实施方案中任一项的方法，其中通过下调表面黏附蛋白(lapA)、尤其通过下调相应的基因，将所述恶臭假单胞菌菌株基因工程化。特别地，可以通过部分或完全缺失相应遗传信息完成下调。

13.根据前述实施方案中任一项的方法，所述方法有氧地和/或在10℃至40℃或20℃至30℃范围内的温度和/或在6至8或6.5至7.5范围内的pH实施。

14.根据前述实施方案中任一项的方法，其中反应在1mM至50mM、尤其5mM至15mM或8mM至12mM(如约10mM)的初始阿魏酸浓度、优选地在水介质中实施。

15.根据前述实施方案中任一项的方法，其中反应在所述细菌菌株的完整细胞或其细胞匀浆或从所述匀浆获得的级分中进行。

16.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述细菌菌株以游离或固定形式使用。

17.根据前述实施方案中任一项的方法，所述方法连续或不连续地进行。

18.如实施方案1至12中任一项所限定的基因工程假单胞菌菌株。

19.实施方案18的基因工程假单胞菌菌株，所述基因工程假单胞菌菌株通过将恶臭假单胞菌基因工程化获得，尤其从恶臭假单胞菌KT2440获得，其中所述基因工程菌株优选地是无质粒的。

20.实施方案19的基因工程假单胞菌菌株，其选自GN23、GN235、GN237、GN275、GN276、GN299、GN347、GN440、GN441和GN442；或其功能性变体或突变株，所述菌株保留将阿魏酸转化成香草醛的能力，和/或不以香草醛作为唯一碳源生长和/或其中钼酸盐摄取被下调。

21.在另一个实施方案中，本发明的生物转化系统，例如采用恶臭假单胞菌GN442时，可以包含合适的吸附性树脂以减少产物香草醛的毒性。

C.本发明的其他实施方案

C.1其他基因的去调节

如果与去调节参与如附图1中所述的非β氧化阿魏酸分解代谢途径的至少一个其他基因组合，则可以进一步改进用如本文所述的重组假单胞菌菌株发酵产生香草醛。

C.2本发明的蛋白质

尽管本发明的优选实施方案基于通过缺失基因序列和/或增加特定酶表达速率，使酶活性或蛋白质活性去调节的方案，但本发明不限于此。

此外，可以通过将合适突变引入本文中鉴定的一个或多个氨基酸序列下调酶/蛋白质活性，达到相似的改善。可以通过产生具有改善活性的蛋白质/酶突变体，实施上调。

因此在该上下文下，本发明还涉及具体描述的酶/蛋白质的“功能性等同物”或“类似物”或“功能性突变”。

例如，“功能性等同物”意指这些酶，它们在用于酶活性的试验中显示至少1至10％、或至少20％、或至少50％、或至少75％或、至少90％更高或更低的如本文中所定义的酶活性。

根据本发明，“功能性等同物”尤其也意指突变体，其中在以上述的氨基酸序列的至少一个序列位置中，所述突变体具有与具体所述氨基酸不同的氨基酸，但是拥有前述生物学活性之一。“功能性等同物”因此包括通过1个或多个，像1至20个、1至15个或5至10个氨基酸添加、置换、缺失和/或倒位可获得的突变体，其中所述的变化可以出现在任何序列位置内，前提是它们导致具有本发明特性谱的突变体。如果反应性模式在突变体与未改变的多肽之间定量地符合，即如果以不同速率转化例如相同的底物，则尤其也提供了功能等同性。下表中显示适宜的氨基酸置换的例子。

以上意义下的“功能性等同物”还是所述多肽的“前体”以及该多肽的“功能衍生物”和“盐”。

在这种情况下，“前体”是所述多肽的具有或没有所希望生物学活性的天然或合成前体。

表述“盐”意指本发明蛋白质分子的羧基的盐以及氨基的酸加成盐。羧基的盐可以按照已知方式产生并包含无机盐，例如钠、钙、铵、铁和锌盐，和与有机碱(例如，胺如三乙醇胺、精氨酸、赖氨酸、哌啶等)的盐。本发明也涵盖酸加成盐，例如与无机酸(如氢氯酸或硫酸)的盐和与有机酸(如乙酸、草酸)的盐。

本发明多肽的“功能衍生物”也可以利用已知技术在功能性氨基酸侧基团上或在它们的N末端或C末端处产生。此类衍生物包括例如羧酸基的脂族酯、通过与氨或者与伯胺或仲胺反应可获得的羧酸基的酰胺；通过与酰基反应产生的游离氨基的N-酰基衍生物；或通过与酰基反应产生的游离羟基的O-酰基衍生物。

“功能性等同物”天然地包括可以从其他生物获得的多肽以及天然存在的变体。例如，可以通过序列比较建立同源序列区域的区域，并且可以基于本发明的具体参数确定等同酶。

“功能性等同物”也包括本发明多肽的片段，优选地各个结构域或序列基序，它们例如显示所希望的生物学功能。

另外，“功能性等同物”是融合蛋白，所述融合蛋白具有上文所述的多肽序列或从中衍生的功能性等同物之一和处于功能性N末端或C末端结合(即不存在融合蛋白诸部分的相互功能妨碍)的至少一个功能不同的其他异源序列。这些异源序列的非限制性例子例如是信号肽、组氨酸锚状物或酶。

根据本发明也包括的“功能性等同物”是具体所公开蛋白质的同源物。这些同源物拥有如上文所述的百分数同一性值。所述值指与具体所公开氨基酸序列的同一性，并可以根据Pearson和Lipman(1988)的算法计算。

也可以从BLAST比对、算法blastp(蛋白质-蛋白质BLAST)或通过如下文给出的Clustal设置计算出同一性百分数值。

本发明同源多肽的同一性百分数尤其意指氨基酸残基相对于本文中具体所述氨基酸序列之一的总长度的同一性百分数。

在可能的蛋白质糖基化的情况下，本发明的“功能性等同物”包括上文所命名类型的蛋白质，所述蛋白质处于去糖基化和糖基化形式以及可以通过改变糖基化模式来获得的修饰形式。

本发明蛋白质或多肽的此类功能性等同物或同源物可以通过诱变例如点突变、加长或缩短所述蛋白质来产生。

本发明蛋白质的此类功能性等同物或同源物可以通过筛选突变体(例如短缩突变体)的组合数据库鉴定。例如，可以通过在核酸水平组合诱变(例如通过酶促连接合成性寡核苷酸的混合物)产生蛋白质变体的多样化数据库。存在可以用于从简并的寡核苷酸序列产生潜在同源物的数据库的众多方法。可以在自动DNA合成仪上实施简并基因序列的化学合成，并且可以将合成的基因随后连接于合适的表达载体中。简并基因的使用使得在一种混合物中产生编码潜在蛋白质序列集合的全部序列成为可能。用于合成简并寡核苷酸的方法是本领域技术人员已知的(例如Narang，S.A.(1983)；Itakura等人，(1984)(a)；Itakura等人，(1984)(b)；Ike等人，(1983))。

在现有技术中，几项技术已知用于筛选通过点突变或缩短法产生的组合数据库的基因产物并且用于筛选cDNA文库中具有所选特性的基因产物。这些技术可以适应于快速筛选通过组合诱变本发明同源物所产生的基因库。最常用于筛选大基因库的基于高通量分析的技术包括在可以复制的表达载体中克隆基因库，用所得载体数据库转化合适的细胞并在这样的条件下表达组合基因，在所述条件下检测所需的活性有助于编码检测到其产物的基因的载体的分离。递归总体诱变(REM)，一项提高数据库中功能性突变体频率的技术，可以与筛选试验组合地使用，以鉴定同源物(Arkin和Yourvan(1992)；Delgrave等人，(1993))。

C.3编码核酸序列

本发明还涉及核酸序列，所述核酸序列编码如本文定义的酶/蛋白质并且可以用于开展所需要的基因工程操作。

本发明也涉及与本文中具体公开的序列具有某种“同一性”程度的核酸。两种核酸之间的“同一性”意指每种情况下在该核酸的全长范围内核苷酸的同一性。

例如，可以借助Informax(USA)公司VectorNTISuite7.1程序，使用Clustal方法(HigginsDG，SharpPM.((1989)))按以下设置计算同一性：

多重比对参数：

配对比对参数：

备选地，可以根据Chenna等人，(2003)、网页http：//www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html#html#和以下设置确定同一性

