含有五指那藤叶提取物作为有效成分的骨组织生成促进用药物组合物

摘要

本发明涉及成骨细胞分化或软骨细胞分化促进用组合物，具体涉及含有五指那藤叶提取物的可用于抑制以及治疗骨和软骨组织损伤的用途使用的骨(组织)生成促进用组合物，利用天然原料能够以无毒性及无副作用的情况下安全使用。本发明的含有五指那藤叶提取物作为有效成分的药物组合物可使用于治疗或预防牙周炎或骨质疏松症的牙周炎或骨质疏松症治疗剂。

说明书

技术领域

本发明涉及骨组织生成促进用药物组合物，更具体地，涉及一种将含有五指那藤叶提取物的天然原料用作用于抑制以及治疗骨和软骨组织损伤的用途的骨组织生成促进用药物组合物，从而能够无毒性和无副作用地安全使用。

背景技术

骨组织大体形成为如下，即骨的表面由结实的密质骨构成，中心部或长骨的两端由骨质网状连接的松质骨构成。大部分的骨起初作为结缔组织中的软骨生成，而该软骨在日后变成骨组织，但是一部分骨在结缔组织中直接形成。

在骨端中，与邻骨相接的部分具有关节面，其表面被作为透明软骨的关节软骨覆盖。骨松质中间的骨小梁的特点是形成一定的排列。骨干部宽的骨髓腔与由骨小梁构成的骨小腔连接，并且全部由骨髓填充。

具有造血功能的骨髓中分布有很多血管，因此呈红色，可称作红骨髓。在骨质结构中，不管是骨密质或骨松质全部叠加有厚度为5～12μm的骨板，骨密质中以同心圆状叠加有数层的骨板(哈佛氏骨板)沿多个方向排列，在各层板的中心具有哈佛氏管，以连通血管。

骨细胞排列在骨板之间，呈不规则的星状，通过细的圆形突起，与相邻的其它骨细胞连接。在骨的表面具有结实的结缔组织性骨膜，分布有神经和血管，负责骨的保护和营养。若骨膜缺损，则骨的生存、新生以及再生等会变得困难。骨质的成分为20％的水分、35％的包括细胞的有机物、45％的无机物，骨之所以具有一定的弹性是因为有有机物。随着年龄的增加，无机物(主要是磷酸钙)增加，从而骨的硬度增加。

另一方面，五指那藤的学名为Stauntoniahexaphylla，是属于植物界、被子植物门、双子叶植物纲、毛茛目的植物。主要分布在韩国、日本、台湾、中国等地，主枝延伸5m左右，叶子是错开的5～7个小叶构成的掌状复叶。小叶厚且呈鸡蛋形或椭圆形并且边缘光滑平坦。叶长为6～8cm，小的叶长为3cm。花开5月，雌雄同株，黄白色，开在总状花序上。

雌花的小花梗在秋天呈红褐色，具有很多皮孔，因此粗糙。果实为鸡蛋形或椭圆形的浆果，长度为5～10cm，10月份成熟为红褐色，果肉的味道好于木通的味道。种子为鸡蛋形或椭圆形，呈黑色。

本发明的目的在于，提供一种药物组合物，利用作为在韩国容易得到的天然材料的五指那藤叶提取物，用于治疗、预防牙周炎或骨质疏松症，提取五指那藤叶热水提取物、五指那藤叶热水提取物的乙酸乙酯组分，进行了成骨细胞ALP活性、成骨细胞分化促进实验以及骨或软骨组织生成促进实验。

实验结果，确认了五指那藤提取物具有促进以及预防骨组织生成的效果，从而提供利用五指那藤提取物的骨生成促进用药物组合物以及治疗剂。

韩国公开特许公报第10-2013-0020095号涉及含有五指那藤提取物的保肝用组合物，公开了如下内容：作为食用，来自植物的五指那藤提取物没有副作用和安全性问题，在用作为肝毒性物质的四氯化碳或对乙酰氨基酚(APAP)处理的肝毒性诱发实验动物模型中，显著抑制脂质过氧化，并且抑制血清中GOT以及GPT数值增加，确认具有保护肝脏、预防肝脏损伤以及改善肝功能的效果，从而本发明的组合物不仅可以用作治疗或预防肝脏疾病用药物组合物或者改善肝功能或护肝用食品组合物，也能够用于恢复疲劳或消除宿醉等各种用途。

韩国授权特许公报第10-11675890号涉及含有五指那藤果实提取物作为有效成分的抗炎组合物。公开了含有五指那藤果实提取物的抗炎症剂，所述五指那藤果实提取物不仅没有细胞毒性，确认与炎症相关的多个细胞活素(cytokine)的mRNA的转录水平以及NO分泌量的结果，五指那藤的多个部位中，五指那藤果实最能有效抑制炎症，因此将其为有效成分的抗炎组合物可用作在与炎症相关的疾病中能够抑制炎症的抗炎症剂以及具有抗炎症效果的化妆品组合物等。

韩国授权特许公报第10-1243115号中公开了含有五指那藤叶提取物作为有效成分的解热剂，其中，五指那藤叶提取物不仅没有细胞毒性，比起现有的具有解热效果的解热剂也具有优秀的解热效果。

韩国授权特许公报第10-1221617号涉及含有五指那藤叶提取物作为有效成分的抗炎组合物，公开了含有五指那藤叶提取物的抗炎症剂，五指那藤叶提取物不仅没有细胞毒性，确认与炎症相关的细胞活素(cytokine)的mRNA的转录水平、NO分泌量以及作为炎症原因的COX-2酶的抑制活性的结果，能够有效抑制炎症。

但是，在上述现有技术中并没有公开本发明所公开的内容，本发明为了将作为天然材料的五指那藤叶提取物用作治疗或预防牙周炎或骨质疏松症的组合物而提取了五指那藤叶热水提取物、五指那藤叶热水提取物的乙酸乙酯组分，并通过成骨细胞ALP活性以及成骨细胞分化促进实验以及骨或软骨组织的生成促进实验，作为骨生成促进用组合物利用，在这一点上与本发明有差异。

发明内容

发明所要解决的技术问题

本发明的目的在于，提供一种含有骨组织生成促进用五指那藤叶提取物的药物组合物，将来自天然物质的五指那藤叶的提取物用作有效成分，即使长期服用也没有副作用，能够安全地用于抑制以及治疗骨和软骨组织损伤的用途使用。

问题的解决方法

为了达成本发明的目的，提供一种含有五指那藤叶粗提取物或非极性可溶提取物作为有效成分的用于抑制、治疗骨和软骨组织损伤的骨组织生成促进用药物组合物。

五指那藤叶粗提取物是由水、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇或它们的混合溶剂中的任一个可溶的提取物，所述非极性溶剂可以是从己烷、氯仿、二氯甲烷以及乙酸乙酯中选择的任一个。

五指那藤叶热水提取物具有增加成骨细胞中产生的ALP活性以及成骨细胞分化的功能，五指那藤叶热水提取物的乙酸乙酯组分具有增加成骨细胞中产生的ALP活性以及成骨细胞分化的功能。

此外，在总药物组合物中，含有0.01重量％至99.9重量％的五指那藤叶提取物，药物组合物的每日剂量为，所述提取物以10至1000mg/kg体重提供。

发明效果

经确认本发明的五指那藤叶热水提取物、五指那藤叶热水提取物的乙酸乙酯组分具有通过促进成骨细胞ALP活性以及成骨细胞分化来促进骨或软骨组织生成的效果，因此，含有五指那藤叶提取物作为有效成分的药物组合物可用作用于治疗或预防牙周炎或骨质疏松症的牙周炎或骨质疏松症治疗剂。

附图说明

图1是五指那藤叶热水提取物和组分的制备模拟图。

图2是表示五指那藤叶热水提取物对ALP活性的影响的图表(通过成骨细胞分化的骨形成促进活性)。

图3是表示五指那藤叶热水提取物乙酸乙酯组分对ALP活性的影响的图表

图4是表示五指那藤叶热水提取物、五指那藤叶热水提取物的乙酸乙酯组分的ALP活性染色结果的图表。

具体实施方式

本发明提供含有五指那藤叶粗提取物或非极性可溶提取物作为有效成分的用于抑制以及治疗骨和软骨组织损伤的骨组织生成促进用药物组合物及其利用它的牙周炎或骨质疏松症治疗剂。