本文中提及的全部核酸序列(单链和双链DNA和RNA序列，例如cDNA和mRNA)可以按已知方式通过化学合成从核苷酸结构单元产生，例如通过各个重叠的互补性双螺旋核酸结构单元的片段缩合来产生。寡核苷酸的化学合成可以例如以已知方式通过亚磷酰胺(phosphoamidite)方法(Voet，Voet，第2版，WileyPress，NewYork，第896-897页)进行。合成性寡核苷酸的积聚和借助DNA聚合酶Klenow片段填补缺口和连接反应以及一般克隆技术在Sambrook等人(1989)中描述，见下文。

本发明也涉及编码以上蛋白质/酶及其功能性等同物之一的核酸序列(单链和双链DNA和RNA序列，例如cDNA和mRNA)，所述核酸序列可以例如使用人工核苷酸类似物获得。

本发明既涉及编码本发明多肽或蛋白质或其生物学活性区段的分离的核酸分子，并还涉及可以用作例如鉴定或扩增本发明编码性核酸的杂交探针或引物的核酸片段。

本发明的核酸分子可以额外含有来自编码性遗传区的3′和/或5′末端的非翻译序列。

本发明还涉及与具体所述核苷酸序列或其区段互补的核酸分子。

本发明的核苷酸序列使得产生可以用于鉴定和/或克隆其他细胞类型和生物中同源序列的探针和引物成为可能。此类探针或引物一般包含在“严格”条件(见下文)与本发明核酸序列的有义链或相应反义链的至少约12个、优选至少约25个，例如约40、50或75个连续核苷酸杂交的核苷酸序列区域。

“分离的”核酸分子与存在于该核酸分子的天然来源中的其他核酸分子分开，并且如果该核酸分子通过重组技术产生，还可以基本上不含其他细胞物质或细胞培养基，或如果它被化学地合成，可以不含化学前体或其它化学品。

可以借助分子生物学标准技术和根据本文提供的序列信息，分离本发明的核酸分子。例如，使用具体公开的完整序列之一或其区段作为杂交探针和(如在Sambrook，(1989)中描述的)标准杂交技术，可以从合适的cDNA文库分离cDNA。此外，包含所公开序列之一或其区段的核酸分子可以使用基于这种序列所构建的寡核苷酸引物，通过聚合酶链反应分离。以这种方式扩增的核酸可以克隆在合适的载体中并可以通过DNA测序进行表征。本发明的寡核苷酸也可以通过标准合成方法产生，例如使用自动DNA合成仪产生。

可以例如通过常规杂交技术或PCR技术从其他细菌(例如借助基因组文库或cDNA文库)分离本发明的核酸序列或其衍生物、这些序列的同源物或部分。这些DNA序列在标准条件下与本发明的序列杂交。

“杂交”意指多核苷酸或寡核苷酸在标准条件下与几乎互补性序列结合的能力，而在这些条件下非互补性配偶体之间不发生非特异性结合。为此，所述序列可以是90-100％互补。互补序列能够相互特异性结合的特性例如用于RNA印迹或DNA印迹中或用于PCR或RT-PCR的引物结合中。

保守区域的短寡核苷酸有利地用于杂交。然而，也可能使用本发明核酸的较长片段或完整序列用于杂交。这些标准条件根据所用的核酸(寡核苷酸、较长片段或完整序列)或根据何种类型的核酸-DNA或RNA用于杂交而变化。例如，DNA：DNA杂交分子的解链温度比相同长度的DNA：RNA杂交分子的解链温度低约10℃。

例如，根据具体的核酸，标准条件意指在浓度0.1x至5xSSC(1xSSC＝0.15MNaCI，15mM柠檬酸钠，pH7.2)或额外存在50％甲酰胺下的水性缓冲液中42和58℃之间的温度，例如42℃在5xSSC，50％甲酰胺中。有利地，DNA：DNA杂交分子的杂交条件是0.1xSSC和在约20℃至45℃之间、优选在约30℃至45℃之间的温度。对于DNA：RNA杂交分子，杂交条件有利地是0.1xSSC和在约30℃至55℃之间、优选在约45℃至55℃之间的温度。所述的这些杂交温度是在甲酰胺不存在下大约100个核苷酸长度及50％G+C含量的核酸的计算解链温度值的实例。DNA杂交的实验条件在相关遗传学教材(例如Sambrook等人，1989)中描述，并且可以例如根据核酸的长度、杂合体的类型或G+C含量，使用本领域技术人员已知的公式计算。本领域技术人员可以从以下教材获得杂交的进一步信息：Ausubel等人，(编著)，(1985)；Brown(编著)(1991)。

“杂交”尤其可以在严格条件下实施。此类杂交条件例如在Sambrook(1989)中或在CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中描述。

“严格”杂交条件尤其意指：在42℃于50％甲酰胺、5xSSC(750mMNaCI，75mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5xDenhardt溶液、10％硫酸葡聚糖和20g/mi变性剪切鲑精DNA组成的溶液中温育过夜，接着在65℃用0.1xSSC洗涤滤膜。

本发明还涉及具体公开或可衍生的核酸序列的衍生物。

因而，本发明的其他核酸序列可以从本文中具体公开的序列衍生并且可以因添加、替换、插入或缺失单个或几个核苷酸而与所公开的序列不同，并且也编码具有所需特性谱的多肽。

本发明也包括这样的核酸序列，其包含所谓沉默突变或根据特殊来源或宿主生物的密码子选择，与具体所述序列相比已经被改变，以及其天然存在变体例如剪接变体或等位变体。

本发明也涉及可以通过保守性核苷酸替换(即所讨论的氨基酸被具有相同电荷、大小、极性和/或溶解度的氨基酸置换)获得的序列。

本发明还涉及因序列多态性从具体公开的核酸衍生的分子。这些遗传多态性可以因自然变异存在于群体内部的个体之间。这些天然的变异通常引起基因核苷酸序列的1％至5％变异。

本发明核酸序列的衍生物意指例如在衍生的氨基酸水平具有至少60％同源性、优选至少80％同源性、极特别优选在整个序列范围内至少90％同源性(就氨基酸水平上的同源性而言，应当参考上文对所述多肽给出的细节)的等位变体。有利地，同源性可以在序列的局部区域内较高。

另外，衍生物也应当理解为是本发明核酸序列的同源物，例如动物、植物、真菌或细菌同源物、编码性和非编码性DNA序列的缩短序列、单链DNA或RNA。例如，同源物在DNA水平在本文具体公开的序列中所给出的整个DNA区域内具有至少40％、优选地至少60％、特别优选至少70％、极特别优选至少80％的同源性。

另外，衍生物应理解为是例如与启动子的融合物。添加至所述核苷酸序列的启动子可以通过至少一个核苷酸交换、至少一个插入、倒位和/或缺失进行修饰，尽管不损害所述启动子的功能性或效力。另外，所述启动子的效力可以通过改变它们的序列而增加或者可以完全以甚至不同属的生物的更有效启动子交换。

C.4本发明的构建体

本发明还涉及构建体如表达构建体，所述构建体含有处于调节性核酸序列的遗传控制下的编码可用于本发明中的多肽或融合蛋白的核酸序列；以及包含这些构建体中至少一者的载体。

根据本发明，“表达单元”意指具有表达活性的核酸，该核酸包含如本文中所定义的启动子，并且与一种待表达的核酸或一种基因功能性连接后，调节该核酸或该基因的表达，即其转录和翻译。因而在这种环境下，它也称作“调节性核酸序列”。除启动子之外，其他调节元件也可以存在，例如增强子。

根据本发明，“表达盒”或“表达构建体”意指表达单元，其与待表达的核酸或待表达的基因功能性连接。与表达单元相反，表达盒因而不仅包含调节转录和翻译的核酸序列，还包含应当由于转录和翻译而表达为蛋白质的核酸序列。

在本发明的上下文中，术语“表达”或“过量表达”描述微生物中由相应DNA编码的一种或多种酶的胞内活性的产生或增加。为此，例如可以在生物中插入基因、由另一种基因置换现存基因、增加基因或诸基因的拷贝数、使用强启动子或使用编码具有高活性的相应酶的基因，并且任选地可以组合这些措施。

优选地，本发明的此类构建体包含在各自编码序列5‘上游的启动子和3′-下游的终止子序列，并且任选地还包含常规调节元件，在每种情况下它们与编码序列功能性连接。

根据本发明，“启动子”、“具有启动子活性的核酸”或“启动子序列”意指与待转录的核酸功能性连接时调节该核酸转录的核酸。

在这种情况下，“功能性”或“有效”连接意指例如具有启动子活性的核酸之一和待转录核酸序列和任选地其他调节元件(例如能够使核酸转录的核酸序列及例如终止子)以如此方式依次连接，从而所述每种调节元件可以在该核酸序列的转录中履行其功能。这不必然需要化学意义上的直接连接。遗传控制序列如增强子序列也能够从更远位置或甚至从其它DNA分子上对靶序列发挥它们的功能。优选这样的排列，其中待转录的核酸序列位于启动子序列之后(即在3′端)，从而这两个序列彼此共价地结合。启动子序列与待转基因表达的核酸序列之间的距离可以小于200bp(碱基对)或小于100bp或小于50bp。

除了启动子和终止子之外，可以提及的其他调节元件的例子是靶向序列、增强子、多腺苷酸化信号、选择标记、扩增信号、复制起点等。合适的调节序列例如在Goeddel(1990)中描述。

本发明的核酸构建体特别包含从本文中具体所提及的那些序列或其衍生物和同源物中选出的序列，以及可以从本文中具体所提及的氨基酸序列中衍生的核酸序列，其中所述的序列有利地与控制(例如增加)基因表达的一种或多种调节信号有效或功能性连接。

除这些调节序列之外，对这些序列的天然调节作用仍可以在实际的结构基因之前存在，并且任选地可能已经遗传地改变，从而关闭天然调节作用并且已经增加所述基因的表达。核酸构建体也可以具有更简单的设计，即，在编码序列之前不插入任何额外的调节信号并且不去除天然启动子连同其调节作用。相反，使天然调节序列沉默，从而调节作用不再发生并且基因表达增加。

优选的核酸构建体还有利地含有与启动子功能性连接的允许核酸序列表达增加的一个或多个前述增强子序列。也可以在DNA序列的3′端插入额外的有利序列，如其他调节元件或终止子。本发明核酸的一个或多个拷贝可以含于该构建体中。该构建体也可以含有其他标记，如抗生素抗性或营养缺陷型补足基因(auxotrophy-complementinggene)，任选地用于对构建体的选择。

在启动子如cos-、tac-、trp-、tet-、trp-tet-、Ipp-、lac-、Ipp-lac-、laclq-、T7-、T5-、T3-、gal-、trc-、ara-、rhaP(rhaPBAD)SP6-、λ-PR-中或在有利地用于革兰氏阴性细菌的λ-PL启动子中含有合适调节序列的实例。在例如革兰氏阳性细菌启动子ace、amy和SPO2，在酵母或真菌启动子ADC1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中含有其他有利的调节序列。人工启动子也可以用于调节。

为表达，将核酸构建体插入宿主生物中，其中所述的核酸构建体有利地位于允许所述基因在该宿主中最佳表达的载体(例如质粒或噬菌体)中。除质粒和噬菌体外，载体也理解为意指本领域技术人员已知的全部其他载体，例如，病毒如SV40、CMV、杆状病毒和腺病毒、转座子、IS元件、噬菌粒、粘粒和线性或环状DNA。这些载体可以在宿主生物中自主复制或可以按染色体方式复制。这些载体代表本发明的又一实施方案。

合适的质粒例如是大肠杆菌中的pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pl_G200、pUR290、plN-lll113-B1、λgt11或pBdCI；诺卡氏菌型放线菌(Nocardioformactinomycetes)中的pJAM2；链霉菌属(Streptomyces)中的plJ101、plJ364、plJ702或plJ361；芽孢杆菌(bacillus)中的pUB110、pC194或pBD214；棒状杆菌(Corynebacterium)中的pSA77或pAJ667；真菌中的pALS1、plL2或pBB116；酵母中的2αM、pAG-1、YEp6、YEp13或pEMBLYe23或植物中的pLGV23、pGHIac+、pBIN19、pAK2004或pDH51。前述质粒代表可能质粒的小部分选择。其它质粒是本领域技术人员熟知的并且将在例如书籍CloningVectors(编者PouwelsP.H.等人)1985中找到。

在载体的又一个实施方案中，含有本发明核酸构建体或本发明核酸的载体可以有利地以线性DNA形式插入微生物中并且通过异源或同源重组整合到宿主生物的基因组中。这种线性DNA可以包含线性化载体如质粒或仅包含本发明的核酸构建体或核酸。

为异源基因在生物中的最佳表达，有利的是根据生物中所用的特定密码子选择改变核酸序列。该密码子选择可以基于计算机评价所讨论生物的其他已知基因来轻易确定。

本发明表达盒的产生基于合适启动子与合适的编码性核苷酸序列及终止子信号或多腺苷酸化信号的融合。为此使用常见的重组技术和克隆技术，如在例如J.Sambrook(1989)中以及T.J.Silhavy等人，(1984)中和Ausubel，F.M.等人，(1987)中所述那样。

将重组核酸构建体或基因构建体有利地插入用于合适的宿主生物内表达的宿主特异性载体中，以引起所述基因在宿主中最佳表达。载体是本领域技术人员熟知的并且将在例如“CloningVectors”PouwelsP.H.等人(1985)中找到。

C.5可以根据本发明使用的宿主

根据上下文，术语“微生物”意指起始微生物(野生型)或本发明的基因修饰微生物或这两者。

基因工程宿主细胞可以完全在染色体层面修饰，可以含有载体，例如携带所要求的遗传信息的质粒，或可以通过二者的组合进行修饰。

使用本领域技术人员熟悉的常见克隆方法和转染方法，例如共沉淀法、原生质体融合法、电穿孔法、逆转录病毒转染法等，以确保核酸在相应表达系统中表达。合适的系统例如在F.Ausubel等人，(1997)或Sambrook等人，(1989)中描述。

亲本微生物一般是具有从阿魏酸产生香草醛的能力的那些微生物。一般，这些微生物是假单胞菌属细菌。

合适的假单胞菌属菌株的非限制性例子是携带以上所确定的基因ech和fcs的那些，如：

恶臭假单胞菌KT2440ATCC47054假单胞菌属物种菌株HR199，和荧光假单胞菌BF13。

ATCC指美国典型培养物保藏中心，FERMBP指日本产业科技研究所的国立生命科学和人体技术研究所。

C.6发酵产生香草醛

本发明还涉及用于发酵产生香草醛的方法。

如根据本发明使用的发酵可以例如在搅拌式发酵罐、鼓泡塔和环流反应器中进行。可以在″Chmiel：Bioprozesstechnik：EinfuhrungindieBioverfahrenstechnik，Band1″中找到可能方法类型的综合概览，包括搅拌器类型和几何设计。在本发明的方法中，可用的常见变体是本领域技术人员(例如在″Chmiel，HammesandBailey：BiochemicalEngineering″中)已知或解释的以下变体，如分批发酵、补料分批、重复补料分批或另外伴随或不伴随生物质再循环的连续发酵。取决于生产菌株，可以用空气、氧、二氧化碳、氢气、氮气或适宜气体混合物实现鼓泡以实现良好产率(YP/S)。

应当使用的培养基必须以适宜的方式满足具体菌株的要求。对多种微生物的培养基的描述在美国细菌学学会手册“普通细菌学方法手册”(ManualofMethodsforGeneralBacteriology)(WashingtonD.C.，USA，1981)中给出。

可以根据本发明使用的这些培养基可以包含一种或多种碳源、氮源、无机盐、维生素和/或微量元素。

优选的碳源是糖，如单糖、二糖或多糖。极好的碳源例如是葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纤维素。糖也可以通过复杂化合物如糖蜜或来自糖精炼的其他副产品添加至培养基。也可以有利的是添加多种碳源的混合物。其他可能碳源是油和脂肪，如大豆油、葵花籽油、花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸、硬脂酸或亚麻酸、醇如甘油、甲醇或乙醇和有机酸如乙酸或乳酸。

氮源通常是有机或无机氮化合物或含有这些化合物的物质。氮源的实例包括氨气或铵盐，如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵或硝酸铵、硝酸盐、脲、氨基酸或复杂氮源，如玉米浆、大豆粉、大豆蛋白、酵母提取物、肉浸汁和其他等。氮源可以独立地使用或作为混合物使用。