1、制备五指那藤叶热水提取物

图1是示出用于制备五指那藤叶热水提取物和组分的模拟图。用蒸馏水洗涤五指那藤(Stauntoniahexaphylla)叶10kg后，添加蒸馏水200L，用电煎药壶在110℃下加热4小时进行提取。用400目滤布进行过滤后，用减压旋转浓缩机进行浓缩。过滤后在剩余的残渣中再次使用相同量的蒸馏水，以相同的步骤进行2次的提取、过滤以及减压浓缩。在冷冻干燥机(Freezedryer)中冷冻干燥浓缩的热水提取物。通过此过程获得了五指那藤叶热水提取物1kg(10％)。

2、制备五指那藤叶的极性溶剂可溶组分、非极性溶剂可溶组分

利用有机溶剂将如图1所示制备的五指那藤叶热水提取物如下进行分馏。

2.1、己烷可溶性组分分离

将从五指那藤叶热水提取物获得的五指那藤叶提取物250g完全溶解到5L的蒸馏水中后，放入分液漏斗中，添加5L的己烷，分离了己烷不溶性层(水层)和己烷可溶性层。再次以己烷不溶性层(水层)为对象，重复三次相同的步骤，收集了己烷不溶性组分以及己烷可溶性组分。

2.2、氯仿可溶性组分分离

在己烷不溶性组分(水层)中添加5L的氯仿进行混合后分离了氯仿可溶性组分以及氯仿不溶性组分，以氯仿不溶性层(水层)为对象，重复三次相同的步骤，收集了氯仿不溶性组分以及氯仿可溶性组分。

2.3、乙酸乙酯可溶性组分分离

在氯仿不溶性组分(水层)中添加5L的乙酸乙酯进行混合后分离了乙酸乙酯可溶性组分以及乙酸乙酯不溶性组分，以乙酸乙酯不溶性层(水层)为对象，重复三次相同的步骤，收集了乙酸乙酯不溶性组分以及乙酸乙酯可溶性组分。

2.4、丁醇可溶性组分分离

在乙酸乙酯不溶性组分(水层)中添加5L的丁醇进行混合后分离了丁醇可溶性组分以及丁醇不溶性组分，以丁醇不溶性层为对象，重复三次相同的步骤，收集了丁醇不溶性组分以及丁醇可溶性组分。

2.5、水层组分分离

将250g的五指那藤叶热水提取物完全溶解到5L的蒸馏水中后，放入分液漏斗中，分离所述己烷可溶性层、氯仿可溶性层、乙酸乙酯可溶性层以及丁醇可溶性层后，进行浓缩，去除残留的有机溶剂，收集了水组分。

在通过如上所述的五指那藤叶热水提取以及组分获得步骤制备的五指那藤叶热水提取物250g中，减压浓缩己烷可溶性组分、氯仿可溶性组分、乙酸乙酯可溶性组分以及丁醇可溶性组分后，进行冷冻干燥，获得己烷组分0.02g(0.015％)、氯仿组分0.67g(0.27％)、乙酸乙酯组分2.62g(1.05％)、丁醇组分68.75g(27.5％)、水组分150.14g(60.06％)，用作样品。

3、使用五指那藤叶热水提取物的成骨细胞的AP以及ALP的活性检测

图2是表示五指那藤叶热水提取物对ALP活性的影响的图表(通过成骨细胞分化的促进骨形成活性)。

3.1使用五指那藤叶热水提取物的成骨细胞的AP活性检测

成骨细胞呈现ALP活性，因此，检测了上述所获得的五指那藤叶热水提取物在成骨细胞中对ALP活性的影响。具体地，将作为成骨样细胞的C2C12细胞(C2C12cells)分到48孔板(48well)中，使其成为5×10⁴细胞/孔板(cell/well)，在作为细胞成长培养基而含有10％的FBS、0.1％的p/s的α-MEM培养基(α-MEMessentialmedium)中培养细胞三天。三天后，为了诱导成骨细胞分化，更换为含有1％的马血清(horseserum)、0.1％的p/s的α-MEM培养基。之后，由10ng/ml的骨形态生成蛋白-2(BMP-2：bonemorphogenicprotein-2)进行处理，对样品以不同浓度(10、50ug/ml)同时进行处理后培养四天。接着，用含有0.01％的TritonX的AP检测缓冲液(assaybuffer)(kit：试剂盒)处理细胞后，在1000xg中离心分离5分钟，获得了ALP活性检测所需的样品。