可以在培养基中存在的无机盐化合物包含钙、镁、钠、钴、钼、钾、锰、锌、铜和铁的氯化物、磷酸盐或硫酸盐。

含硫无机化合物例如硫酸盐、亚硫酸盐、连二亚硫酸盐、连四硫酸盐、硫代硫酸盐、硫化物以及有机硫化合物如硫醇和硫羟可以用作硫源。

磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐可以用作磷源。

可以添加螯合剂至培养基，目的在于维持溶液中的金属离子。特别合适的螯合剂包含二羟基酚，如儿茶酚或原儿茶酸或有机酸如柠檬酸。

根据本发明使用的发酵培养基也可以含有其他生长因子，如维生素或生长促进剂，它们包括例如生物素、核黄素、硫胺素、叶酸、烟酸、泛酸和吡哆醇。生长因子和盐经常来自培养基的复杂组分，如酵母提取物、糖蜜、玉米浆等。此外，可以将合适的前体添加至培养基。培养基中化合物的精确组成主要取决于具体的实验并且必须针对每种具体情况分别决定。关于培养基优化的信息可以在教材“AppliedMicrobiol.Physiology，APracticalApproach″(1997)中找到。也可以从供应商处获得生长培养基，如标准1(Merck)或BHI(心脑浸液，DIFCO)等。

通过加热(在1.5巴和121℃，20分钟)或通过无菌过滤，将培养基的全部组分消毒。所述组分可以一起消毒或如需要分别消毒。培养基的全部组分可以在培养伊始存在或任选地可以连续地或通过分批补料添加。

培养物的温度正常是在15℃和45℃之间，优选地是25℃至40℃并且在实验期间可以保持恒定或可以变动。培养基的pH值应当在5至8.5的范围内，优选地在7.0附近。可以在培育期间通过添加碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水或酸性化合物如磷酸或硫酸控制用于生长的pH值。消泡剂例如脂肪酸聚乙二醇酯可以用于控制起泡。为了维持质粒的稳定性，可以将具有选择作用的合适物质例如抗生素添加至培养基。将氧或含氧气体混合物例如空气送入培养物旨在维持有氧条件。培养物的温度通常是20℃至45℃。持续培养直至最大量的所需产物已经形成。这通常在1小时至160小时内实现。

细胞可以任选地通过高频超声波、通高压例如在弗氏细胞压碎器中、通过渗透作用、通过去垢剂、裂解酶或有机溶剂的作用、借助匀浆器或通过所列几种方法的组合加以破坏。

特定组成可以适应于在发酵中所用微生物的类型。可用于基于假单胞菌菌株的发酵的培养基组成是本领域已知的。例如，LB培养基是适用于这类菌株的常见培养基。

3.6香草醛分离

本发明的方法学还可以包含回收香草醛的步骤。术语“回收”包括从培养基提取、收获、分离或纯化化合物。可以根据本领域已知的任何常规分离或纯化方法回收化合物，所述方法包括但不限于用常规树脂处理(例如，阴离子或阳离子交换树脂、非离子型吸附树脂等)、用常规吸附剂(例如，活性炭、硅酸、硅胶、纤维素、氧化铝等)处理、改变pH、溶剂提取(例如，用常规溶剂如醇、乙酸乙酯、己烷等提取)、蒸馏、透析、过滤、浓缩、结晶、重结晶、pH调整、冻干等。

在预期分离之前，可取出培养液的生物质。用于取出生物质的方法是本领域技术人员已知的，例如过滤、沉积和浮选。因此，生物质可以用例如离心机、分离器、滗析器、滤器或在浮选装置中取出。为了最大限度回收有价值的产物，经常建议洗涤生物质，例如以渗滤形式洗涤。方法的选择取决于发酵器培养液中的生物质含量和生物质的特性，并且还取决于生物质与有价值产物的相互作用。

在一个实施方案中，可以将发酵液消毒或巴氏消毒。在又一个实施方案中，浓缩发酵液。取决于要求，该浓缩可以分批或连续地进行。应当如此选择压力和温度范围，从而首先不出现产物受损，并且其次必须最大限度减少装置和能量的使用。熟练选择用于多步蒸发的压力和温度水平尤其能够节省能量。

以下实施例仅起到说明本发明的作用。在已经考虑本文中提供的公开内容后，对本领域技术人员而言立即易见的众多可能变型也将落入本发明的范围内。

实验部分

A)材料和方法

质粒、细菌菌株和生长条件

表1中显示本发明中使用的细菌菌株和质粒。在LB培养基(Bertani，1951)中在30℃培育恶臭假单胞菌菌株并在37℃培育大肠杆菌JM109(Yanisch-Perron等人，1985)。为了选择质粒，添加50μgml^-1卡那霉素(Kan)。在缺失过程期间并且对于耐受性试验，将M9极限培养基用于恶臭假单胞菌菌株的生长(48mMNa₂HPO₄×7H₂O、22mMKH₂PO₄、8.6mMNaCl、18.7mMNH₄Cl)，所述培养基补充有0.2％葡萄糖，1mMMgSO₄、0.1mMCaCl₂、6μM盐酸硫胺素和20μgml^-15-氟尿嘧啶(5-FU；制备为二甲基亚砜[DMSO]中100mgml^-1的母液)。

表1本发明中所用的细菌菌株和质粒

化学品与其他材料

本发明中所用的化学品为分析级并购自CarlRothGmbH+Co.KG(Karlsruhe，德国)、Sigma-AldrichCorporation(Taufkrichen，德国)和MerckKGaA(Darmstadt，德国)。特别地，5-FU、阿魏酸、香草醛、香草酸和香草醇购自Sigma-Aldrich。合成性DNA寡核苷酸(表2a)购自EurofinsMwGOperonGmbH(Ebersberg，德国)。限制性酶和DNA修饰酶购自RocheDiagnosticsDeutschlandGmbH(Mannheim，德国)、NewEnglandBiolabsGmbH(FrankfurtamMain，德国)和FermentasGmbH(ThermoFisherScientific分部，St.Leon-Rot，德国)。PCR用来自FermentasGmbH的高保真PCR酶混合物在来自BiometraGmbH(Goettingen，德国)的TPersonal热循环仪上进行。

表2a本发明中所用的寡核苷酸引物

^a限制性位点以粗体指示。表2b用于工程化实验的基因和调节元件的氨基酸和核苷酸序列：

NS＝核苷酸序列

AS＝氨基酸序列

恶臭假单胞菌菌株的载体构建和遗传操作

使用标准重组DNA技术(Sambrook等人，1989)，用大肠杆菌JM109(Yanisch-Perron等人，1985)进行克隆步骤。通过TSS(转化和储存溶液)法(Chung等人，1989)用质粒DNA转化大肠杆菌。通过电穿孔法(Sambrook等人，1989)用质粒DNA转化恶臭假单胞菌菌株。表3中汇总质粒和菌株的构建。

对于恶臭假单胞菌KT2440中的染色体缺失和整合，如先前描述那样使用upp/5-FU反向选择系统(Graf和Altenbuchner，2011)。首先，使用恶臭假单胞菌KT2440(GenBank登录号AE015451)的染色体DNA作为模板，PCR扩增包含靶基因起始密码子和终止密码子的上游和下游区域。通过3片段连接法，将这些片段克隆入pJOE6261.2中。所得到的整合载体随后用于恶臭假单胞菌ΔUPP4或其他upp缺失菌株的电穿孔。将获得的Kanr5-FU^s克隆之一在30℃振摇条件(200转/分钟)下在LB培养基中温育24小时。此后，将不同的稀释物铺种在含有20μgml^-15-FU和0.2％葡萄糖的极限平板上。使用与待缺失基因的上游和下游序列结合的寡核苷酸，通过菌落PCR检查10个5-FU^r和Kan^s克隆。

lacI^q-P_tac整合载体pNG283.5的构建始于使用寡核苷酸引物6936/s6937并使用染色体DNA恶臭假单胞菌KT2440作为模板，PCR扩增ech。通过NdeI/BamHI，将纯化的PCR片段(897bp)克隆入pJOE5304.1，产生pNG281.1，即具有lacI^q-P_tac-ech盒的载体。接下来，将这个盒用s6936/s6965进行PCR扩增(片段A；2376bp)。另外，将ech的上游区域用s6938/s6939进行PCR扩增(片段B；952bps)。片段A和B分别用BamHI/MfeI和EcoRI/BamHI切割，并借助3片段连接法克隆入BamHI切割的pJOE6261.2，产生pNG283.5。