利用ALP将对硝基苯酚磷酸盐(p-nitrophenylphosphate)分解为对硝基苯酚(p-nitrophenol)和磷酸盐(phosphate)，并且利用405nm处的吸光度的变化，检测了ALP活性。蛋白质的浓度使用了BioRad(伯乐，品牌名称)蛋白质分析试剂盒。ALP活性用PNPuM/min/mgprotein表示。

3.2、使用五指那藤叶热水提取物的成骨细胞的ALP活性检测

将通过五指那藤叶热水提取以及组分获得步骤获得的五指那藤叶热水提取物分别按照不同的浓度、即用10ug/ml、50ug/ml的热水提取物处理成骨样细胞(C2C12细胞)，培养四天后，检测对成骨细胞的ALP活性的影响，并在图2中用图表表示出了其结果。如图2所示，同时用BMP-2和五指那藤叶热水提取物(10、50ug/ml)处理的实验组，相对于用BMP-2处理的对照组，观察到以浓度依存性的方式ALP活性增加。

另外，单独用五指那藤叶热水提取物(10、50ug/ml)处理的情况，相对于没有用BMP-2处理的正常组，观察到以浓度依存性的方式ALP活性增加。ALP是通过成骨细胞的分化以及活性的增加而释放的酶，这样的ALP活性增加与成骨细胞活性以及增加直接相关，因此这些结果证明，通过五指那藤叶热水提取物的ALP活性的增加直接证明通过成骨细胞的分化以及活性增加带来的骨形成促进效果。

4、使用五指那藤叶热水提取物的乙酸乙酯组分的成骨细胞的AP以及ALP的活性检测

图3是表示五指那藤叶热水提取物乙酸乙酯组分对ALP活性的影响的图表。

4.1、使用五指那藤叶热水提取物的乙酸乙酯组分的成骨细胞的AP活性检测

成骨细胞具有ALP活性，因此检测了先前获得的五指那藤叶热水提取物的乙酸乙酯组分在成骨细胞中对ALP活性的影响。具体地，将作为成骨样细胞的C2C12细胞分到48孔板中，使其成为5×10⁴细胞/孔板，在作为细胞成长培养基而含有10％的FBS、0.1％的p/s的α-MEM培养基中培养细胞三天。

三天后，为了诱导成骨细胞分化，更换为含有1％的马血清(horseserum)、0.1％的p/s的α-MEM培养基。之后，用10ng/ml的骨形态生成蛋白-2(BMP-2：bonemorphogenicprotein-2)进行处理后，分别以不同浓度(5、10ug/ml)同时对五指那藤叶热水提取物的丁醇组分的HP-20柱(column)渗出物HP20-2进行处理后培养四天。接着，用含有0.01％的TritonX的AP检测缓冲液(assaybuffer)(kit：试剂盒)进行处理后，在1000xg中离心分离5分钟，获得了ALP活性检测所需的样品。

利用ALP将对硝基苯酚磷酸盐(p-nitrophenylphosphate)分解为对硝基苯酚(p-nitrophenol)和磷酸盐(phosphate)，并利用405nm处的吸光度的变化，检测了ALP活性。蛋白质的浓度使用了BioRad(伯乐，品牌名称)蛋白质分析试剂盒。ALP活性用PNPuM/min/mgprotein表示。

4.2、使用五指那藤叶热水提取物的乙酸乙酯组分的成骨细胞的AP活性检测

五指那藤叶热水提取物的乙酸乙酯组分分别按照不同浓度、即用5ug/ml、10ug/ml的五指那藤叶热水提取物的乙酸乙酯组分处理成骨样细胞(C2C12cell)，培养四天后，检测了对成骨细胞的ALP活性的影响，并在图3中用图表表示其结果。

如图3所示，同时用BMP-2和五指那藤叶热水提取物的乙酸乙酯组分(5、10ug/ml)处理的实验组的情况，相对于用BMP-2处理的对照组，观察到以浓度依存性的方式ALP活性增加。另外，观察到，单独用五指那藤叶热水提取物的乙酸乙酯组分(5、10ug/ml)处理的情况，相对于没有用BMP-2处理的正常组，以浓度依存性的方式ALP活性增加。