交配和转座子诱变

大肠杆菌S17.1/pCro2a(含有mini-Tn5495)(Onaca等人，2007)的过夜培养物和在含有卡那霉素和不含卡那霉素的LB中培育的恶臭假单胞菌GN235的过夜培养物均等混合(各200μl)并且将100μl这种混合物滴到不含抗生素的LB琼脂平板上。在30℃温育24小时后，用3mlLB液态培养基从平板刮下长成的细胞。在每种情况下，将100μl10^-2稀释物(产生约50-100个菌落)铺种在总计50块含有50μgml^-1卡那霉素和μgml^-1μM萘啶酸(用于反向选择大肠杆菌供体)的LB琼脂平板上。随后将平板在37℃温育40小时。从每块平板中，将菌落一式两份铺种在M9极限琼脂平板上，一块平板含0.2％(w/v)葡萄糖并且另一块平板含0.1％(w/v)香草醛。在30℃温育过夜。在含有葡萄糖的M9平板上生长、但在含有香草醛的M9平板上不生长的菌落被挑取到含有50μgml^-1卡那霉素和μgml^-1μM萘啶酸的LB琼脂平板、含有0.1％香草醛的M9琼脂平板和含有0.1％香草酸的M9琼脂平板上并在30℃温育过夜。从在LB_kan/nal上生长并在含有香草酸的M9上生长但是在含有香草醛的M9上不生长的克隆分离染色体DNA(DNeasy血液和组织试剂盒，Qiagen，Hilden，德国)并分别用限制性酶BsrGI、EcoRI和SalI消化。将染色体片段纯化(NucleoSpinExtractII试剂盒，Macherey-Nagel，Düren，德国)，在4℃连接过夜，在冰上用异丙醇沉淀2小时，用乙醇洗涤并重悬于10μlH₂O(双蒸水)中。大肠杆菌JM109用连接的染色体片段转化。在含有50μgml^-1卡那霉素的LB琼脂平板上进行选择。从卡那霉素抗性克隆分离质粒并且通过限制性酶消化检查。在用引物s4052和s4037(Onaca等人，2007)(GATCBiotech，Constance，德国)对质粒测序后，对获得的序列最终进行BLAST检索。

阿魏酸至香草醛的生物转化测定法

将恶臭假单胞菌菌株过夜培养物1∶50稀释于新鲜的LB培养基中并在30℃在摇瓶(200转/分钟)中培育2小时。取决于菌株，通过添加5mM阿魏酸或5mMIPTG诱导阿魏酸代谢基因。在30℃振摇条件下进一步生长6小时后，将25×10⁹个细胞通过离心(10分钟，3,500g，室温)收获，洗涤并用5ml50mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)重悬。将总计10mM阿魏酸(DMSO中1M母液)添加至细胞悬液。在长玻璃培养管中在30℃在振摇条件(200转/分钟)下实施生物转化。在1、2、3、4、5和18小时转化时间后，取得200μl样品。在离心步骤(10分钟，16,000g，室温)以沉淀细胞后，收集100μl上清液并贮存在-70℃直至HPLC分析。

分析方法

在HPLC应用之前，用0.2％乙酸1∶10稀释来自生物转化测定法的样品。用Merck-HitachiHPLC系统(Merck，Darmstadt，德国)定量阿魏酸、香草醛、香草酸和香草醇，所述HPLC系统配备RP-StarRP-18e柱(250mmx4.6mm，5μm)、保护柱(4mmx4mm，5μm)、L7612脱气器、L6200A梯度泵、D6000A接口模块、L4200UV-可见光检测器、Rheodyne进样阀7125连同100-μl样品环管和D7000HPLC系统管理软件。为了测量，使用如先前所述的程序(Sinha等人，2007)：使用甲醇、乙腈和0.2％乙酸(3∶3∶14)作为流动相。流速是1mlmin-1并且在231nm测量吸光度20分钟。具有7种不同浓度(0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0、5和1mM)的阿魏酸、香草醛、香草酸和香草醇溶液用于校正。

B.实验

实施例1：不能以香草醛作为唯一碳源生长的恶臭假单胞菌KT2440突变体的构建和表征

如先前报道(Overhage等人，1999b；Plaggenborg等人，2003)，恶臭假单胞菌KT2440能够以阿魏酸作为唯一碳源生长。受阿魏酰辅酶A-合成酶(PP_3356，fcs)和烯酰辅酶A-水合酶/醛缩酶(PP_3358，ech)催化，阿魏酸以数个步骤代谢成香草醛。香草醛转而由香草醛脱氢酶(PP_3357，vdh)进一步降解成香草酸。如果需要香草醛积累，则必须防止最后步骤。图2中显示这些基因在恶臭假单胞菌KT2440和本发明所构建的其他菌株中的染色体组织架构。

就工业应用而言，使用前述的upp反向选择方法(Graf和Altenbuchner，2011)，我们构建了在包含表面黏附蛋白基因(PP_0168，lapA)的lapABC操纵子中具有缺失的恶臭假单胞菌菌株GN23。该表面黏附蛋白负责生物被膜形成并且是必需的，如先前对另一个恶臭假单胞菌KT2440ΔlapA突变株所证实(Graf和Altenbuchner，2011)。

在第二步骤中，缺失恶臭假单胞菌GN23的染色体vdh基因，仅留下vdh的起始和终止密码子(图2)。所得到的菌株，命名为GN235，仍然能够依赖阿魏酸作为唯一碳源生长，从而显示fcs功能性表达。GN235还保留在香草醛和香草酸上生长的能力(图3)。

使用GN235的转座子诱变，我们找到了一个不能依赖阿魏酸或香草醛作为唯一碳源生长的突变体(GN275)。但是，保留依赖香草酸的生长特性(图3)。鉴定被转座子破坏的基因揭示出modA(PP_3828)，其编码一种周质钼酸盐结合蛋白，所述蛋白是钼酸盐ABC转运蛋白的组成部分。用upp反向选择方法以无标记方式缺失包含modABC(PP_3827-PP_3832)的完整操纵子，从而产生菌株GN276。这个菌株的表型与转座子突变体相同(图3)。

实施例2：菌株GN23、GN235和GN276的生物转化测定法

菌株GN23和GN235的静息细胞用于生物转化测定法。将10mM阿魏酸添加至静息细胞，并且在反应时间期间以定期时间间隔取得样品，通过HPLC测量阿魏酸、香草醛、香草醇和香草酸的浓度。在18小时转化时间后终止该测定法。两种菌株GN23和GN235均显示快速转化阿魏酸，伴随香草酸在头5个小时内短暂积累(图4a、b)。另外，不能在两种菌株的任一者中观察到香草醛、香草醇和香草酸的积累。

采用GN276的阿魏酸生物转化测定法(图4c)显示阿魏酸转化率降低。而采用GN23时，施加的全部阿魏酸(10mM)在18小时后均转化，使用GN276时仍测量到2.4mM阿魏酸。与GN23和GN235相反，GN276在5小时转化时间后积累4.8mM香草醛。在进一步转化13小时后，香草醛浓度略微地增加至5.2mM。在转化结束(18小时)时，香草醇和香草酸也分别积累高达1.5mM和0.3mM。为了改善阿魏酸转化率，需要其他步骤。

实施例3：增加染色体ech-fcs表达导致香草醛的高转化率和高摩尔产率

阿魏酰辅酶A-合成酶(fcs)和烯酰辅酶A-水合酶/醛缩酶(ech)催化阿魏酸转化成香草醛。我们假定如果要求的辅因子、ATP和CoA-SH可过量获得或再生，则阿魏酸的转化率应当与细胞中这两种代谢酶的数目成正比。使用upp反向选择系统，强tac启动子(P_tac)和lacI^q在GN276的染色体中紧邻ech和fcs上游整合以控制这两种基因的表达(图2)。

所得到的菌株命名为GN299。用IPTG诱导ech和fcs表达后，用这个菌株实施生物转化测定法。在5小时后，几乎全部10mM阿魏酸转化成1.1mM香草醇、0.2mM香草酸和8.3mM香草醛，这对应于摩尔产率83％(图4d)。在转化18小时后，香草醛浓度略微地降低至7.6mM，伴随香草醇和香草酸分别增加至1.6mM和0.4mM。

实施例4：生物转化测定法的优化揭示香草醛阈值

静息细胞恶臭假单胞菌GN299用于生物转化实验。为了与高初始转化率组合的高且可重复的产物产率，变动几项参数。

首先，我们分析诱导物浓度(1mM和5mMIPTG)和诱导时间(2、4和6小时)对表达阿魏酸生物转化成香草醛所需要的代谢酶的影响(图5+6a)。我们发现使用小于5mMIPTG时，阿魏酸转化慢得多(图5)。但是，18小时转化时间后香草醛产率相似(未显示)。关于诱导时间的影响(图6a)，在诱导代谢酶6小时后出现香草醛的最高转化率和产率。

另外，还变动静息细胞的量(5、10和20×10⁹个细胞ml^-1)。采用最低浓度5×10⁹个细胞ml^-1时，最佳结果仍保持(图6b)。在延长转化后(18小时)，更高的细胞浓度导致香草醇和香草酸水平升高，伴随香草醛摩尔产率下降。

在本发明中，我们发现存在香草醛产生的阈值。将诱导和静息的细胞与生物转化培养液中渐增量的阿魏酸(10、20、30和40mM)温育。使用直至30mM阿魏酸时，菌株并不产生超过13.5mM的香草醛(图7a)。采用40mM阿魏酸时，香草醛根本不产生。对于该生物转化测定法，使用10mM阿魏酸时实现最佳产率。恶臭假单胞菌KT2440突变株在含有葡萄糖和渐增量的阿魏酸(0-50mM)的缓冲M9极限培养基(pH7.0)中生长动力学未显示阿魏酸浓度的影响(图8a)。

通过静息细胞与10mM阿魏酸和额外的渐增量香草醛(10、15、20和30mM)温育，证实了香草醛阈值效应。与额外的10mM香草醛温育的细胞仅在18小时后产生另外3.2mM香草醛(图7b)。在另一方面，更高的香草醛量导致香草醛浓度轻微下降和香草醇浓度和香草酸浓度增加。在具有葡萄糖和渐增量的香草醛(0-25mM)的M9极限培养基中恶臭假单胞菌KT2440突变株的生长动力学显示香草醛浓度的明显的影响(图8b)。采用高达12.5mM香草醛时，菌株显示中等生长。采用超过15mM香草醛时，生长强烈受损。

实施例5：其他基因的缺失和对香草醛产生和副产物形成的影响

用GN299实施的生物转化测定法显示必然降低产物产率的香草醇和香草酸形成。因此，分析了可能参与阿魏酸代谢的几个基因失活的影响。选择用于这种分析方法的基因是PP_3354(β-酮硫解酶)和PP_3355(酰基-CoA脱氢酶)、PP_2680和PP_0545(醛脱氢酶)和PP_1948(苯甲醛脱氢酶)。

首先，在菌株GN299中通过联合缺失编码酰基-CoA脱氢酶和β-酮硫解酶(aat)的PP_3354和PP_3355中断由(Overhage等人，1999b)所提出的从阿魏酸至香草酸的第二途径(图1)，如图2中所示。所得到的菌株GN347用于生物转化测定法(图4e)。在5小时后，9mM阿魏酸转化成7.7mM香草醛、1mM香草醇和0.2mM香草酸。在18小时后，另外的0.5mM阿魏酸被转化。香草醛浓度降至7.5mM，而香草醇和香草酸分别略增至1.4mM和0.3mM。与GN299相比，转化率和香草醛产率在头5小时内降低。

由于vdh的缺失不能阻止香草醛降解成香草酸，所以其他醛脱氢酶可能催化这种反应。从一种蛋白质组学方法中，可以显示两种醛脱氢酶(由PP_2680和PP_0545编码)和苯甲醛脱氢酶(PP_1948)在依赖香草醛生长的恶臭假单胞菌KT2440中上调(Simon，Pfannstiel和Huber，未公开原始数据，正在准备手稿)。通过无标志物缺失在GN299中依次失活PP_2680和PP_0545分别产生菌株GN440和GN441。苯甲醛脱氢酶也可以接受香草醛作为底物，由于香草醛是苯甲醛的衍生物。因此，相应基因(PP_1948)在GN441中缺失，产生菌株GN442。生物转化测定法中使用突变株GN440、GN441和GN442(图4f-h)。这些菌株显示非常类似的结果。采用GN440和GN441的静息细胞，在4小时后，约9.5mM阿魏酸转化成8.6mM香草醛。测得的香草醇浓度和香草酸浓度分别是约0.8mM和0.1mM。菌株GN442显示相同的结果，然而，这已经是在转化3小时后。采用全部三个菌株时，在18小时转化后，几乎全部阿魏酸均被转化。再次，香草醛浓度降至7.9mM，而香草醇和香草酸分别增至约1.5mM和0.4mM。

B.实验讨论

与荧光假单胞菌菌株AN103和BF13(Martinez-Cuesta等人，2005；DiGioia等人，2010)相反，我们采用恶臭假单胞菌GN235的研究结果证实，单纯失活vdh不足以阻止香草醛降解。先前在采用假单胞菌属物种HR199菌株的vdh敲除突变体和假单胞菌属KT2440vdhΩKm突变体时报道了这个结果(Overhage等人，1999a；Plaggenborg等人，2003)。KT2440vdhΩKm和GN235仍然能够依赖香草醛作为唯一碳源生长。然而，主要差异是恶臭假单胞菌GN235也能够依赖阿魏酸生长，原因在于vdh的毗邻基因即ech和fcs的功能性表达。完全缺失vdh支持ech和fcs的表达，这在KT2440vdhΩKm突变体中最不可能是这样。用GN235实施的随机转座子诱变揭示了一个在编码周质钼酸盐结合蛋白的modA的基因座中具有转座子的突变体。已知钼酸盐离子作为辅因子在假单胞菌属物种的氧化还原酶中发挥作用(Koenig和Andreesen，1990；Blaschke等人，1991；Frunzke等人，1993)。由于ΔmodABC菌株GN276不能够依赖香草醛作为唯一碳源生长，所以可以假定，未知的钼酸盐依赖性氧化还原酶可能接受香草醛作为底物，弥补vdh失活。对钼酸盐摄取的抑制可能使这些酶失活并且香草醛不氧化成香草酸，其被进一步降解。由于采用GN276时阿魏酸并未完全转化，因此需要进一步改进。

使用来自摇瓶实验的静息细胞，在vdh阴性荧光假单胞菌菌株中的低拷贝质粒上同时表达结构基因ech和fcs在5小时内产生63％的香草醛摩尔产率，并且使用来自搅拌罐反应器的静息细胞时，在24小时内产生高达84％的香草醛摩尔产率(DiGioia等人，2010)。为了规避质粒不稳定和使用抗生素可能带来的问题，将强tac启动子引入恶臭假单胞菌GN276的染色体以控制ech和fcs(GN299)的表达。这仅在5小时内改善香草醛摩尔产率高达83％。我们假定，通过IPTG诱导升高ech和fcs的表达率导致比使用原始启动子系统时浓度更高的所编码的代谢酶。与阿魏酸相反，诱导物IPTG不被代谢并且表达率可以保持在高水平上。减少诱导物的量导致产物产率和生产率下降，这可以由较低的酶浓度解释。我们还检查了诱导时间的影响，显示低于6小时导致较低产物产率，这可能归因于酶水平较低。还检验了更长的诱导时间，但是这并不改善产物产率(数据未显示)。测定法中升高细胞浓度导致更高水平的副产物香草酸和香草醇并且不加快转化时间。我们假定，更高细胞密度伴随更高水平的还原当量，后者转而可能有利于香草醇形成。

进一步改进转化过程显示，如果使用高于10mM的较高阿魏酸浓度，则升高生物转化培养液中的阿魏酸浓度导致香草醛摩尔产率降低。40mM阿魏酸浓度甚至抑制任何向香草醛的转化。然而，可以排除阿魏酸的毒性效应，如采用渐增量的直至50mM的阿魏酸的生长实验已经显示。

在另一方面，恶臭假单胞菌GN299在生物转化测定法中显示约13.5mM的香草醛阈值。升高香草醛浓度高于这个阈值导致形成更多的香草醇和香草酸并抑制阿魏酸转化。采用将阿魏酸转化成香草醛的重组大肠杆菌菌株时，也观察到这种产物抑制作用(Overhage等人，2003)。用渐增的香草醛浓度存在下恶臭假单胞菌GN299的生长证实香草醛的毒性特征，其中仅耐受至多12.5mM香草醛。然而，与荧光假单胞菌BF13相反(其显示通过阿魏酸浓度从5mM增加至12.5mM降低摩尔产率98％(DiGioia等人，2010))，恶臭假单胞菌不显示这种有意义的降低。实际上，恶臭假单胞菌的GN442静息细胞可以在转化18小时后再次使用。通过在含有10mM阿魏酸的新缓冲液中重悬细胞并在30℃进一步温育18小时分散香草醛，这导致产生5mM香草醛(4.5mM阿魏酸、0.5mM香草醇、0mM香草酸)。因此，通过吸附性树脂立即分散有毒产物香草醛将允许恶臭假单胞菌细胞转化更多的阿魏酸，因为可以先前证实它用于其他系统(Yoon等人，2007；Hua等人，2007；Lee等人，2009)。