ALP是通过成骨细胞的分化以及活性增加而释放的酶，这样的ALP活性增加与成骨细胞活性以及增加直接相关，因此，通过本发明的五指那藤叶热水提取物的乙酸乙酯的ALP活性增加直接证明通过成骨细胞的分化以及活性增加带来的骨形成促进效果。

4.3、使用五指那藤叶热水提取物的乙酸乙酯组分的成骨细胞的AP活性(activity)染色

将作为成骨样细胞的C2C12细胞分到48孔板中，使其成为5×10⁴细胞/孔板，在作为细胞成长培养基而含有10％的FBS、0.1％的p/s的α-MEM培养基中培养细胞三天。三天后，为了诱导成骨细胞分化，更换为含有1％的马血清、0.1％的p/s的α-MEM培养基。之后，用10ng/ml的骨形态生成蛋白-2(BMP-2：bonemorphogenicprotein-2)进行处理，对样品以不同浓度同时进行处理后培养四天。

在本发明中分为用作为成骨细胞分化诱导因子的BMP-2(10ng/ml)处理的阳性对照组、单独用五指那藤叶热水提取物的乙酸乙酯组分(5,10ug/ml)处理的实验组、没有任何处理的正常组，通过利用NBT/BCIP基质的AP活性部位染色，分别检测了成骨细胞分化(osteoblastdifferentiation)程度。

具体地，去除完成四天培养的细胞的培养液，用1xPBS洗涤三次细胞(cell)。用10％的甲醛溶液，在室温下固定细胞15分钟，用1xPBS洗涤三次细胞，去除残留的甲醛。用1x碱性磷酸酶(alkalinephosphaste)溶液再次洗涤细胞(cell)后，用NBT/BCIP基质溶液，对AP活性部位进行了染色。

图4是表示五指那藤叶热水提取物、五指那藤叶热水提取物的乙酸乙酯组分的ALP活性染色结果的图表。如图4所示，实验结果确认到，只用BMP-2处理的阳性对照组的情况，相对于没有用BMP-2处理样品的正常组，通过NBT/BCIP的细胞染色更多。

单独用五指那藤叶热水提取物的乙酸乙酯组分(5、10ug/ml)处理的实验组的情况，相对于没有用BMP-2处理样品的正常组，确认到通过NBT/BCIP的细胞染色更多。

ALP是通过成骨细胞的分化以及活性增加而释放的酶，这样的ALP的活性增加与成骨细胞活性以及增加直接相关，因此可以说，通过本发明的五指那藤叶热水提取物的乙酸乙酯组分的ALP活性的增加直接证明通过成骨细胞的分化以及活性增加带来的骨形成促进效果。

5、含有五指那藤叶粗提取物作为有效成分的骨和软骨组织生成促进用药物组合物以及牙周炎或骨质疏松症预防治疗剂

利用骨或软骨组织生成促进用药物组合物的牙周炎、骨质疏松症预防或治疗剂含有0.01重量％至99.9重量％的所述组合物，可制备成粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊、悬浮液、乳液、糖浆、喷雾剂、膏药、栓剂或灭菌注射用液等剂型。

灭菌注射液的情况，可以含有0.01重量％至99.9重量％的所述药物组合物，并且混合99.9重量％至0.01重量％的纯净水或葡萄糖而制备。胶囊的情况，所述药物组合物冷冻干燥后可以含有0.01重量％至99.9重量％，并且混合维生素、钙剂99.9重量％至0.01重量％而制备。

所述制得的药物组合物的每日剂量为，所述提取物以每kg的体重提供10至1000mg/kg的含量。

另外，可制备含有0.01重量％至99.9重量％的所述药物组合物的牙周炎或骨质疏松症改善、预防用功能性保健食品。

工业上的利用

经确认本发明的五指那藤叶热水提取物、五指那藤叶热水提取物的乙酸乙酯组分具有通过促进成骨细胞ALP活性以及成骨细胞分化来促进骨或软骨组织生成的效果，因此，含有五指那藤叶提取物作为有效成分的药物组合物，可以用作用于治疗或预防牙周炎或骨质疏松症的牙周炎或骨质疏松症治疗剂，通过用自然中生长的植物来替代制备原料，从而能够节约制造生产成本，通过工业化，可期待代替进口以及出口效果。