通过缺失GN299中的PP_3355(aat)和PP_3354，失活由Overhage等人，(1999b)提出的阿魏酸至香草酸旁路途径没有对副产物香草醇和香草酸的不利形成带来积极影响。甚至观察到转化率降低。对这种行为的一种可能解释可以是，通过缺失这两个基因激发的mRNA的半寿期较短并且因此代谢酶的水平削弱。然而，GN299中失活上调的由PP_2680和PP_0545编码的醛脱氢酶和苯甲醛脱氢酶(PP_1948)导致较高的初始转化率和高摩尔产率。这个菌株(GN442)的结果代表文献中迄今发现的假单胞菌菌株将阿魏酸生物转化成香草醛的最高生产率。然而，与GN299相比，这些缺失对副产物的形成无明显影响。在搅拌罐反应器实验中，先前可以证实，排除化学氧化过程，升高溶解氧浓度不导致更多香草酸的形成(DiGioia等人，2010)。过去提出，其他宽底物专一性脱氢酶可以在待测定的假单胞菌菌株中起作用(Overhage等人，1999b)。

我们的全部生物转化实验均显示延长生物转化时间至多18小时因形成副产物而降低香草醛摩尔产率。因此，需要阿魏酸在头几小时内尽可能快速和完全地转化成香草醛。香草醛还原成香草醇似乎代表一种脱毒机理，因为还在将阿魏酸转化成香草醛的重组大肠杆菌细胞中观察到这种现象(Overhage等人，2003)。减少香草醇形成的另一个方法是通过缺失编码异柠檬酸脱氢酶的基因PP_4011和PP_4012减少NADH₂的量，如提出它用于重组大肠杆菌那样(Lee等人，2009)。

下表4中总结的生产率数据展示，与(DiGioia等人，2010)的结果相比时，如根据本发明所观察到的令人惊讶的改善的阿魏酸(快速和几乎完全)转化：

表4生产率的比较

参考文献清单

AchterholtS,PriefertH,SteinbüchelA(2000)IdentificationofAmycolatopsissp.strainHR167genes,involvedinthebioconversionofferulicacidtovanillin.ApplMicrobiolBiotechnol54:799-807

AltenbuchnerJ,ViellP,PelletierI(1992)PositiveselectionvectorsbasedonpalindromicDNAsequences.MethodsEnzymol216:457-466

BarghiniP,DiGD,FavaF,RuzziM(2007)VanillinproductionusingmetabolicallyengineeredEscherichiacoliundernon-growingconditions.MicrobCellFact6:13

BergerRG(2009)Biotechnologyofflavours--thenextgeneration.BiotechnolLett31:1651-1659

BertaniG(1951)Studiesonlysogenesis.I.ThemodeofphageliberationbylysogenicEscherichiacoli.JBacteriol62:293-300

BlaschkeM,KretzerA,SchaferC,NagelM,AndreesenJR(1991)Molybdenum-dependentdegradationofquinolinebyPseudomonasputidaChinIKandotheraerobicbacteria.ArchMicrobiol155:164-169

BonninE,Lesage-MeessenL,AstherM,ThibaultJF(1999)Enhancedbioconversionofvanillicacidintovanillinbytheuseof"natural"cellobiose.JSciFoodAgric79:484-486

CalistiC,FiccaAG,BarghiniP,RuzziM(2008)RegulationofferuliccatabolicgenesinPseudomonasfluorescensBF13:involvementofaMarRfamilyregulator.ApplMicrobiolBiotechnol80:475-483

ChungCT,NiemelaSL,MillerRH(1989)One-steppreparationofcompetentEscherichiacoli:transformationandstorageofbacterialcellsinthesamesolution.ProcNatlAcadSciUSA86:2172-2175

CivolaniC,BarghiniP,RoncettiAR,RuzziM,SchiesserA(2000)Bioconversionofferulicacidintovanillicacidbymeansofavanillate-negativemutantofPseudomonasfluorescensstrainBF13.ApplEnvironMicrobiol66:2311-2317

ClarkePH(1982)Themetabolicversatilityofpseudomonads.AntonievanLeeuwenhoek48:105-130

DavidonisG,KnorrD(1991)Callusformationandshootregenerationinvanillaplanifolia.FoodBiotechnol5:59-66

DiGioiaD,LuziatelliF,NegroniA,FiccaAG,FavaF,RuzziM(2010)MetabolicengineeringofPseudomonasfluorescensfortheproductionofvanillinfromferulicacid.JBiotechnol156:309-316

Escott-WatsonPL,MaraisJP(1992)Determinationofalkali-solublephenolicmonomersingrassesafterseparationbythin-layerchromatography.JChromatgr604:290-293

FleigeC,HansenG,KrollJ,SteinbüchelA(2013)InvestigationoftheAmycolatopsissp.StrainATCC39116vanillindehydrogenaseanditsimpactonthebiotechnicalproductionofvanillin.ApplEnvironMicrobiol79:81-90

FrunzkeK,HeissB,MeyerO,ZumftWG(1993)MolybdopteringuaninedinucleotideistheorganicmoietyofthemolybdenumcofactorinrespiratorynitratereductasefromPseudomonasstutzeri.FEMSMicrobiolLett113:241-245

GassonMJ,KitamuraY,McLauchlanWR,NarbadA,ParrAJ,ParsonsEL,PayneJ,RhodesMJ,WaltonNJ(1998)Metabolismofferulicacidtovanillin.Abacterialgeneoftheenoyl-SCoAhydratase/isomerasesuperfamilyencodesanenzymeforthehydrationandcleavageofahydroxycinnamicacidSCoAthioester.JBiolChem273:4163-4170

GrafN,AltenbuchnerJ(2011)DevelopmentofamethodformarkerlessgenedeletioninPseudomonasputida.ApplEnvironMicrobiol77:5549-5552

HansenEH,MollerBL,KockGR,BunnerCM,KristensenC,JensenOR,OkkelsFT,OlsenCE,MotawiaMS,HansenJ(2009)Denovobiosynthesisofvanillininfissionyeast(Schizosaccharomycespombe)andbaker'syeast(Saccharomycescerevisiae).ApplEnvironMicrobiol75:2765-2774

Havkin-FrenkelD,BelangerFC(2008).BiotechnologicalProductionofVanillin.In:Havkin-FrenkelD,BelangerFC(ed)BiotechnologyinFlavorProduction,1stedn.Blackwell,Oxford,pp83-103

HuaD,MaC,SongL,LinS,ZhangZ,DengZ,XuP(2007)Enhancedvanillinproductionfromferulicacidusingadsorbentresin.ApplMicrobiolBiotechnol74:783-790

IshiiT(1997)Structureandfunctionsofferuloylatedpolysaccharides.PlantSci127:111-127

IshikawaH,SchubertWJ,NordFF(1963)Investigationsonligninsandlignification.28.ThedegradationbyPolyporusversicolorandFomesfomentariusofaromaticcompoundsstructurallyrelatedtosoftwoodlignin.ArchBiochemBiophys100:140-149

KoenigK,AndreesenJR(1990)Xanthinedehydrogenaseand2-furoyl-coenzymeAdehydrogenasefromPseudomonasputidaFu1:twomolybdenum-containingdehydrogenasesofnovelstructuralcomposition.JBacteriol172:5999-6009

KojimaY,FujisawaH,NakazawaA,NakazawaT,KanetsunaF,TaniuchiH,NozakiM,HayaishiO(1967)Studiesonpyrocatechase.I.Purificationandspectralproperties.JBiolChem242:3270-3278

KringsU,BergerRG(1998)Biotechnologicalproductionofflavoursandfragrances.ApplMicrobiolBiotechnol49:1-8

LeeEG,YoonSH,DasA,LeeSH,LiC,KimJY,ChoiMS,OhDK,KimSW(2009)Directingvanillinproductionfromferulicacidbyincreasedacetyl-CoAconsumptioninrecombinantEscherichiacoli.BiotechnolBioeng102:200-208

Lesage-MeessenL,DelattreM,HaonM,ThibaultJF,CeccaldiBC,BrunerieP,AstherM(1996)Atwo-stepbioconversionprocessforvanillinproductionfromferulicacidcombiningAspergillusnigerandPycnoporuscinnabarinus.JBiotechnol50:107-113

Martinez-CuestaMC,PayneJ,HanniffySB,GassonMJ,NarbadA(2005)Functionalanalysisofthevanillinpathwayinavdh-negativemutantstrainofPseudomonasfluorescensAN103.EnzymMicrobTechnol37:131-138

MuheimA,LerchK(1999)Towardsahigh-yieldbioconversionofferulicacidtovanillin.ApplMicrobiolBiotechnol51:456-461

NakazawaT(2002)TravelsofaPseudomonas,fromJapanaroundtheworld.EnvironMicrobiol4:782-786

NarbadA,GassonMJ(1998)MetabolismofferulicacidviavanillinusinganovelCoA-dependentpathwayinanewly-isolatedstrainofPseudomonasfluorescens.Microbiol144:1397-1405

NelsonKE,WeinelC,PaulsenIT,DodsonRJ,HilbertH,MartinsdS,V,FoutsDE,GillSR,PopM,HolmesM,BrinkacL,BeananM,DeBoyRT,DaughertyS,KolonayJ,MadupuR,NelsonW,WhiteO,PetersonJ,KhouriH,HanceI,ChrisLP,HoltzappleE,ScanlanD,TranK,MoazzezA,UtterbackT,RizzoM,LeeK,KosackD,MoestlD,WedlerH,LauberJ,StjepandicD,HoheiselJ,StraetzM,HeimS,KiewitzC,EisenJA,TimmisKN,DusterhoftA,TummlerB,FraserCM(2002)CompletegenomesequenceandcomparativeanalysisofthemetabolicallyversatilePseudomonasputidaKT2440.EnvironMicrobiol4:799-808

OddouJ,StentelaireC,Lesage-MeessenL,AstherM,ColonnaCeccaldiB(1999)Improvementofferulicacidbioconversionintovanillinbyuseofhigh-densityculturesofPycnoporuscinnabarinus.ApplMicrobiolBiotechnol53:1-6

OkekeBC,VenturiV(1999)ConstructionofrecombinantsPseudomonasputidaBO14andEscherichiacoliQEFCA8forferulicacidbiotransformationtovanillin.JBiosciBioeng88:103-106

OnacaC,KieningerM,EngesserKH,AltenbuchnerJ(2007)DegradationofalkylmethylketonesbyPseudomonasveroniiMEK700.JBacteriol189:3759-3767

OosterveldA,BeldmanG,ScholsHA,VoragenAG(2000)Characterizationofarabinoseandferulicacidrichpecticpolysaccharidesandhemicellulosesfromsugarbeetpulp.CarbohydRes328:185-197

OverhageJ,PriefertH,RabenhorstJ,SteinbüchelA(1999a)BiotransformationofeugenoltovanillinbyamutantofPseudomonassp.strainHR199constructedbydisruptionofthevanillindehydrogenase(vdh)gene.ApplMicrobiolBiotechnol52:820-828

OverhageJ,PriefertH,RabenhorstJ,SteinbüchelA(2000)Constructionofproductionstrainsforproducingsubstitutedphenolsbyspecificallyinactivinggenesoftheeugenolandferulicacidcatabolism.PatentapplicationWO0026355

OverhageJ,PriefertH,SteinbüchelA(1999b)BiochemicalandgeneticanalysesofferulicacidcatabolisminPseudomonassp.StrainHR199.ApplEnvironMicrobiol65:4837-4847

OverhageJ,SteinbüchelA,PriefertH(2003)HighlyefficientbiotransformationofeugenoltoferulicacidandfurtherconversiontovanillininrecombinantstrainsofEscherichiacoli.ApplEnvironMicrobiol69:6569-6576

PengX,MisawaN,HarayamaS(2003)Isolationandcharacterizationofthermophilicbacillidegradingcinnamic,4-coumaric,andferulicacids.ApplEnvironMicrobiol69:1417-1427

PlaggenborgR,OverhageJ,LoosA,ArcherJA,LessardP,SinskeyAJ,SteinbüchelA,PriefertH(2006)PotentialofRhodococcusstrainsforbiotechnologicalvanillinproductionfromferulicacidandeugenol.ApplMicrobiolBiotechnol72:745-755

PlaggenborgR,OverhageJ,SteinbüchelA,PriefertH(2003)FunctionalanalysesofgenesinvolvedinthemetabolismofferulicacidinPseudomonasputidaKT2440.ApplMicrobiolBiotechnol61:528-535

PriefertH,RabenhorstJ,SteinbüchelA(2001)Biotechnologicalproductionofvanillin.ApplMicrobiolBiotechnol56:296-314

RamachandraRaoS,RavishankarGA(2000)Vanillaflavour:productionbyconventionalandbiotechnologicalroutes.JSciFoodAgric80:289-304

RosazzaJP,HuangZ,DostalL,VolmT,RousseauB(1995)Review:biocatalytictransformationsofferulicacid:anabundantaromaticnaturalproduct.JIndMicrobiol15:457-471

SambrookJ,FritschEF,ManiatisT(1989)Molecularcloning:alaboratorymanual,2ndedn.ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork

SimonR,PrieferU,PühlerA(1983)Abroadhostrangemobilizationsystemforinvivogeneticengineering:transposonmutagenesisingramnegativebacteria.NatBiotech1:784-791

SinhaAK,VermaSC,SharmaUK(2007)DevelopmentandvalidationofanRP-HPLCmethodforquantitativedeterminationofvanillinandrelatedphenoliccompoundsinVanillaplanifolia.JSepSci30:15-20

StentelaireC,Lesage-MeessenL,DelattreM,HaonM,SigoillotJC,CeccaldiBC,AstherM(1997)By-passingofunwantedvanillylalcoholformationusingselectiveadsorbentstoimprovevanillinproductionwithPhanerochaetechrysosporium.WorldJMicrobiolBiotechnol14:285-287

TilayA,BuleM,AnnapureU(2010)Productionofbiovanillinbyone-stepbiotransformationusingfungusPycnoporouscinnabarinus.JAgricFoodChem58:4401-4405

WilliamsPA,MurrayK(1974)MetabolismofbenzoateandthemethylbenzoatesbyPseudomonasputida(arvilla)mt-2:evidencefortheexistenceofaTOLplasmid.JBacteriol120:416-423

Yanisch-PerronC,VieiraJ,MessingJ(1985)ImprovedM13phagecloningvectorsandhoststrains:nucleotidesequencesoftheM13mp18andpUC19vectors.Gene33:103-119

YoonSH,LeeEG,DasA,LeeSH,LiC,RyuHK,ChoiMS,SeoWT,KimSW(2007)EnhancedvanillinproductionfromrecombinantE.coliusingNTGmutagenesisandadsorbentresin.BiotechnolProg23:1143-1148

Narang,S.A.(1983)Tetrahedron39:3；

Itakura等人,(1984)(a)Annu.Rev.Biochem.53:323；

Itakura等人,(1984)(b)Science198:1056；

Ike等人,(1983)NucleicAcidsRes.11:477

ArkinandYourvan(1992)PNAS89:7811-7815；

Delgrave等人,(1993)ProteinEngineering6(3):327-331

HigginsDG,SharpPM.Fastandsensitivemultiplesequencealignmentsonamicrocomputer.ComputAppl.Biosci.(1989)Apr；5(2):151-1

Chenna,Ramu等人,(2003)NucleicAcidsRes31(13):3497-500,Ausubel等人,(编著),1985,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NewYork；

HamesandHiggins(eds),1985,NucleicAcidsHybridization:APracticalApproach,IRLPressatOxfordUniversityPress,Oxford；

Brown(ed),1991,EssentialMolecularBiology:APracticalApproach,IRLPressatOxfordUniversityPress,Oxford

Goeddel,GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego,CA(1990)

CloningVectors(Eds.PouwelsP.H.等人,Elsevier),Amsterdam-NewYork-Oxford,1985,ISBN0444904018)

T.J.Silhavy等人,ExperimentswithGeneFusions,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1984)

PearsonandLipman,Proc.Natl.Acad,Sci.(USA)85(8),1988,2444-2448.

AppliedMicrobiol.Physiology,APracticalApproach"(Publ.P.M.Rhodes,P.F.Stan-bury,IRLPress(1997)p.53-73,ISBN0199635773).

通过引用的方式并入本文中提及的文献。